專利名稱：重組慢病毒及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組慢病毒及其制備方法和應用，特別涉及一種攜帶人端粒酶逆 轉錄酶hTERT基因的重組慢病毒及其制備方法和在人細胞永生化中的應用。
背景技術：
端粒(telomere)位于染色體末端，是由串聯重復的短雙鏈DNA序列和結合蛋白形 成的復合體。端粒保護著染色體末端，使之區別于一般的斷裂染色體末端而不被各種酶降 解，在維持基因組完整性和功能穩定性方面有著重要作用。細胞分裂時，DNA信息通過復制 傳遞給子代細胞，由于染色體末端不能被復制，端粒在細胞增殖過程中長度會逐漸變短，當 端粒變得太短，DNA片段在復制時會遭受破壞，阻止細胞繼續增殖。很多科學家猜測，端粒 變短可能是生物體老化的原因之一。研究發現，細胞中的一種特殊逆轉錄酶——端粒酶，能夠修補DNA復制的缺陷，使 端粒不會因細胞分裂而有所損耗，進而增加細胞分裂的次數。人端粒酶由RNA亞基和至少 兩個蛋白亞基組成，即端粒酶相關蛋白1 (Telomerase associated protein, TEP1)和人 端粒酶逆轉錄酶(human telomerasereverse transcriptase，hTERT)。端粒酶的活性可以 通過調控端粒酶的RNA成分和/或蛋白質成分來實現，其中hTERT作為催化亞基，作用最為 重要。端粒酶的催化亞基以端粒酶自己的RNA亞基為模板，通過轉位不斷重復復制出端粒 DNA，補償在染色體復制過程中的末端隱縮，保證染色體的完全復制。細胞中的端粒酶越活 躍，端粒的長度就越能維持。在造血干細胞、生殖細胞和大多數腫瘤細胞中，端粒酶逆轉錄 酶呈高表達；而在正常的人體細胞中呈不表達或低表達。目前普遍認為，表達端粒酶逆轉錄 酶，有助于保持細胞內端粒酶活性，可以使多種類型細胞永生化。哺乳動物細胞表達外源基因可采用質粒轉染或病毒載體感染的方法。利用質粒 轉染獲得穩定的轉基因細胞需幾周甚至幾個月時間；而利用病毒表達系統則可快速感染細 胞，將外源基因整合到病毒載體中僅需要幾天時間，病毒載體再以病毒顆粒的方式，通過病 毒包膜蛋白與宿主細胞膜的相互作用使外源基因進入到細胞內。常用的病毒載體有逆轉錄 病毒載體、腺病毒載體和慢病毒載體等。慢病毒載體與其它表達載體相比，最大的優勢是能 夠感染分裂和非分裂細胞，將外源基因有效地整合到宿主細胞染色體上，從而實現持久性 表達，可以感染干細胞、神經元細胞、心肌細胞、內皮細胞、腫瘤細胞等多種類型的細胞。
發明內容
本發明的目的在于提供一種重組慢病毒，其攜帶人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因作 為外源基因。本發明的又一目的在于提供上述重組慢病毒的一種制備方法。本發明的再一目的在于將上述重組慢病毒應用于人細胞永生化。本發明提供一種重組慢病毒，其含有人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因、cPPT元件和 WPRE元件。
其中，所述重組慢病毒由四質粒系統形成，這四種質粒包括包裝質粒pLPl、包裝 質粒pLP2、包膜質粒pLP/VSVG和載體質粒，所述載體質粒攜帶hTERT基因并至少含有WPRE 元件和cPPT元件。其中，所述載體質粒還攜帶殺稻瘟菌素篩選基因Blasticidin。其中，所述載體質粒由克隆載體pENTR221-hTERT和慢病毒表達載體pLenti6. 3/ V5-DEST經由LR反應生成。本發明還提供上述重組慢病毒的一種制備方法，包括步驟一、構建人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因重組慢病毒表達載體將hTERT基因定 向連接至慢病毒表達載體質粒，從而獲得重組質粒pLenti6. 3/V5-hTERT ；步驟二、采用四質粒系統包裝攜帶hTERT基因的重組慢病毒采用脂質體轉染法， 將攜帶hTERT基因的慢病毒表達質粒pLenti6. 3/V5_hTERT與包裝質粒混合物pLPl、pLP2 和pLP/VSVG共轉染至細胞，包裝攜帶hTERT基因的重組慢病毒。本發明還包括將上述重組慢病毒應用于人細胞永生化中，可以感染干細胞、神經 元細胞、心肌細胞、內皮細胞、腫瘤細胞等多種類型的細胞。通過構建攜帶人端粒酶逆轉錄 酶hTERT基因的重組慢病毒載體，利用慢病毒系統感染目的細胞，將hTERT基因整合至目的 細胞染色體，增強細胞內端粒酶逆轉錄酶的表達，對于實現多種類型細胞的永生化具有重 要作用。本發明采用λ噬菌體位點特異重組系統將hTERT基因構建至含有cPPT和WPRE 元件的慢病毒表達載體質粒，并將所得到重組質粒命名為pLenti6. 3/V5_hTERT，將該重組 載體質粒與病毒包裝質粒混合物共轉染人胚腎細胞，收集細胞培養上清液，經過病 毒濃縮、PCR擴增檢測、重組慢病毒對HeLa細胞的感染性能檢測和hTERT基因在HeLa細胞 中的表達檢測，最終在細胞中成功包裝出攜帶hTERT基因的重組慢病毒。本發明提 供的重組慢病毒對于實現多種類型細胞永生化具有重要作用。本發明所涉及的重組慢病毒由四質粒系統形成，這四種質粒包括pLPl、pLP2、 pLP/VSVG和pLenti6. 3/V5_hTERT。pLPl質粒表達形成慢病毒結構所必需的gag基因以及 病毒復制和整合必需的pol基因；pLP2質粒表達Rev蛋白，它能與pLPl上的反應元件(PRE) 共同作用誘導feg/Pol表達，并指導病毒RNA的核運輸；pLP/VSVG表達水泡炎病毒G糖蛋白 (VSV-G)，使宿主范圍更廣；攜帶hTERT基因的重組質粒pLenti6. 3/V5_hTERT，含有WPRE、 cPPT元件和殺稻瘟菌素篩選基因Blasticidin，同時提供Ψ包裝信號以及PRSV/5，LTR和 AU3/3’ LTR，便于病毒包裝。這四個質粒必須共同作用，才能產生有感染能力的病毒顆粒。本發明所涉及的慢病毒表達系統擁有多個關鍵的內置安全特性，包括以反式方 式提供HIV的包裝功能，避免非預期的重組；在慢病毒包裝混合物(pLPl、pLP2、pLP/VSVG) 中不含LTR，所以包裝載體不會包裝成病毒顆粒；系統中產生的病毒顆粒不能復制，只能用 來裝載目的基因，不會產生其他的病毒顆粒；慢病毒載體經過修飾，已被自滅活，當轉染和 整合后不能再產生可包裝的病毒基因組。本發明所構建的重組慢病毒表達載體質粒pLenti6. 3/V5_hTERT來源于慢病毒 表達載體 pLenti6. 3/V5-DEST，與具有類似功能的 pLenti6/V5_DEST 相比，pLenti6. 3/ V5-DEST增加了兩個新元件——WPRE和cPPT。WPRE來自土撥鼠肝炎病毒，能加強轉基因的 表達；cPPT來自HIV-I整合酶基因，能增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數。這兩個元件共同作用，能使大多數細胞中的蛋白表達量至少增加4倍。因此，本發明所提供的重組慢病毒 更有利于目的基因整合至宿主細胞染色體。綜上，本發明提供了一種攜帶人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因的重組慢病毒及其制 備方法和應用，所提供的重組慢病毒更有利于目的基因整合至宿主細胞染色體，宿主范圍 更廣，擁有多個關鍵的內置安全特性，對于實現多種類型細胞永生化具有重要作用。
下面結合附圖，通過對本發明的具體實施方式
詳細描述，將使本發明的技術方案 及其他有益效果顯而易見。附圖中，圖1所示為pENTR221_hTERT克隆載體(購自hvitrogen公司)，其內含有hTERT
基因；圖2所示為pLenti6. 3/V5-DEST表達載體(購自Invitrogen公司)，其內含有 WPRE、cPPT元件和殺稻瘟菌素篩選基因Blasticidin ；圖3所示為重組慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5_hTERT構建過程圖；圖 4 所示為質粒 pENTR221-hTERT 和 pLenti6. 3/V5_hTERT 的 EcoR I 和 BamH I 單 酶切電泳圖；圖 5 所示為質粒 pENTR221-hTERT 和 pLenti6. 3/V5_hTERT 的 I3St I 和 Apa I 單酶 切電泳圖；圖6所示為重組慢病毒顆粒基因組DNA的hTERT基因PCR鑒定電泳圖；圖7為重組慢病毒感染HeLa細胞經殺稻瘟菌素篩選的顯微照相圖(100X)；圖8為hTERT基因在HeLa細胞表達的RT-PCR檢測電泳圖。
具體實施例方式
在本發明的一較佳實施例中，通過如下步驟制備了含有人端粒酶逆轉錄酶hTERT 基因、cPPT元件和WPRE元件的重組慢病毒。一、人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因重組慢病毒表達載體的構建1、hTERT基因定向連接至慢病毒表達載體質粒從hvitrogen公司購得含有hTERT基因的克隆載體pENTR221_hTERT (質粒圖譜 見圖1)和慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST(質粒圖譜見圖2)。質粒pENTR 221-hTERT 攜帶attLl和attL2位點，位于hTERT基因序列兩端；質粒pLenti6. 3/V5-DEST攜帶attRl 和attR2位點，位于細胞死亡控制基因ccdB序列兩端。采用LR反應，使pLenti6. 3/V5-DEST 上的attRl和attR2序列與pENTR221_hTERT上的attLl和attL2序列發生同源重組，細胞 死亡控制基因ccdB被目的基因hTERT所取代，可獲得重組質粒，并將其命名為pLenti6. 3/ V5-hTERT。該質粒的構建流程圖如圖3所示。具體實施步驟如下室溫下向1. 5ml離心管中加入以下成分1μ 1 pENTR221_hTERT (360ng/μ 1)， 1 μ 1 pLenti6. 3/V5-DEST(150ng/μ 1), 6 μ 1 TE buffer(ρΗ 8.0)，2 μ 1 LRClonase II enzyme mix (購自hvitrogen公司)，用移液器混合均勻；25°C孵育1 2h ；然后加入1 μ 1 Proteinase K溶液終止反應，瞬時渦旋，37°C孵育樣品lOmin。將2 3 μ 1上述反應混合物轉化大腸桿菌Stbl3細胞(購自hvitrogen公司)，在含有Amp抗生素的LB固體培養基 上篩選陽性克隆。2、重組質粒的酶切鑒定質粒pENTR221-hTERT 全長 5943bp，重組質粒 pLenti6. 3/V5_hTERT 全長 11131bp，
兩種質粒經不同限制性內切酶作用后預計形成的DNA片段如下
權利要求
1.一種重組慢病毒，其特征在于含有人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因、CPPT元件和WPRE 元件。
2.根據權利要求1所述的重組慢病毒，其特征在于，所述重組慢病毒由四質粒系統形 成，這四種質粒包括包裝質粒PLP1、包裝質粒pLP2、包膜質粒pLP/VSVG和載體質粒，所述 載體質粒攜帶hTERT基因并至少含有WPRE元件和cPPT元件。
3.根據權利要求2所述的重組慢病毒，其特征在于，所述載體質粒還攜帶殺稻瘟菌素 篩選基因Blasticidin。
4.根據權利要求3所述的重組慢病毒，其特征在于，所述載體質粒由克隆載體 pENTR221-hTERT和慢病毒表達載體pLenti6. 3/V5-DEST經由LR反應生成。
5.如權利要求1所述的重組慢病毒的制備方法，其特征在于，包括步驟一、構建人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因重組慢病毒表達載體將hTERT基因定向連 接至慢病毒表達載體質粒，從而獲得重組質粒pLenti6. 3/V5-hTERT ；步驟二、采用四質粒系統包裝攜帶hTERT基因的重組慢病毒采用脂質體轉染法，將 攜帶hTERT基因的慢病毒表達質粒pLenti6. 3/V5_hTERT與包裝質粒混合物pLPl、pLP2和 pLP/VSVG共轉染至細胞，包裝攜帶hTERT基因的重組慢病毒。
6.如權利要求1所述的重組慢病毒在人細胞永生化中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種重組慢病毒及其制備方法和應用，該重組慢病毒含有人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因、cPPT元件和WPRE元件，由四質粒系統包裝形成，這四種質粒包括包裝質粒pLP1、包裝質粒pLP2、包膜質粒pLP/VSVG和載體質粒。該重組慢病毒的制備方法，包括構建人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因重組慢病毒表達載體；采用四質粒系統包裝攜帶hTERT基因的重組慢病毒。該重組慢病毒可應用于人細胞永生化。本發明提供了一種攜帶人端粒酶逆轉錄酶hTERT基因的重組慢病毒及其制備方法和應用，所提供的重組慢病毒更有利于目的基因整合至宿主細胞染色體，宿主范圍更廣，擁有多個關鍵的內置安全特性，對于實現多種類型細胞永生化具有重要作用。
文檔編號C12N7/01GK102140442SQ20101916402
公開日2011年8月3日 申請日期2010年2月1日 優先權日2010年2月1日
發明者于潔, 尹美珺, 高書穎 申請人:北京大學深圳醫院