轉基因玉米安全性評價方法

專利名稱：轉基因玉米安全性評價方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及轉基因玉米安全性評價方法。
背景技術：
轉基因食品在人體內是否具有基因損害效應，是人們對其安全性產生懷疑的主要 原因。經遺傳工程修飾的基因片段導入后，引發下游基因轉錄效應，可能致使其最終產物 含有新的成分或改變現有成分的含量；調控基因(啟動子，終止子)轉移效應的潛在風險， 如轉基因大豆35S啟動子可能會通過基因的水平轉移插入到某一致癌基因上游，活化并導 致癌癥的發生。當轉入多個基因片段進入生物體時，發生非預期效應的概率可能會比較高。 以目前的技術研究尚不能完全掌握這些非預期的未知有害因素，轉基因食品與現存食品僅 僅在化學上的相似性并不足以證明它對人類消費是安全的，而應更深入地對其進行細胞毒 性、遺傳毒性等相關方面的實驗，以提供更有說服力的數據和結論。有關轉基因食品是否對 人體健康造成危害的爭議日趨激烈，引起世界公眾的關注。隨著我國生物技術不斷發展和 我國對轉基因食品的進口量不斷增加，對其進行安全性評價和科學的安全管理是十分必要 的。目前國內外對轉基因玉米所做安全性評價研究較少，主要集中在傳統毒理學方法 (動物試驗)方面，采用代謝物分析、毒代動力學、慢性毒性、亞慢性毒性、繁殖試驗和致畸 試驗等方法，在安全性評價的過程中，主要應用全食喂養，觀察對動物靶器官造成影響。但 整個過程耗時長、費用高，由于玉米市場價格波動頻繁，過長的檢查時間顯然不具有實用價 值，而且結果的準確性容易受諸多因素的影響，比如單一喂食導致營養不良、食物中其他 未知內含物、動物實驗結果外推到人存在種群間差異等。而傳統毒理學方法檢測層面仍停 留在組織、器官病理性改變層面，并未涉及細胞及基因層面。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種簡單易行、花費低、周期短、評價更為客觀 的轉基因玉米安全性評價方法。為此本發明采用以下技術方案它包括如下步驟(1)、提供人淋巴細胞、待測轉基因玉米的全蛋白、非轉基因玉米全蛋白、陽性誘變 劑；(2)、對人淋巴細胞分成各組進行孵育對人淋巴細胞與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育，對人淋巴細胞與非轉基因玉米全蛋白共同孵育，對人淋巴細胞與所述陽性誘變劑共同孵育，對人淋巴細胞與空白劑共同孵育；(3)、分別檢測與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞、與非轉基因玉米 全蛋白共同孵育的人淋巴細胞、與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴細胞、與空白劑共同 孵育的人淋巴細胞的細胞損傷程度及遺傳損傷程度，根據人淋巴細胞的細胞損傷程度及遺
4傳損傷程度判別所述待測轉基因玉米的安全性。在采用上述技術方案的基礎上，本發明還可同時采用或組合采用以下進一步的技 術方案檢測人淋巴細胞的細胞損傷程度的方法為CCK-8試驗和中性紅試驗，檢測人淋巴 細胞的遺傳損傷程度的方法為彗星試驗和微核試驗。所述陽性誘變劑選取阿霉素、長春新堿兩種；阿霉素用于模擬多通道DNA損傷，誘 使細胞出現多種類型DNA損傷；長春新堿用于模擬染色體損傷，誘使細胞出現染色體畸變、 姐妹染色單體交換損傷。在步驟(2)對人淋巴細胞與所述陽性誘變劑共同孵育中，對人淋巴細胞分成以下 2組進行孵育對人淋巴細胞與與阿霉素共同孵育和對人淋巴細胞與與長春新堿共同孵育；在步驟(3)中，與長春新堿共同孵育的人淋巴細胞用于CCK-8試驗、中性紅攝取試 驗和微核試驗的陽性對照，與阿霉素共同孵育的人淋巴細胞作為彗星試驗的陽性對照。待測轉基因玉米全蛋白的孵育終濃度為200、100、50、25、12. 5μ g/ml，并各分別孵 育1. 5h、6h、24h ；非轉基因玉米全蛋白的孵育終濃度為200、100、50、25、12· 5μ g/ml，并各 分別 1. 5h、6h、24h。在步驟(3)中，采用以下方法判定如與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴細胞和與空白劑共同孵育的人淋巴細胞 的細胞損傷程度及遺傳損傷程度無顯著差異，說明所選取試驗方法不能有效檢測陽性誘 變劑引起的細胞毒性及遺傳毒性損傷，則不進行與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋 巴細胞和與非轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞細胞損傷程度及遺傳損傷程度對 比；如與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴細胞和與空白劑共同孵育的人淋巴細胞 的細胞損傷程度有顯著差異，再比較與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞和與 非轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞細胞損傷程度，如無顯著差異，則判定待測轉 基因玉米與非轉基因玉米的細胞毒性相似，可安全食用；如細胞損傷程度存在顯著差異，則 認為待測轉基因玉米較非轉基因玉米更具有細胞毒性，食用存在不安全性；如與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴細胞和與空白劑共同孵育的人淋巴細胞 的遺傳損傷程度有顯著差異，再比較與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞和與 非轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞遺傳損傷程度，如無顯著差異，則判定待測轉 基因玉米與非轉基因玉米的遺傳毒性相似，可安全食用；如遺傳損傷程度存在顯著差異，則 認為待測轉基因玉米較非轉基因玉米更具有遺傳毒性，食用存在不安全性。顯著性檢驗的目的是確定樣本間的差異由于抽樣誤差所致的概率(P)大小，在統 計專業研究中，0. 05的P值通常被認為是可接受閾值水平。如果這一概率較大(P > 0. 05)， 通常認為不能排除樣本間的差異是由于抽樣誤差所致，即這兩個樣本均數(率或構成比) 是由兩個相同的總體中抽到(實際上是來自同一總體)，統計學稱之為差異無顯著性；這一 概率若很小(P < 0. 05，即小概率事件)，則認為兩個樣本均數(率或構成比)是從兩個本 質不同的總體中抽到，它們之間的差異屬于本質不同的差異，不是抽樣誤差所致，而是由于 其他因素所致，統計學稱之為差異有顯著性；本發明將P < 0. 05作為參與對比的兩組數據存在顯著性差異的閾值。當然，根據判定顯著差異的尺度不同，也可對所述閾值進行上下調
本發明中所述數據對比是指在同種試驗，同等實驗條件下在對比對象之間進行對 比，如彗星試驗中，對多個與空白劑共同孵育1.5h后的人淋巴細胞樣本所測得的多個尾 部DNA百分比數據與對多個與阿霉素共同孵育1. 5h后的人淋巴細胞樣本所測得的多個尾 部DNA百分比數據相比較，利用前段所述方法，判斷與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴 細胞和與空白劑共同孵育的人淋巴細胞的遺傳損傷程度是否有顯著差異。在本發明中所述空白劑可以選擇磷酸鹽緩沖液(PBS)或者生理鹽水。由于采用本發明的技術方案，本發明通過人淋巴細胞系傳代培養，將轉基因玉米 全蛋白提取物作用于人淋巴細胞，通過檢測人淋巴細胞損傷程度及遺傳損傷程度來評價其 安全性，評價方法周期短，費用低，簡便易行，檢測敏感度高，可用以系列型號轉基因玉米及 其相關衍生產物的安全性評價，具有實際的應用前景。本發明既可獨立評價轉基因玉米，亦可與其他檢驗方法結合，綜合評價轉基因玉 米安全性。進一步地，本發明采用CCK-8試驗、中性紅試驗、彗星試驗、微核試驗來檢測人淋 巴細胞的細胞損傷程度及遺傳損傷程度，可以對轉基因玉米細胞毒性和遺傳毒性進行綜合 評價，得到更客觀的結果。本發明在細胞毒性及遺傳毒性檢測方面各選取兩種不同檢測機理的試驗，其目的 在于提高檢測靈敏度及準確度。其中，CCK-8試驗主要通過評價細胞內脫氫酶的活力來檢測 細胞的存活率；中性紅試驗通過測量溶酶體染料的攝人來反映細胞的存活率；彗星試驗是 一種簡便、快速、靈敏、花費少的技術，適于評價細胞DNA損傷程度；微核試驗是一種快速、 簡便檢測染色體損傷的方法，可用于評價細胞染色體損傷程度。CCK-8試驗、中性紅試驗同 屬細胞毒性檢測試驗，但兩者的檢測機理不同，兩者有機結合，可有效提高檢測靈敏度和準 確度；彗星試驗、微核試驗同屬遺傳毒性檢測試驗，但由于不同的生物學檢測終點，兩者可 有效互補，提高檢測靈敏度和準確度。本發明中，所述陽性誘變劑選擇面較廣，多種抗癌藥物如甲氨蝶呤、博來霉素等均 有細胞損傷及遺傳損傷作用，但損傷作用較為單一。本發明優選阿霉素、長春新堿作為陽性誘變劑。阿霉素用于模擬多通道DNA損傷， 誘使細胞出現多種類型DNA損傷，導致細胞死亡；長春新堿用于模擬染色體損傷，誘使細胞 出現染色體畸變、姐妹染色單體交換損傷，導致細胞死亡。針對彗星試驗、微核試驗檢測細 胞生物學終點，這兩類陽性誘變劑損傷類型多樣化，將該兩種陽性誘變劑有機結合，能更為 理想地驗證本發明中試驗方法的靈敏度和準確度。此外，長春新堿誘使細胞出現染色體損 傷在細胞毒性方面要低于阿霉素直接引起的細胞DNA損傷。CCK-8試驗、中性紅試驗采用長 春新堿作為陽性誘變劑，也能更好地驗證檢測方法的靈敏度。
具體實施例方式以下以型號為CrylAb轉基因玉米為實例進一步解釋本發明，但實施例并不對本 發明做任何限定LCrylAb轉基因玉米全蛋白制備
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裂解提取1).取新鮮CrylAb轉基因玉米樣本。在液氮條件下，用研缽充分研磨成粉末。2).融解Western及IP細胞裂解液(適用于Western和免疫沉淀的細胞裂解液)， 混勻。取適當量的裂解液，在使用前數分鐘內加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使苯甲基磺酰氟的 最終濃度為ImM。3).取50mg樣品，按照每20毫克組織加入100-200微升裂解液的比例加入裂解 液。(如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當 減少裂解液的用量。)4).用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。5).充分裂解后，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清。注所有提取步驟均在4°C下進行。蛋白濃縮清洗1).將上清液放入密理博Microcon Ultra-O. 5 3000超濾管；再放入1. 5ml離心管。2). 14000g離心，棄離心管里濾液；3).往超濾管中加入450ul 4°C預冷的IX磷酸緩沖液(PBS)；4). 14000g離心，棄離心管里濾液；5).重復 3、4 步驟;6).換新的1.5ml離心管，倒置超濾管，IOOOg離心，收集蛋白。將提取的轉基因玉米全蛋白置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中溶解并超聲振蕩混勻。把 配置好的lmg/ml的原液置于零下80度低溫冰箱保存，用時現取。2、非轉基因玉米全蛋白制備可選取作為對照非轉基因玉米的品種范圍較廣，任何非轉基因玉米品種皆可以作 為對照樣本，如玉米“龍單38”;“綏玉10”;“海玉十號”;“鑫玨1號”等，但在種系上與所評 價的轉基因玉米一致或接近為好。本例采用“吉單27”玉米，其全蛋白制備的具體步驟同 上。保存方法同上。3、細胞暴露Iml人淋巴細胞(密度為50000細胞)懸液移入24孔培養板中37°C培養，使細胞 生長在培養板上。轉基因玉米全蛋白和非轉基因玉米全蛋白的暴露時間和濃度見表1。磷 酸鹽緩沖液(PBS)作為空白劑陰性對照，長春新堿作為CCK-8試驗、中性紅攝取試驗和微核 試驗的陽性對照，阿霉素作為彗星試驗(COMET)的陽性對照。所有試驗重復三次。表1在4種試驗中蛋白暴露濃度和暴露時間濃度(Mg/ml)
時間
權利要求
轉基因玉米安全性評價方法，其特征在于它包括如下步驟(1)、提供人淋巴細胞、待測轉基因玉米的全蛋白、非轉基因玉米全蛋白、陽性誘變劑；(2)、對人淋巴細胞分成各組進行孵育對人淋巴細胞與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育，對人淋巴細胞與非轉基因玉米全蛋白共同孵育，對人淋巴細胞與所述陽性誘變劑共同孵育，對人淋巴細胞與空白劑共同孵育；(3)、分別檢測與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞、與非轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞、與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴細胞、與空白劑共同孵育的人淋巴細胞的細胞損傷程度及遺傳損傷程度，根據人淋巴細胞的細胞損傷程度及遺傳損傷程度判別所述待測轉基因玉米的安全性。
2.如權利要求1所述的轉基因玉米安全性評價方法，其特征在于檢測人淋巴細胞的細 胞損傷程度的方法為CCK-8試驗和中性紅試驗，檢測人淋巴細胞的遺傳損傷程度的方法為 彗星試驗和微核試驗。
3.如權利要求2所述的轉基因玉米安全性評價方法，其特征在于所述陽性誘變劑選取 阿霉素、長春新堿兩種；在步驟(2)對人淋巴細胞與所述陽性誘變劑共同孵育中，對人淋巴細胞分成以下2組 進行孵育對人淋巴細胞與與阿霉素共同孵育和對人淋巴細胞與與長春新堿共同孵育；在步驟(3)中，與長春新堿共同孵育的人淋巴細胞用于CCK-8試驗、中性紅攝取試驗和 微核試驗的陽性對照，與阿霉素共同孵育的人淋巴細胞用于彗星試驗的陽性對照。
4.如權利要求1所述的轉基因玉米安全性評價方法，其特征在于待測轉基因玉米全蛋 白的孵育終濃度為200、100、50、25、12· 5 μ g/ml,并各分別孵育1. 5h、6h、24h ；非轉基因玉 米全蛋白的孵育終濃度為200、100、50、25、12. 5μ g/ml，并各分別1. 5h、6h、24h。
5.如權利要求1、2、3或4所述的轉基因玉米安全性評價方法，其特征在于在步驟(3) 中采用以下方法判定如與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴細胞和與空白劑共同孵育的人淋巴細胞的細 胞損傷程度及遺傳損傷程度無顯著差異，說明所選取試驗方法不能有效檢測陽性誘變劑引 起的細胞毒性及遺傳毒性損傷，則不進行與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞 和與非轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞細胞損傷程度及遺傳損傷程度對比；如與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴細胞和與空白劑共同孵育的人淋巴細胞的細 胞損傷程度有顯著差異，再比較與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞和與非轉 基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞細胞損傷程度，如無顯著差異，則判定待測轉基因 玉米與非轉基因玉米的細胞毒性相似，可安全食用；如細胞損傷程度存在顯著差異，則認為 待測轉基因玉米較非轉基因玉米更具有細胞毒性，食用存在不安全性；如與所述陽性誘變劑共同孵育的人淋巴細胞和與空白劑共同孵育的人淋巴細胞的遺 傳損傷程度有顯著差異，再比較與待測轉基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞和與非轉 基因玉米全蛋白共同孵育的人淋巴細胞遺傳損傷程度，如無顯著差異，則判定待測轉基因 玉米與非轉基因玉米的遺傳毒性相似，可安全食用；如遺傳損傷程度存在顯著差異，則認為待測轉基因玉米較非轉基因玉米更具有遺傳毒性，食用存在不安全性。
全文摘要
本發明公開了一種轉基因玉米安全性評價方法，該方法通過人淋巴細胞系傳代培養，將轉基因玉米全蛋白提取物作用于人淋巴細胞，通過檢測人淋巴細胞損傷程度及遺傳損傷程度來評價其安全性，評價方法周期短，費用低，簡便易行，檢測敏感度高、準確，可用以系列型號轉基因玉米及其相關衍生產物的安全性評價，具有實際的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101948924SQ20101029607
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月29日 優先權日2010年9月29日
發明者呂沁風, 吳忠華, 李 禾, 鄭偉, 陳吳建 申請人:浙江國際旅行衛生保健中心