轉基因玉米98140結構特異定量pcr精準檢測的引物和探針及方法
【專利摘要】本發明屬于生物【技術領域】，涉及基因的定量分析方法，具體是指轉基因玉米98140結構特異定量PCR精準檢測方法。本發明采用設計的特異性上游引物序列、下游引物序列、熒光探針序列、98140品系的DNA稀釋液以及TaqmanMastermix（2×）和水配制成PCR反應體系，進行定量PCR檢測。本發明主要建立了一種高擴增效率、高準確度的Taqman定量PCR檢測技術，適用于國內農業轉基因生物及產品監督檢驗、進出境口岸轉基因生物及產品檢驗、企業內部進口原材料含轉基因98140構建結構的生物成分檢測。
【專利說明】轉基因玉米98140結構特異定量PCR精準檢測的引物和探針及方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及基因的定量的分析方法。
【背景技術】
[0002]國際上很多國家對轉基因產品實施限量標識和進口，而我國尚無具體的轉基因產品標識閾值。為了打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘，同時彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系，更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，建立一種新型轉基因玉米98140結構特異定量PCR精準檢測方法已成為必要。
[0003]目前關于轉基因玉米98140的檢測技術，主要集中在普通定性PCR分析方法和標準，尚無關于檢測轉基因玉米98140及產品的結構特異性某特定位點(基因序列)的定量PCR精準檢測技術。
【發明內容】
[0004]本發明的目的主要是提供一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米98140及產品的結構特異性某特定位點的定量PCR精準檢測技術。
[0005]本發明通過下述技術方案實現:
轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測的引物和探針:
上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’ ；
下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’ ；
熒光探針序列，zm-P:5’-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’。實現對 pin II 終止子與zm-hra gene相連位置核酸片段的檢測。
[0006]轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測的引物和探針:
上游引物序列，gat-F:5’ -TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3’ ；
下游引物序列，gat-R:5’ -CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3’ ；
熒光探針序列，gat-P:5’ -FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3’。實現對Gate4621gene與pin II終止子相接處核酸片段的檢測。
[0007]上述轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測方法，包括以下步驟:當檢測pin II終止子與zm-hra gene相連位置核酸片段時,具體步驟如下:
(al)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’
下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’
熒光探針序列，zm-P:5’ -FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’ ；
(a2)制備98140品系的DNA稀釋液；
(a3)配制PCR反應體系；
(a4)定量PCR檢測。
[0008]當檢測Gate4621gene與pin II終止子相接處核酸片段時,具體步驟如下:
(bl)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，gat-F:5’ -TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3’
下游引物序列，gat-R:5’ -CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3’
熒光探針序列，gat-P:5’ -FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3’ ；
(b2)制備98140品系的DNA稀釋液；
(b3)配制PCR反應體系；
(b4)定量PCR檢測。
[0009]進一步地,步驟(al)和(bl)中合成的引物及突光探針的濃度均為10Mmol/l,步驟(a2)和(b2)中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
[0010]再進一步地，步驟(a3)和(b3)中所述的配制PCR反應體系，即將DNA稀釋液加入到2θμL反應體系中，所述2θμL的反應體系包括以下組分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物 ιμL
下游引物ιμL
熒光探針0.5μ1
DNA稀釋液3.ΟμL
50 ROX0.4μ1
水4.?μL。
[0011]另外，所述PCR反應條件為:95°C預變性10min，l個循環；95°C變性15s，57°C退火60s, 45個循環。
[0012]本發明具有以下優點及有益效果:
(1)本發明打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘；
(2)本發明彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系；
(3)本發明提供的檢測技術可更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權；
(4)本發明擴增效率高、準確度高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為本發明-實施例1對非目標轉化體的轉基因作物和非轉基因作物的檢測結果圖。
[0014]圖2為本發明-實施例2對非目標轉化體的轉基因作物和非轉基因作物的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但本發明的實施方式并不限于此。
[0016]實施例1
轉基因玉米98140結構特異定量PCR精準檢測方法，在檢測pin II終止子與zm-hragene相連位置核酸片段時，步驟如下:
(al)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’
下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’
熒光探針序列，zm-P:5’ -FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’。
[0017]本實施例引物及熒光探針的合成濃度均為10Mmol/l。
[0018]以上引物和熒光探針的核苷酸序列是針對轉基因玉米98140及產品的構建結構中pinll終止子與zm-hra gene相連位點的特定位點設計；通過該設計就可以精準檢測轉基因玉米中98140的結構特異片段。
[0019](2)制備98140品系的DNA稀釋液；即采用常規的DNA提取手段，從轉基因玉米98140中提取出濃度為50ng/^l的DNA稀釋液。
[0020](3)配制PCR反應體系；即將制備好的DNA稀釋液加入20μ1反應體系中即可。
[0021]以上20μ1反應體系包括以下組分:
Taqman Master mix (2X )10M-1
上游引物ιμL
下游引物ιμL
熒光探針0.5μ1
DNA稀釋液3.ΟμL
50 ROX0.4μ1
水4.?μL。
[0022](4)定量 PCR 檢測。
[0023]根據上述PCR反應體系，在以下PCR反應條件下對產物進行擴增并檢測，所述PCR反應條件為:95°C預變性10min，l個循環；95°C變性15s，57°C退火60s，45個循環。本實施例中采用的是ABI公司生產的7500型熒光定量PCR儀器。
[0024]采用本發明的方法對非轉基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15個其他玉米轉化體，5個水稻轉化體，5個大豆轉化體，3個棉花轉化體，3個油菜轉化體和I個甜菜轉化體進行特異性檢測，檢測結果如圖1所示，從圖1可看出本發明設計的引物和探針對以上非轉基因作物及除98140玉米外的其他轉基因轉化體均沒有非特異擴增，另外圖1中Δ Rn代表熒光原始信號減去背景信號的值。
[0025]同時，采用本發明的方法對0.5%的轉基因玉米98140結構特性片段進行定量檢測，連續重復做15個平行樣品的檢測，數據見表1。
[0026]表1
【權利要求】
1.轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測的引物和探針，其特征在于， 用于檢測pin II終止子與zm-hra gene相連位置的引物和探針如下: 上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’ ； 下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’ ； 熒光探針序列，zm-P:5’ -FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’ ； 用于檢測Gate4621gene與pin II終止子相接處的引物和探針如下: 上游引物序列，gat-F:5’ -TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3’ ； 下游引物序列，gat-R:5’ -CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3’ ； 熒光探針序列，gat-P:5’ -FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3’。
2.轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測方法，其特征在于，包括以下步驟:檢測pin II終止子與zm-hra gene相連位置: (al)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，
上游引物序列，zm-F:5’ -TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3’ 下游引物序列，zm-R:5’ -TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3’ 熒光探針序列，zm-P:5’ -FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3’ ； (a2)制備98140品系的DNA稀釋液； (a3)配制PCR反應體系； (a4)定量PCR檢測。
3.根據權利要求2所述的轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測方法，其特征在于，檢測Gate4621gene與pin II終止子相接處: (bl)合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針， 上游引物序列，gat-F:5’ -TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3’ 下游引物序列，gat-R:5’ -CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3’ 熒光探針序列，gat-P:5’ -FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3’ ； (b2)制備98140品系的DNA稀釋液； (b3)配制PCR反應體系； (b4)定量PCR檢測。
4.根據權利要求3所述的轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(al)和(bl)中合成的引物及熒光探針的濃度均為lOMfflol/l，步驟(a2)和(b2)中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/^l。
5.根據權利要求4所述的轉基因玉米98140結構特異定量PCR精準檢測方法，其特征在于，步驟(a3)和(b3)中所述的配制PCR反應體系，即將DNA稀釋液加入到20μ1反應體系中，所述2θμL的反應體系包括以下組分: Taqman Master mix (2X )10M-1上游引物1μL下游引物1μL 熒光探針0.5μ1 DNA稀釋液3.0μL .50 ROX0.4μ1水4.?μL。
6.根據權利要求3或5所述的轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測方法，其特征在于，所述PCR反應條件為:95°C預變性10min，l個循環；95°C變性15s，57°C退火60s, 4 5個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131106SQ201410394511
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月12日 優先權日:2014年8月12日
【發明者】張富麗, 宋君, 尹全, 常麗娟, 劉文娟, 王東, 雷紹榮 申請人:四川省農業科學院分析測試中心