使用弧菌屬細菌產生l-賴氨酸的方法

專利名稱：使用弧菌屬細菌產生l-賴氨酸的方法
技術領域：
本發明涉及使用弧菌屬細菌產生L-賴氨酸的方法。L-賴氨酸作為動物飼料的添加劑、健康食品的成分以及氨基酸輸液等是產業上有用的L-氨基酸。
背景技術：
L-賴氨酸是使用屬于短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬 (Corynebacterium)等的棒狀桿菌型細菌，屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏菌屬 (Escherichia)、鏈霉菌屬(Str印tomyces)、甲基桿菌屬(Methylobacillus)等的細菌，或屬于青霉屬(Penicillium)等的絲狀真菌通過發酵生產的。作為使用微生物通過發酵產生L-賴氨酸的方法，有使用源自野生型株的營養缺陷型的方法，使用源自野生型株的代謝調節突變株作為對多種藥物中任一種有抗性的株的方法，和使用具有營養缺陷型和代謝調節突變體兩者特性的株的方法等。此外，通過使用重組DNA技術，可培育能夠高效率地產生L-賴氨酸的微生物(專利文獻1至4)。雖然通過這樣的微生物培育和如上所述的產生方法的改進已極大地提高L-氨基酸的生產力(productivity)，但為了響應將來需要的進一步增加，需要開發更加廉價且高效的L-賴氨酸生產方法。基于直接發酵的L-氨基酸生產方法具有如下問題由于培養基中L-氨基酸的蓄積導致的滲透壓上升，降低了微生物的活性(action)，由此無法長時間保持生產力。作為解決此問題的方法，已公開了使用弧菌屬細菌通過直接發酵產生L-氨基酸如L-賴氨酸的方法(專利文獻5)。作為可減少培養基中蓄積的L-賴氨酸的分解的L-賴氨酸的生產方法，已知使用 L-賴氨酸分解能力降低的微生物，特別是屬于埃希氏菌屬的、其中缺失cadA基因或IdcC基因或其產物的表達量或酶活性降低的微生物的方法(非專利文獻1，專利文獻4)。已知在弧菌屬細菌當中的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)及創傷弧菌(Vibrio vuiniticus)中存在cadA同源基因(非專利文獻 2至4)。然而，并不知道在這些弧菌屬細菌中是否可通過破壞這樣的cadA同源基因來減弱或缺失L-賴氨酸分解能力。而且，并不知道在弧菌屬細菌中是否存在除與cadA同源基因產物相關的L-賴氨酸分解途徑之外的L-賴氨酸分解途徑。現有技術文獻專利文獻專利文獻1歐州專利申請公開0857784號說明書專利文獻2特開平11-192088號公報專利文獻3國際公開第W000/537^號小冊子專利文獻4國際公開第W096/17930號小冊子專利文獻5國際公開第W02008/093829號小冊子非專利文獻
非專利文獻1S. Meng 禾口 G.N.Bennett，J. Bacteriol.，174 ；2659-2669 (1992)非專利文獻2]D. S. Merrell 和 A. Camilli, Mol. Microbiol. ,34 ；836-849 (1999)非專利文獻3Y. Tanaka 等，J. Appl. Microbiol.，104 ； 1283-1293 (2007)非專利文獻4J. E. Rhee 等，FEMS Microbiol. Lett.，208 ；245-251 (2002)

發明內容
發明要解決的問題本發明的目標為提供使用弧菌屬細菌高效地產生L-賴氨酸的方法。特別地，在弧菌屬細菌情況中，本發明人已經發現了在培養基中蓄積的L-賴氨酸隨著培養進行而減少的現象，而且本發明的一個目標為降低該L-賴氨酸的減少。解決問題的手段本發明人為了解決上述問題而進行了勤勉的研究。結果，他們詳明了在弧菌屬細菌中編碼與L-賴氨酸分解相關的因子的基因。而且他們發現通過破壞該基因，能夠抑制蓄積的L-賴氨酸的分解，并能夠高效地產生L-賴氨酸，從而完成了本發明。因而，本發明涉及如下(1) 一種產生L-賴氨酸的方法，其包括在培養基中培養具有L-賴氨酸生產能力的弧菌屬細菌，以在該培養基中或細菌細胞內產生并蓄積L-賴氨酸，并從該培養基或細胞收集L-賴氨酸，其中所述弧菌屬細菌經修飾使得由fucO基因編碼的蛋白的活性減少。(2)如上所述的方法，其中所述蛋白的活性是通過將突變導入fucO基因的編碼區和/或該基因的表達調節區而減少的。(3)如上所述的方法，其中破壞了染色體上的fucO基因。(4)如上所述的方法，其中所述蛋白是下述㈧或(B)限定的蛋白(A)具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白，(B)具有在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加的蛋白，其中在所述細菌中其活性的減少改善了產生L-賴氨酸的能力。(5)如上所述的方法，其中所述fucO基因是下述(a)或(b)限定的DNA (a)包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列的DNA，(b)與SEQ ID NO=I的核苷酸序列或可從該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，并編碼蛋白的DNA，其中在所述細菌中其活性的減少改善了產生L-賴氨酸的能力。(6)如上所述的方法，其中增強了一種或多種選自下組的酶的活性二氫吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、二氫吡啶二羧酸還原酶和二氨基庚二酸脫氫酶。(7)如上所述的方法，其中所述弧菌屬細菌是需鈉弧菌(Vibrio natriegens)。(8)如上所述的方法，其中所述培養基含有甘油作為碳源。(9) 一種弧菌屬細菌，其具有產生L-賴氨酸的能力，并經修飾使得由fucO基因編碼的蛋白的活性減少。(10)如上所述的弧菌屬細菌，其為需鈉弧菌。附圖簡述

圖1 顯示通過fucO基因缺陷抑制L-賴氨酸分解。(a)經51倍稀釋的培養基的
40D660隨時間的變化。(b)培養基中葡萄糖濃度隨時間的變化。(c)培養基中L-賴氨酸濃度隨時間的變化。每幅圖包括以3個樣品的結果的平均值繪制的曲線，并示出標準偏差。圖2 顯示通過需鈉弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2從葡萄糖產生L-賴氨酸。(a)經 51倍稀釋的培養基的0D660。(b)培養基中的葡萄糖濃度、(c)培養基中的L-賴氨酸濃度。 (d)培養開始后40小時基于消耗的糖的L-賴氨酸得率。在圖中，0至8% NaCl的指示意指所述圖顯示通過在含0至8% (w/v)NaCl的MS培養基中培養獲得的結果的平均值和標準偏差。圖3 顯示使用需鈉弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2從甘油產生L-賴氨酸。(a)經51 倍稀釋的培養基的0D660隨時間的變化。(b)培養基中甘油濃度隨時間的變化。(c)培養基中L-賴氨酸濃度隨時間的變化。(d)培養開始后40小時基于消耗的甘油的L-賴氨酸得率。在圖中0% NaCl,2% NaCl和4% NaCl的指示意指所述圖顯示通過在含甘油作為碳源和0至4% (w/v)NaCl的MS培養基中培養獲得的結果的平均值和標準偏差。圖4 顯示通過需鈉弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2以及需鈉弧菌VLD01/pCABD2從甘油產生L-賴氨酸。(a) 50倍稀釋的培養基的0D660隨時間的變化。(b)培養基中甘油濃度隨時間的變化。(c)培養基中L-賴氨酸濃度隨時間的變化。(d)培養開始后M小時基于消耗的甘油的L-賴氨酸得率。
具體實施例方式<1>弧菌屬細菌本發明的細菌為具有L-賴氨酸生產能力，且經修飾使得fucO基因編碼的蛋白活性減少的弧菌屬細菌。本申請中提及的L-賴氨酸生產能力意指在培養基中培養本發明的細菌時，其在培養基或細胞中生成L-賴氨酸，并以能夠從所述培養基或細胞中收集L-賴氨酸的程度蓄積L-賴氨酸的能力。即，本發明的細菌，是能夠通過使用糖等作為碳源的發酵(亦稱作直接發酵)來生產L-賴氨酸的弧菌屬細菌。具體而言，例如，將經修飾使得由fucO基因編碼的蛋白的活性減少的弧菌屬細菌在適當的條件下培養時，如果在培養基中蓄積1.5倍以上，優選2倍以上，更優選3倍以上的L-賴氨酸，則該細菌具有L-賴氨酸生產能力。“L-賴氨酸”包括游離形式的L-賴氨酸和/或其鹽，如硫酸鹽、鹽酸鹽和碳酸鹽。具有生產L-賴氨酸能力的弧菌屬細菌可為固有地具有L-賴氨酸生產能力的細菌，或可為使用突變方法或DNA重組技術通過修飾如下所述的弧菌屬細菌使其獲得L-賴氨酸生產能力的細菌。而且，本發明的弧菌屬細菌，除了 L-賴氨酸生產能力之外，可具有生產其他氨基酸，例如L-蘇氨酸，L-谷氨酸等的能力。以下，就弧菌屬細菌進行說明。弧菌屬細菌為屬于變形菌門(Proteobacteria) Y亞群的弧菌科 (Vibrionanceae)的革蘭氏陰性兼性厭氧細菌，且為具有單一極性鞭毛的運動細菌 (motile bacteria)，見于淡水或海水中。在本發明中使用的弧菌屬細菌期望為非病原性弧菌屬細菌，可利用如下所述未知其病原性，且列于生物安全水平KOffice of Health and Safety (OHS)發行的 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories(BMBL)，第四版)的弧菌屬細菌。
5
鮑魚弧菌(Vibrioabalonicus)ATCC 27390適應弧菌(Vibrioadaptatus) ATCC 19263產氣弧菌(Vibrioaerogenes) ATCC 700797河口弧菌(Vibrio aestuarianus) ATCC 35048解藻朊酸弧菌(Vibrioalginolyticus)ATCC 14582藻弧菌(Vibrioalgosus)ATCC 14390鰻弧菌(Vibrioanguillarum) ATCC 43305卡爾維灣弧菌(Vibriocalviensis)ATCC BAA-606坎氏弧菌(Vibriocampbellii)ATCC 25920鯊魚弧菌(Vibriocarchariae) ATCC 35084溶珊瑚弧菌(Vibriocoralliilyticus)ATCC BAA-450肋生弧菌(Vibriocosticola)ATCC 43147Vibrio cyclitrophicus ATCC 700982食環弧菌(Vibriocyclosites)ATCC 14635雙氮養弧菌(Vibriodiazotrophicus)ATCC 33466費氏弧菌(Vibrio fischeri)ATCC 25918產氣弧菌(Vibriogazogenes) ATCC 29988鮑魚腸弧菌(Vibriohalioticoli)ATCC 700680哈氏弧菌(Vibrioharveyi)ATCC14126西班牙弧菌(Vibriohispanica)ATCC 51589魚腸道弧菌(Vibrioichthyoenteri)ATCC 700023魚腸弧菌(Vibrioiliopiscarius)ATCC 51760遲緩弧菌(Vibriolentus)ATCC BAA-539液化弧菌(Vibrioliquefaciens) ATCC 17058火神弧菌(Vibriologei)ATCC 15382海洋活動弧菌(Vibriomarinagilis)ATCC 14398海深黃弧菌(Vibriomarinofulvus) ATCC 14395海洋普通弧菌(Vibriomarinovulgaris)ATCC 14394地中海弧菌(Vibriomediterranei) ATCC 43341梅氏弧菌(Vibriometschnikovii)ATCC 7708貽貝弧菌(Vibriomyttli)ATCC 51288需鈉弧菌(Vibrionatregiens)ATCC 14048納瓦拉弧菌(Vibrio navarrensis)ATCC 51183海蛹弧菌(Vibrionereis)ATCC 25917黑美人弧菌(Vibrionigripulchritudo)ATCC 27043奧氏弧菌(Vibrioorddalii) ATCC 33509東方弧菌(Vibrioorientalis)ATCC 33933殺扇貝弧菌(Vibriopectenicida)ATCC 700783海弧菌(Vibriopelagius)ATCC 33504
殺對蝦弧菌(Vibriopenaeicida)ATCC 51841黑海弧菌(Vibrioponticus)ATCC 14391解蛋白弧菌(Vibrioproteolyticus)ATCC 53559冷紅弧菌(Vibrio psychroerythrus) ATCC 27364殺鮭弧菌(Vibriosalmonicida)ATCC 43839Vibrio shiloii ATCC BAA-91燦爛弧菌(Vibriosplendidus)ATCC 33125酪氨酸弧菌(Vbiriotyrosinaticus)ATCC 19378粘弧菌(Vibrioviscosus)ATCC BAA-105Vibrio wodanis ATCC BAA-104海貝內克氏菌(Beneckeapelgia)ATCC 25916鰻利斯頓氏菌(Listonellaangui 11 arum)ATCC 19264海貝內克氏菌和鰻利斯頓氏菌與弧菌屬細菌緊密相關，且根據目前的分類其一些菌株分類為弧菌屬細菌(Thompson, F. L.等 Microbiol. Mol. Biol. Rev.，23，403-431 (2004) 以及 Macian，M. C.等 Syst. Appl. Microbiol. , 23, 373-375 (2000)) 因此，這樣的細菌亦可在本發明中用作弧菌屬細菌。其中，優選使用需鈉弧菌。需鈉弧菌為屬于變形菌門Y亞群弧菌科的海洋性兼性厭氧細菌，且其在1958年作為糖醛酸氧化細菌而分離O^ayn^W. J. J. Bacteriology, 76, 301(1958))。起初，該細菌被認為屬于變形菌門Y亞群的假單胞菌屬，但該細菌重分類為貝內克氏菌屬(Beneckea)，然后與其他屬于貝內克氏菌屬的細菌一起并入了弧菌屬。該細菌在 ATCC 中分類為生物安全水平 1，在 DSMZ (the German National Resource Centre for Biological Material)中分類為風險組1 (德國分類)，且該細菌的病原性未知。作為需鈉弧菌，可使用需鈉弧菌ATCC 14048株(NBRC 15636株)。上述弧菌屬細菌可從例如美國典型培養物保藏中心(地址Ρ.0.Βοχ 1549, Manassas, VA 20108，United States of America)獲得。即賦予各菌株對應的登錄號， 可利用該登錄號通過訂購而獲得(參照http://www.atcc. org/)。各菌株對應的登錄號記載于美國典型培養物保藏中心的目錄中。此外，需鈉弧菌ATCC14048株以NBRC15636 的編號保存在獨立行政法人制品評價技術基盤機構生物遺傳資源部門(NITE NBRC, 2-5-8Kazusakamatari, Kisarazushi, Chiba-ken，292-0818，日本)，并可由該機構提供。在當氨基酸發酵后期產生的物質以高水平蓄積的時期內觀察到的高滲透壓條件下，或由高糖濃度誘導的高滲透壓條件下，與已經常規地用于L-氨基酸生產的微生物(如大腸桿菌或棒狀桿菌型細菌)在這樣的條件下生長不充分相比，弧菌屬細菌可良好地生長。“高滲透壓”為，例如不低于925m0sm，優選不低于IlOOmOsm,更優選不低于1500m0sm。 高滲透壓的上限只要是可以進行氨基酸發酵則并無特別的限制，且為，例如2000m0sm。此外，“細菌可在高滲透壓下良好地生長”意指，在大腸桿菌野生型株，例如MG1655株(ATCC 47076)的生長速率下降到最大時的50%以下的IlOOmOsm條件下，生長速率保持為不低于最大生長速率的50 %，優選不低于最大生長速率的90 %。<2>賦予弧菌屬細菌L-賴氨酸生產能力的方法具有L-賴氨酸生產能力的弧菌屬細菌可通過向如上所述的任何弧菌屬細菌的野生型株賦予L-賴氨酸生產能力來獲得。為了賦予L-賴氨酸生產能力，可使用在培育棒狀桿菌型細菌、埃希氏菌屬細菌等中常規采用的方法(參見氨基酸發酵(株)學會出版中心)。 這樣的方法包括獲得營養缺陷型突變株、對L-賴氨酸如L-賴氨酸類似物有抗性的株、或代謝調節突變株，構建L-賴氨酸生物合成酶的活性增加的重組株等。L-賴氨酸生物合成酶活性可通過增加編碼該酶的基因的拷貝數或修飾基因的表達調節序列如啟動子來增強。在 L-賴氨酸生產菌的培育中，這樣的性質如營養缺陷型、類似物抗性和代謝調節突變的賦予， 可與L-賴氨酸生物合成酶的增強相組合。以下，例示了賦予L-賴氨酸生產能力的方法。例如，L-賴氨酸生產菌可培育為對于L-高絲氨酸、或L-蘇氨酸及L-甲硫氨酸營養缺陷的突變株(特公昭48-28078號、特公昭56-6499號))，對于肌醇或乙酸營養缺陷的突變株(特開昭55-9784號和特開昭56-8692號)，或者對氧代賴氨酸、賴氨酸氧肟酸、 S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、Y-甲基賴氨酸、α-氯己內酰胺、DL-α-氨基-ε-己內酰胺、α -氨基十二烷基內酰胺、天冬氨酸類似物、磺胺藥、醌類或N-月桂酰亮氨酸有抗性的突變株。特別優選的培育對于作為L-賴氨酸類似物的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸 (AEC)具有抗性的株。獲得弧菌屬細菌的突變株的突變方法的實例包括紫外線照射或者使用用于常規突變的誘變劑，如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸處理。而且，亦可通過選擇弧菌屬細菌的天然存在的突變體來獲得具有L-氨基酸生產能力的弧菌屬細菌。L-氨基酸類似物抗性突變株可通過，例如將經突變處理的弧菌屬細菌接種于含有不同濃度的L-氨基酸類似物的瓊脂培養基并選擇形成菌落的菌株來獲得。而且，營養缺陷型突變株可通過使弧菌屬細菌在含有特定營養物(例如L-氨基酸)的瓊脂培養基中形成菌落，然后將所述菌落復印至不含前述營養物的另一瓊脂培養基上，并選擇在不含該營養物的培養基上不能形成菌落的菌株來獲得。對AEC有抗性的需鈉弧菌的L-賴氨酸生產株的實例包括需鈉弧菌觀-15株(FERM ΒΡ-10946)株(W02008/093829)。該株被命名為AJl 10593株，于2006年10月M日保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物保藏中心(〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6)，并分配登錄號FERM Ρ-21066，它之后轉為國際保藏，分配登錄號 FERM ΒΡ-10946。通過增強L-賴氨酸生物合成酶的活性，賦予或增強L-賴氨酸生產能力的方法如下所述。例如，L-賴氨酸生產能力可通過增強二氫吡啶二羧酸合酶活性和/或天冬氨酸激酶活性來賦予。弧菌屬細菌的二氫吡啶二羧酸合酶活性和/或天冬氨酸激酶活性的增強可通過如下得到將編碼二氫吡啶二羧酸合酶的基因片段和/或編碼天冬氨酸激酶的基因片段與在弧菌屬細菌中起作用的載體，優選多拷貝類型的載體連接而構建重組DNA，并將所述DNA 導入宿主弧菌屬細菌進行轉化。轉化株的細胞內編碼二氫吡啶二羧酸合酶的基因和/或編碼天冬氨酸激酶的基因的拷貝數增加的結果是增強了這些酶的活性。下文中，二氫吡啶二羧酸合酶可略為DDPS，天冬氨酸激酶可略為ΑΚ，而天冬氨酸激酶III可略為AKIII。任何微生物可用作編碼DDPS和AK的基因的供體，只要選擇可在屬于弧菌屬的微生物中表達DDPS和AK活性的微生物。所述微生物可為野生型株或源自野生型株的突變株。其具體實例包括大腸桿菌(Escherichia coli)K_12株以及需鈉弧菌ATCC14048 株(NBRC15636)。已經闡明了源自埃希氏菌屬細菌的編碼DDPS的基因(dapA，Richaud, F.等 J. Bacteriol.，297 (1986))以及編碼 AKIII 的基因(lysC, Cassan, M.，Parsot, C.， Cohen, G. N.和 Patte，J. C.，J. Biol. Chem.，261，1052 (1986))兩者的核苷酸序列。因此，可通過基于這些基因的核苷酸序列合成引物，并使用微生物如大腸桿菌K-12株或需鈉弧菌 ATCC14048株的染色體DNA作為模板進行PCR來獲得這些基因。弧菌屬細菌的基因也可通過使用下述GenBank數據庫信息來獲得。霍亂弧菌01生物變型eltor株附6961染色體I，全序列；AE003852霍亂弧菌01生物變型eltor株附6961染色體II，全序列；AE003853副溶血弧菌RIMD 2210633染色體I，全序列；BA000031副溶血弧菌RIMD 2210633染色體II，全序列；BA000032費氏弧菌ESl 14染色體I，全序列；CP000020費氏弧菌ES114染色體II，全序列；CP000021創傷弧菌(Vibriovulnificus) CMCP6 染色體 I，全序列；AE016795創傷弧菌CMCP6染色體II，全序列；AEO16796創傷弧菌YJO16染色體I，全序列；BA000037創傷弧菌YJO16染色體II，全序列；BA000038用于本發明的DDPS和AK優選不受L-賴氨酸的反饋抑制。已知源自弧菌屬細菌的野生型DDPS受L-賴氨酸的反饋抑制，而源自弧菌屬細菌的野生型AKIII受L-賴氨酸的抑制和反饋抑制。因此，要導入弧菌屬細菌的dapA和lysC，優選為編碼具有使其對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變的DDPS和AKIII的那些。然而，在本發明中，DDPS和AK可不必為突變體。例如，已知源自棒桿菌屬細菌的 DDPS原本不受L-賴氨酸的反饋抑制。可存在編碼天冬氨酸激酶的基因的同源物，而且該基因的來源沒有限制，只要該基因編碼具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。例如，需鈉弧菌的AK基因的實例包括AKO基因、thrA基因、metL基因、IysC基因和推定的AK(putative-AK)基因。SEQ ID NO 11為包含需鈉弧菌AKO基因的區的核苷酸序列。在SEQ IDNO 11中， 估計核苷酸編號5沈-5觀的GTG、核苷酸編號544-546的GTG或核苷酸編號568-570的GTG 構成起始密碼子，核苷酸編號1711-1713的TGA構成終止密碼子。因此，具有SEQ ID N0: 11中的核苷酸編號526-1710的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :12中的氨基酸編號1-395) ,SEQID NO 11中的核苷酸編號M4-1710的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQID NO 12中的氨基酸編號7-395)或SEQ ID NO 11中的核苷酸編號568-1710的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:12中的氨基酸序列15-395)的DNA作為開讀框可用作AKO基因。SEQ ID NO :13為包含需鈉弧菌thrA基因的區的核苷酸序列。在SEQ IDN0:13中， 估計核苷酸編號486-488的ATG、核苷酸編號591-593的GTG或核苷酸編號633-635的GTG 構成起始密碼子，核苷酸編號四43-2945的TAA構成終止密碼子。因此，具有SEQ ID N0 13 中的核苷酸編號4864942的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:14中的氨基酸編號1-819) ,SEQID NO :13中的核苷酸編號59H942的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為 SEQID NO: 14中的氨基酸編號35-819)或SEQ ID NO 13中的核苷酸編號6334942的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO 14中的氨基酸序列50-819)的DNA作為開讀框可用作thrA基因。SEQ ID NO :15為包含需鈉弧菌metL基因的區的核苷酸序列。在SEQ IDN0:15中， 估計核苷酸編號376-378的ATG、核苷酸編號487-489的GTG或核苷酸編號490-492的GTG 構成起始密碼子，核苷酸編號2782-2784的TAA構成終止密碼子。因此，具有SEQ ID NO 15 中的核苷酸編號376-2781的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID N0:16中的氨基酸編號1-802) ,SEQID NO 15中的核苷酸編號487-2781的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為 SEQID NO 16中的氨基酸編號38-802)或SEQ ID NO 15中的核苷酸編號490-2781的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO 16中的氨基酸序列39-802)的DNA作為開讀框可用作metL基因。SEQ ID NO 17為包含需鈉弧菌IysC基因的區的核苷酸序列。在SEQ IDNO 17 中，估計核苷酸編號1060-1062的GTG或核苷酸編號1117-1119的ATG構成起始密碼子， 核苷酸編號M10-2412的TAA構成終止密碼子。因此，具有SEQ ID N0:17中的核苷酸編號1060-2409的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO 18中的氨基酸編號1_450) 或SEQ ID N0:17中的核苷酸編號1117-M09的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO 18中的氨基酸序列20-450)的DNA作為開讀框可用作IysC基因。SEQ ID NO :19為包含需鈉弧菌推定的AK基因的區的核苷酸序列。在SEQ ID NO 19中，估計核苷酸編號344-346的ATG、核苷酸編號380-382的ATG或核苷酸編號470-472 的ATG構成起始密碼子，核苷酸編號1766-1768的TAA構成終止密碼子。因此，具有SEQ ID NO 19中的核苷酸編號344-1765的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO 20中的氨基酸編號1-474)、SEQ ID NO :19中的核苷酸編號380-1765的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :20中的氨基酸編號13-474)或SEQ ID NO 19中的核苷酸編號470-1765 的核苷酸序列(編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :20中的氨基酸序列43-474)的DNA作為開讀框可用作推定的AK基因。此外，上述AKO基因、thrA基因、metL基因、IysC基因和推定的AK基因可為與每個序列的互補鏈或由這些序列制備的探針在嚴格條件下可雜交的、且編碼具有天冬氨酸激酶活性的蛋白的DNA。在此，“嚴格條件”指形成所謂的特異性雜交物，而不形成非特異性雜交物的條件。 雖然難以將這些條件明確地數值化，嚴格條件的實例包括高度同源的DNA相互雜交，例如具有80 %以上，優選90 %以上，更優選95 %以上，還更優選97 %以上，特別優選99 %以上同源性的DNA相互雜交，而比上面更低的同源性的DNA不互相雜交的條件，或者為在與常規Southern雜交中的洗滌相應的鹽濃度和溫度下，即在60°C、IX SSC、0. 1% SDS，優選在 60°C、0. IX SSC、0. SDS，更優選在 68°C、0. IX SSC、0. 1 % SDS，洗滌一次，優選 2 或 3 次的條件。雖然探針的長度可根據雜交的條件適當地選擇，但其通常為IOObp至ΙΙΛρ。而且，在本說明書中，術語“同源性”(homology)可指“同一性”(identity)。天冬氨酸激酶活性可通過Miyajima，R 等；The Journal of Biochemistry (1968)，63 (2)，139-148中所述的方法來測量。
上述AKO基因、thrA基因、metL基因、IysC基因和推定的AK基因均不限于野生型基因，亦可為編碼具有由每個基因的開讀框編碼的氨基酸序列但在一個或多個位置包括一個或幾個氨基酸的取代、缺失、插入、添加等的保守變體蛋白的突變體或人工修飾的基因， 只要所述基因編碼具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。雖然本文提及的“一個或幾個”氨基酸殘基的數目可取決于蛋白的氨基酸的類型或在三維結構中的位置而不同，但具體地其可為優選1 20、更優選1 10、還更優選1 5。上述一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加為保留蛋白的正常功能的保守突變。保守突變為，當取代部位為芳族氨基酸時取代發生在Wie、Trp, Tyr相互之間的突變； 當取代部位為疏水性氨基酸時取代發生在LeU、Ile、Val相互之間的突變；當取代部位為極性氨基酸時取代發生在GlruAsn之間的突變；當取代部位為堿性氨基酸時取代發生在Lys、 Arg、His相互之間的突變；當取代部位為酸性氨基酸時取代發生在Asp、Glu之間的突變；當取代部位為具有羥基的氨基酸時取代發生在義！·、!!!!·之間的突變。保守突變的典型實例是保守取代，作為可視作保守取代的取代，具體地包括用Ser或Thr取代Ala，用Gin、His或 Lys 取代 Arg，用 Glu、Gin、Lys、His 或 Asp 取代 Asn，用 Asn、Glu 或 Gln 取代 Asp，用 Ser 或 Ala 取代 Cys，用 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 取代 Gln，用 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp 取代 Glu,用 Pro 取代 Gly,用 Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 取代 His，用 Leu、Met、Val 或 Phe 取代 lie, M lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu，用 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys，用 lie、Leu、 Val 或 Phe 取代 Met，用 Trp、Tyr、Met、lie 或 Leu 取代 Phe，用 Thr 或 Ala 取代 Ser,用 Ser 或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，以及用Met、Ile或 Leu取代Val。上述氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等可為天然存在的突變或由于攜帶AKO、thrA、metL、IysC和推定的AK基因的微生物的個體差異或種間差異所引起的變異的結果。這樣的突變體或如上所述修飾的基因可通過如下獲得通過例如位點特異性的突變修飾上述各開讀框的核苷酸序列以使編碼的蛋白質在特定位點包含氨基酸殘基的取代、 缺失、插入或添加。作為AKO基因、thrA基因、metL基因、IysC基因和推定的AK基因，可存在使用的基因，其編碼與有各基因上述開讀框編碼的完整氨基酸序列具有80%以上、優選90%以上， 更優選95%以上，還更優選97%以上，特別優選99%以上同源性的氨基酸序列，且編碼具有天冬氨酸激酶活性的蛋白。氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可使用，例如由Karlin和 Altschul 創造的BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))或FASTA (Methods Enzymo 1.，183，63 (1990))來確定。基于該BLAST算法，開發了稱作BLASTN或BLASTX的程序(參照 http://www. ncbi. nlm. nih. gov)。涉及保守的變體及其編碼基因以及保守突變的上述描述亦適用于天冬氨酸激酶以外的酶和編碼該酶的基因，以及下述的FucO蛋白和fucO基因。用于基因克隆的質粒可為在細菌如埃希氏菌屬細菌中可復制的那些，且其具體實例包括 pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19 等。作為在弧菌屬細菌中有功能的載體，可使用能夠在弧菌屬細菌中自主復制的任何載體。作為載體質粒，可使用任何具有源自PUC質粒、pACYC184質粒、IncQ質粒的ori的載體質粒。作為用于選擇的標記基因，可使用源自Tn903的卡那霉素抗性基因、源自Τη9的氯霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、四環素抗性基因等。
為了通過將dapA和IysC連接于在弧菌屬細菌中有功能的載體而制備重組DNAJf 載體用對應于包含dapA和IysC的DNA片段的末端的限制酶消化。連接通常使用連接酶如 T4DNA連接酶進行。dapA和IysC可由不同的載體或單一的載體攜帶。編碼不受L-賴氨酸的反饋抑制的突變型二氫吡啶二羧酸合酶的DNA的實例包括編碼具有118位的組氨酸殘基被酪氨酸殘基取代的氨基酸序列的蛋白的DNA。編碼不受 L-賴氨酸的反饋抑制的突變型天冬氨酸激酶的DNA的實例包括編碼具有352位的蘇氨酸殘基、323位的甘氨酸殘基和318位的甲硫氨酸殘基分別被異亮氨酸、天冬酰胺和異亮氨酸殘基取代的氨基酸序列的AKIII的DNA(關于這些突變體，參見美國專利5，661，012號和 6，040，160號說明書)。所述突變DNA可通過位點特異性突變使用PCR等來獲得。寬宿主范圍質粒RSFD80、pCABl、pCABD2稱為包含編碼突變型二氫吡啶二羧酸合酶的突變型dapA基因和編碼突變型天冬氨酸激酶的突變型IysC基因的質粒(美國專利 6，040，160號說明書)。由RSFD80轉化的大腸桿菌JM109株(美國專利6，040, 160號說明書)命名為AJ12396，并于1993年10月觀日保藏于通產省工業技術院生命工程工業技術研究所(現為獨立行政法人工業技術綜合研究所專利生物保藏中心)并分配登錄號FERM P-13936。該保藏物于1994年11月1日根據布達佩斯條約轉為國際保藏，并分配登錄號 FERM BP-4859。RSFD80可從AJ12396株通過常規方法獲得。如上所述制備的重組DNA可通過能夠獲得充分的轉化效率的任何方法導入弧菌屬細菌，而其實例包括電穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43，197 (1997))。DDPS活性和/或AK活性亦可通過將dapA和/或IysC的多拷貝導入弧菌屬細菌的染色體DNA來增強。將dapA和/或IysC的多拷貝導入弧菌屬細菌的染色體DNA可通過靶向以多拷貝存在于染色體DNA上的序列的同源重組來進行。所述以多拷貝存在于染色體 DNA上的序列可為重復DNA或轉座元件端部存在的反向重復序列。或者，如特開平2-109985 公報所公開的，可通過如下將dapA和/或IysC的多拷貝導入染色體DNA 將所述基因插入轉座子并將其轉移使得該基因的多拷貝導入染色體DNA。這些方法增加了 dapA和/或IysC 的拷貝數，這導致DDPS活性和/或AK活性增強。除了上述基因擴增之外，DDPS活性和/或AK活性的增強還可通過用強力序列代替dapA和/或IysC的表達調節序列如啟動子來達成(參見特開平1-215280號公報)。強力的啟動子的實例包括Iac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、tac啟動子、Lambda噬菌體的I3R啟動子和PL啟動子，以及上述的雜合啟動子等。用這些啟動子的替代增強了 dapA和 /或IysC的表達，并由此增強了 DDPS活性和/或AK活性。表達調節序列的替代可與提高 dapA和/或IysC的拷貝數組合(Science，1997 Sep. 5,277(5331) :1453-74 ；Nucleic Acids Res. ,1993Apr. 11,21 (7) :1507-16 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983Jan, 80 (1) :21-5,國際專利公開 W098/04715、W098/17806、美國專利號 US 5，830，690 和 US 5,861,273)。DNA的消化、連接等，染色體DNA的制備，PCR，質粒DNA的制備，轉化，作為引物使用的寡聚物的設計等可根據本領域技術人員公知的常規方法進行。這些方法記載于 Sambrook, J.，Fritsch, E. F.，禾口 Maniatis，Τ.，“ Molecular Cloning ALaboratory Manual，第 2 片反〃，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)等。除了 DDPS活性和/或AK活性的增強之外，可增強其他涉及L-賴氨酸生物合成的酶的活性。此種酶的實例包括二氨基庚二酸途徑的酶，如二氫吡啶二羧酸還原酶(dapB)、二氨基庚二酸脫羧酶(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶(ddh)(以上，見國際專利公開 W096/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc，特開昭60-87788號公報)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspC，特公平6-1020 號公報)、二氨基庚二酸差向異構酶(dapF，特開2003-135066號公報)、和天冬氨酸半醛脫氫酶(asd，國際專利公開00/61723號小冊子)，或者氨基己二酸途徑的酶，如高烏頭酸水合酶(特開2000-157276號公報)等。酶名稱后面的括號內提及的那些為基因名稱(這同樣適用于如下描述)。前述pCABD2包含源自大腸桿菌且編碼具有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變的DDPS的突變型dapA基因、源自大腸桿菌且編碼具有對L-賴氨酸的反饋抑制脫敏的突變的AKIII的突變型IysC基因、源自大腸桿菌且編碼二氫吡啶二羧酸還原酶的dapB基因、和源自乳發酵短桿菌且編碼二氨基庚二酸脫氫酶的ddh基因(國際專利公開W095/16042和 W001/53459號小冊子)。本發明的弧菌屬細菌可為通過增強L-賴氨酸分泌活性而增加L-賴氨酸生產能力的細菌。例如，可通過增加ybjE基因的表達量或增加IysE基因的表達量來增強L-賴氨酸分泌活性(特開2005-237379，國際專利公開W097/23697號小冊子)。此外，在本發明的細菌中，可減少或缺失催化從L-賴氨酸生物合成途徑分歧而生成除L-賴氨酸以外的化合物的反應的酶的活性，或針對L-賴氨酸合成或積蓄而起消極作用的酶的活性。用于L-賴氨酸產生的酶的活性包括高絲氨酸脫氫酶、蘋果酸酶等，且可參考國際專利公開W095/23864號、W096/17930號小冊子和W02005/010175號小冊子來構建所述酶活性減少或缺損的菌株。可通過如下減少或缺失這些酶的活性采用常規的突變或基因工程技術，在基因組上編碼上述酶的基因中導入使得細胞中該酶的活性減少或缺失的突變。這樣的突變的導入可通過如下達成例如，通過基因重組或通過修飾表達調節序列如啟動子或 Shine-Dalgarno(SD)序列消除基因組上的編碼所述酶的基因。此外，還可以通過如下達成向基因組上的編碼酶的區域導入氨基酸取代的突變(錯義突變)，導入終止密碼子(無義突變)，導入添加或缺失一或兩個核苷酸的移碼突變，或者使基因的部分或整個區域缺失 (J. Biol. Chem. 272,8611-8617(1997) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 :5511-5515(1998)， J. Biol. Chem.，266，20833-20839 (1991))。此外，酶活性還可通過如下減少或消除構建編碼突變酶的突變基因，其編碼區的部分或全部分缺失，然后通過同源重組等用突變基因替代基因組上的正常基因，或者將轉座子或IS因子導入該基因中。例如，使用如下所述的方法以通過基因重組導入使得上述酶的活性減少或消除的突變。通過對目的基因的部分序列進行修飾來制備突變型基因使得它不產生正常發揮功能的酶。然后，用含該突變型基因的DNA轉化弧菌屬細菌以導致基因組上的基因與突變型基因的重組，并由此用突變型基因替代基因組上的目的基因。此類使用同源重組的基因取代的實例包括使用線性DNA的方法，如稱為“Red驅動整合(Red-driven integration) ”的方法(Datsenko, K. A 和 Wanner，B. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97 :6640-6645 QOOO))、和由Red驅動整合和源自λ噬菌體的切出系統的組合組成的方法(Cho，E.H.，Gumport，R. I.， Gardner, J. F.，J. Bacteriol.，184 :5200-5203 (2002)，參照國際專利公開 W02005/010175 號)，使用含溫度敏感型復制起點的質粒的方法(美國專利第6，303，383號、特開平 05-007491號公報)等。如上所述基于利用同源重組的基因取代的位點特異性突變還可通過使用在宿主中不能夠復制的質粒來進行。用于降低酶活性的上述方法還可適用于下述FucO蛋白活性的降低。<3>由fucO基因編碼的蛋白的活性的降低本發明的細菌可通過如下獲得修飾如上所述屬于弧菌屬并具有L-賴氨酸生產能力的細菌使得由fucO基因編碼的蛋白(以下，該蛋白亦描述為“FucO”)的活性降低。在本發明的弧菌屬細菌的培育中，可先賦予L-賴氨酸生產能力或先進行降低FucO蛋白活性的修飾。雖然本發明的細菌可為經修飾使得由fucO基因編碼的蛋白的活性與野生型株或非修飾株相比降低的細菌，但更期望它與野生型株或非修飾株相比改進了 L-賴氨酸蓄積能力。在本發明中，fucO基因意指能夠從弧菌屬細菌獲得的大腸桿菌fucO基因的同源物，且實例包括例如具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的基因。SEQ IDNO :1的核苷酸序列為需鈉弧菌觀-15株的fucO基因的核苷酸序列。由該基因編碼的氨基酸序列示于SEQ ID NO :2 中。本發明的fucO基因為與大腸桿菌fucO基因顯示同源性的基因。大腸桿菌MG1655 株的fucO基因作為編碼L-I，2-丙二醇氧化還原酶的基因，登錄于Genebank (GenBank NC_000913. 2、核苷酸編號四四887-四31038的互補鏈)。而且，本發明的fucO基因包括副溶血弧菌的eutG基因和與該基因顯示同源性的基因。副溶血弧菌RIMD 2210633株的eutG基因產物，作為含鐵的醇脫氫酶(NP_797614)， 登錄于 GenPept 數據庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/NP_797614. 1 ？ report = genp印t)。此外，所述eutG基因，作為含鐵的醇脫氫酶的基因登錄于GenBank (NC 004603. 1、核苷酸編號 1301840-1303159)。大腸桿菌的fucO基因產物與大腸桿菌的eutG基因產物之間在氨基酸組成上的同源性為 77. 3% (使用 Molecular Devices, Inc.的 Genetix 9. 0. 3 版本)。弧菌屬細菌的fucO基因的同源物可通過如下獲得例如，使用BLAST(http:// blast, genome, jp/)檢索與具有SEQ ID NO :1的核苷酸序列的基因、大腸桿菌的fucO基因或所述eutG基因顯示高同源性的基因。同源性的程度無特別限制，只要通過基因表達產物的活性下降改進了 L-賴氨酸的蓄積，但是同源性為，例如相對于整個氨基酸序列80%以上，優選90%以上，更優選95%以上，還更優選97%以上，特別優選99%以上。由fucO基因編碼的蛋白的實例包括具有SEQ ID NO 2的氨基酸序列的那些。然而，蛋白可為保守變體，只要蛋白的功能不改變。此外，fucO基因只要其編碼FucO蛋白，可為與SEQ ID NO 1的核苷酸序列或可由該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下可雜交的DNA。所述“嚴格條件”具有與上述相同的含義。表述“降低由fucO基因編碼的蛋白的活性”意指通過使用藥物或遺傳工程達成的、由于將突變導入在fucO基因的編碼區而導致的，由fucO基因編碼的FucO蛋白的功能削弱或缺失，也指由于將突變導入fucO基因的表達調控區等而導致fucO基因的表達或翻譯降低從而降低FucO蛋白的量。此外，可通過所謂基因破壞，即缺失染色體上整個fucO基因或fucO基因的一部分，來降低FucO蛋白的活性。而且，活性的降低包括活性的完全消除。為了降低FucO蛋白的活性，具體而言，可使用所述用于賦予L-賴氨酸生產能力的降低酶活性的方法。<4>產生L-賴氨酸的方法本發明的方法為將本發明的細菌在培養基中培養以產生并在該培養基或細菌細胞中蓄積L-賴氨酸，和從該培養基或細胞回收L-賴氨酸的方法。作為使用的培養基，可使用在使用微生物通過發酵進行的L-氨基酸生產中常用的培養基。即，可使用包含碳源、氮源、無機離子和根據需要任選的其他有機組分的常規培養基。作為碳源，可使用糖，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物；醇，如甘油、山梨醇；有機酸，如延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸。在本發明中特別優選使用甘油作為碳源。在本發明中，優選使用甘油作為碳源。甘油可以任何濃度使用，只要選擇適于產生 L-賴氨酸的濃度。當甘油用作培養基中唯一的碳源時，其優選以約0. 1 50w/V%，更優選約0. 5 40W/v%，特別優選約1 30W/v%的量包含在培養基中。甘油也可與其他碳源如葡萄糖、果糖、蔗糖、赤糖糊、淀粉水解物組合使用。在此情況下，雖然甘油與其他碳源可以任意比例混合，但期望碳源中甘油的比例為10wt%以上，更優選50wt%以上，還更優選 70wt%以上。其他優選的碳源為糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、赤糖糊、淀粉水解物或由生物質水解所得的糖溶液，醇如乙醇，有機酸如延胡索酸、檸檬酸、琥珀酸。其中優選葡萄糖。雖然培養開始時甘油的初始濃度優選如上所述，但隨著培養過程中甘油的消耗可補充甘油。使用的甘油可為純甘油或粗甘油。粗甘油指工業生產的含雜質的甘油。粗甘油是通過將油脂在高溫高壓下與水接觸以將其水解或通過用于生物柴油燃料生產的酯化反應在工業上生產的。生物柴油燃料指通過酯交換反應從油脂和甲醇生成的脂肪酸甲酯，且作為該反應的副產物生成了粗甘油(參見Fukuda, H.，Kondo, A.和Noda, H. 2001，J. Biosci. Bioeng. 92,405-416)。在生物柴油燃料生產工藝中，堿催化劑方法在很多情況下用于酯交換，并添加酸用于中和。因此，生成了包含水和雜質的純度為約70 95wt%的粗甘油。生物柴油燃料生產工藝中產生的粗甘油除了水之外，還包含殘余甲醇和作為催化劑的堿如NaOH 與用于中和堿的酸如K2SO4形成的鹽作為雜質。雖然取決于生產者或制造方法，此種鹽或甲醇的量可達到百分之幾。粗甘油優選含有源自堿和用于中和堿的酸的離子，如鈉離子、鉀離子、氯離子、硫酸根離子，其量基于粗甘油的重量計為2-7%，優選3-6%，更優選4-5.8%。 雖然可不含甲醇作為雜質，但其優選以0.01%以下的量存在。粗甘油可進一步包含微量金屬、有機酸、磷、脂肪酸等。有機酸的實例包括甲酸、乙酸等，雖然可不含它們作為雜質，但它們優選以0.01%以下的量存在。作為粗甘油中包含的微量金屬，優選為微生物生長所需的微量金屬，且實例包括例如鎂、鐵、鈣、錳、銅、鋅等。 按基于粗甘油重量的總量計，鎂、鐵和鈣優選以0. 00001 0. 1%、優選0. 0005 0. 1%, 更優選0. 004 0. 05%、還更優選0. 007 0. 01%的量存在。錳、銅和鋅按總量計優選以 0. 000005 0. 01%、優選0. 000007 0. 005%、更優選 0. 00001 0. 001%的量存在。粗甘油的純度可為10%以上，優選50%以上，更優選70%以上，特別優選80%以上。只要雜質含量在上述范圍內，甘油的純度可為90%以上。使用粗甘油時，可根據甘油的純度向培養基添加粗甘油使得甘油的量在上述濃度范圍內。可向培養基添加甘油和粗甘油兩者。
作為氮源，可使用無機銨鹽如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨，有機氮如大豆水解物、氨氣、氨水等。作為有機微量營養源，培養基期望含有適量的所需物質如維生素BpL-高絲氨酸、酵母提取物等。除上述外，根據需要，少量添加磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。此夕卜，在本發明中使用的培養基可為天然培養基或合成培養基，只要使用包含碳源、氮源和無機離子以及根據需要包含其他有機微量成分的培養基。培養優選在有氧條件下進行1至7日，培養溫度優選為M至37°C，培養過程中的 PH優選為5 9。用于pH調整，可使用無機或有機酸性或堿性物質，氨氣等。在生產堿性氨基酸如L-賴氨酸時，可通過下述方法進行生產通過將培養過程中培養基的PH控制為6. 5 9. 0，將培養結束時培養基的pH控制為7. 2 9. 0，提供培養基包含20mM以上的碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的培養期，使得這些碳酸氫根離子和/ 或碳酸根離子作為堿性氨基酸的反荷離子來進行發酵，然后收集目標的堿性氨基酸(特開 2002-65287、美國專利申請公開 US2002-0025564A，EP 1813677A)。在培養基中在有氧條件下培養具有堿性氨基酸生產能力的微生物時，可將碳酸根離子或碳酸氫根離子或兩者用作堿性氨基酸的主要反荷離子。為了在培養基中以充當堿性氨基酸的反荷離子所需的量提供碳酸氫根離子和/或碳酸根離子，已知可將培養過程中培養基的PH控制為6. 5 9. 0，或在另一個實施例中為6. 5 8. 0，培養結束時培養基的pH 控制為7. 2 9. 0，并可控制發酵罐中的壓力使其在發酵過程中為正，或可將二氧化碳或包含二氧化碳的混合氣體供予培養基(特開2002-65287、美國專利申請公開20020025564號、 EP1813677A)。可通過如下常規已知方法的組合從發酵液回收L-賴氨酸使用離子交換樹脂 (Nagai，H. Separation Science and Technology，39 (16)，3691-3710)、沉淀、膜分離 (特開平 9-164323 號和特開平 9-173792 號)、晶析(W02008/078448、W02008/078646)等。 當L-賴氨酸在細胞中蓄積時，可用例如超聲處理等破壞細胞，并可通過離子交換樹脂從藉由離心由破壞細胞的懸液去除細胞所得的上清收集L-賴氨酸。回收的L-賴氨酸除了賴氨酸以外可包含細菌細胞、培養基組分、水分和細菌的代謝副產物。收集的L-賴氨酸的純度可為50%以上，85%以上，甚至95%以上(日本專利 JP1214636B、美國專利 5，431，933,4, 956，471,4, 777，051,4, 946，654,5, 840，358、 6，238，714、美國專利申請公開 US2005/0025878)。此外，當L-賴氨酸在培養基中析出時，可通過離心或過濾等對其進行收集。當在培養基中溶解的L-賴氨酸結晶之后，可將在培養基中析出的L-賴氨酸與在培養基中溶解的L-賴氨酸一起分離。實施例以下通過實施例更加具體地說明本發明。[實施例1]破壞fucO基因的需鈉弧菌的構建破壞了賴氨酸生產細菌需鈉弧菌觀-15的染色體上的fucO基因。首先，使用具有枯草芽孢桿菌的sacB基因的pDNR-Dual Doner載體(Clontech公司，USA)作為模板DNA，具有SEQ ID NO :3和4的序列的合成DNA作為引物，通過PCR擴增了枯草芽孢桿菌的sacB基因。sacB基因是編碼果聚糖蔗糖酶(levari sucrase)、用于高效選擇其載體部分從染色體上消除的菌株的基因6chafer，A.等，Gene，145，69_73，(1994))。艮口，若表達果聚糖蔗糖酶，同化蔗糖且生成的果聚糖對細菌具有致死作用使得它們無法生長。因此，攜帶果聚糖蔗糖酶的載體仍然保留在染色體上的菌株在含有蔗糖的平板上培養時無法生長，從而可在含有蔗糖的平板上選擇載體消除的菌株。通過將擴增的sacB基因片段和pUT399用限制性酶EcoRI消化并連接以獲得載體 pUT_sacB。在此使用的pUT399為具有R6K的復制起點、并包含接合轉移所需的mob區的質粒，并且其為在不具有Pir基因的菌株中無法復制的質粒(美國專利7，090, 998號)。然后， 使用需鈉弧菌觀-15的染色體DNA作為模板DNA，具有SEQ ID NO :5和6或者SEQ ID NO 7 和8的序列的合成DNA作為引物進行PCR，分別擴增了 fucO基因兩側約SOObp的序列。然后使用所得的兩種PCR產物的混合物作為模板，具有SEQ ID NO 5和7的序列的合成DNA 作為引物再次進行PCR。將所得的PCR產物和pUT_sacB —同用限制性酶MlI和SphI消化并連接以獲得載體pUT_sacB_fucOFR。pUT_sacB_fucOFR為缺少fucO編碼區的一部分用于破壞fucO基因的質粒。并將pUT_sacB_fucOFR導入大腸桿菌S17-1 ( λ pir+，可從Biomedal 獲得R. Simon.等，Bio/technology，1 :784-791 (1983))以獲得 S17_l/pUT_sacB_fuc0FR。接著，將S17_l/pUT_sacB_fuc0FR接種入1. 5ml LB培養基(包含10g/L細菌胰蛋白胨(Bacto-tryptone)，5g/L 細菌酵母提取物(Bacto-yeast extract)，5g/LNaCl 禾口 40mg/ L氯霉素，pH 7. 0)，并在37°C培養18小時。通過將獲得的培養基離心(在5000rpm，5分鐘)來收集細胞，并懸于50 μ 1新鮮LB培養基。將此細胞懸液接種于LB-NaCl瓊脂培養基 (包含10g/L細菌胰蛋白胨、5g/L細菌酵母提取物、30g/LNaCl、0. 4g/LMgS04* 20g/L瓊脂， PH 7.0)上形成直徑2cm的圓形，并通過將接種的培養基在室溫放置30分鐘來干燥。同時， 將需鈉弧菌28-15接種入1. 5ml LB-NaCl培養基(包含10g/L細菌胰蛋白胨、5g/L細菌酵母提取物、30g/L NaCl和0. 4g/L MgSO4, pH 7. 0)，并在37°C培養18小時。通過將獲得的培養基離心(在6000rpm，2分鐘)來收集細菌，并懸于50 μ 1新鮮的LB-NaCl培養基。將此細胞懸液接種于先前以圓形接種S17-l/pUT sacB fucOFR的位置，并通過將接種的培養基在室溫放置30分鐘來干燥。然后，將細胞在37°C放置4小時以通過接合轉移將S17-1/ pUT_sacB_fucOFR 攜帶的 pUT_sacB_fucOFR 轉移至需鈉弧菌沘_15。將獲得的細菌細胞刮在一起，并懸于Iml LB-NaCl培養基，然后將其全部體積的懸液接種于TCBS瓊脂培養基(包含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，17g/L蔗糖，10g/L硫代硫酸鈉(五水合物)，10g/L檸檬酸鈉(二水合物)，3g/L膽酸鈉，lg/L檸檬酸鐵，10g/L氯化鈉，5g/L牛膽汁末，0. 04g/L溴百里酚藍，0. 05g/L百里酚藍，15g/l瓊脂以及10mg/L氯霉素，日水制藥公司，日本)上，并且培養在37°C進行18小時而形成黃色菌落。在TCBS培養基上，大腸桿菌無法增殖。此外，pUT_sacB_fuc0FR無法在需鈉弧菌觀-15中復制。因此， 獲得的菌落是通過在染色體上導入pUT_sacB_fUc0FR而獲得氯霉素抗性的需鈉弧菌觀-15 株的菌落。將該株接種于補充了 10% (w/v)蔗糖的LB-NaCl培養基，并允許菌落形成以獲得用在染色體上插入的pUT_sacB_fuc0FR的消除而破壞染色體上的fucO基因的需鈉弧菌 28-15 (需鈉弧菌28-15 Δ fucO)。使用由獲得的株以常規方式提取的染色體DNA作為模板 DNA,具有SEQ ID NO 9和10的序列的DNA作為引物，通過PCR來確認fucO基因的破壞。[實施例2]檢查需鈉弧菌28-15 Δ fucO的L-賴氨酸分解活性
通過電穿孔將pCABD2 (美國專利6，040, 160號說明書)導入需鈉弧菌 28-15 AfucO和需鈉弧菌沘-15。電穿孔是使用Gene pluser Xcell (BioRad公司，USA)， 以9kV/cm、25 μ F、200 Ω的脈沖條件進行的。 將獲得的需鈉弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2和需鈉弧菌^_15/pCABD2各自在 LB-NaCl瓊脂培養基(包含500mg/L鏈霉素)上在37°C培養10小時。將獲得的細胞刮在一起，接種于坂口燒瓶(500ml容量)中的20ml MS培養基(包含500mg/L鏈霉素)至0D660為 0. 1，并在37°C振蕩培養。每個株在3支燒瓶中進行培養。將培養基定期取樣Iml的體積，并測量0D660以及培養基中的葡萄糖濃度和L-賴氨酸濃度。使用分光光度計DU-800 (Beckman Coulter, USA)對于用2% (w/v) NaCl水溶液稀釋51倍的培養基測量0D660。使用Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co.，Ltd.，日本)測量培養基中葡萄糖濃度和L-賴氨酸濃度。[MS 培養基](終濃度)
葡萄糖40g/L (單獨滅菌)
MgSO4 · 7H201 g/L (單獨滅菌)
(NH4)2SO416 g/L
KH2PO41 g/L
酵母提取物2 g/L
FeSO40.01 g/L
MnSO40.01 g/L
CaCO330 g/L (單獨滅菌)
NaCl15g/L結果，對于需鈉弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2，觀察到蓄積了 IOmM的L-賴氨酸，并在葡萄糖完全消耗之后未觀察到L-賴氨酸的分解(圖1)。相反，對于fucO基因未破壞的株，雖然觀察到蓄積了最高3mM的L-賴氨酸，但在之后觀察到L-賴氨酸的分解。S卩，對于 fucO-缺陷株，與未缺失fucO基因的株相比，觀察到超過3倍高的L-賴氨酸蓄積，并且還抑制了 L-賴氨酸的分解。如上所述，表明fucO基因涉及需鈉弧菌中L-賴氨酸的分解的可能性。因此，需鈉弧菌的L-賴氨酸分解途徑可與從L-賴氨酸生成尸胺的途徑相異。[實施例3]然后，對于需鈉弧菌15 Δ fuc0/pCABD2，通過使用葡萄糖作為碳源在高鹽濃度下進行了 L-賴氨酸的生產。將需鈉弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2在LB-NaCl瓊脂培養基 (包含500mg/L鏈霉素)上在37°C培養8小時。將獲得的細胞刮在一起，接種入坂口燒瓶 (500ml容量)中的20ml MS培養基(包含500mg/L鏈霉素和0-8% (w/v) NaCl)至0D660 為0. 1，并在37°C振蕩培養。對于每個鹽濃度將株在3支燒瓶中進行培養。將培養基定期取樣Iml的體積，并測量0D660以及培養基中的葡萄糖濃度和L-賴氨酸濃度。使用分光光度計DU-800 (Beckman Coulter, USA)對于用2% (w/v)NaCl水溶液稀釋51倍的培養基測量 0D660。使用 Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co. ,Ltd.，日本)測量培養基中葡萄糖濃度和L-賴氨酸濃度。結果，在添加6% (w/v)NaCl的培養條件下觀察到蓄積了最高27mM L-賴氨酸，此時基于消耗的糖，L-賴氨酸得率為12% (w/w)(圖2)。[實施例4]然后，對于需鈉弧菌^-15Afuc0/pCABD2，通過使用甘油作為碳源進行了 L-賴氨酸的生產。具體而言，將需鈉弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2在LB-NaCl瓊脂培養基(包含 500mg/L鏈霉素)上在37°C培養8小時。將獲得的細胞刮在一起，并接種入20ml MS培養基(包含500mg/L鏈霉素，以及2% (w/v)或4% (w/v)NaCl)至0D660為0. 1，在37°C振蕩培養。使用純正化學公司(日本)生產的甘油作為碳源甘油。對于每個鹽濃度將株在3支燒瓶中進行培養。將培養基定期取樣Iml的體積，并測量0D660以及培養基中的甘油濃度和L-賴氨酸濃度。使用分光光度計DU-800 (Beckman Coulter, USA)對于用2% (w/v) NaCl 水溶液稀釋51倍的培養基測量0D660。使用Biosensor BF_5 (王子測定機器公司，日本) 測量培養基中的甘油濃度，并使用Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co. ,Ltd.，日本)測量L-賴氨酸濃度。結果，在添加4% (w/v) NaCl的培養條件下觀察到蓄積了最高30mM L-賴氨酸，并且基于消耗的甘油，L-賴氨酸得率為15% (w/w)(圖3)。[實施例5]除了使用需鈉弧菌野生型株ATCC14048株(NBRC15636、AJ13670)替代需鈉弧菌 28-15株而之外，以與實施例1用于獲得需鈉弧菌28-15 AfucO的相同的方式，獲得了破壞 7 fucO基因的VLD01株。[實施例6]對于需鈉弧菌^-15Afuc0/pCABD2、VLD01/pCABD2 以及需鈉弧菌 ATCC14048/ PCABD2，通過使用甘油作為碳源，在MS4Y培養基(其為過量補充酵母提取物的MS培養基) 中進行L-賴氨酸的生產。首先，將各株在LB-NaCl瓊脂培養基(包含500mg/L鏈霉素)上在37°C培養8小時。將獲得的細胞刮在一起，接種入20ml MS4Y培養基至0D660為0. 1，并在37°C振蕩培養。使用純正化學公司(日本)生產的甘油作為碳源甘油。各株在2支燒瓶中進行培養。將培養基定期取樣Iml的體積，并測量0D660以及培養基中甘油濃度和L-賴氨酸濃度。使用分光光度計DU-800 (Beckman Coulter，USA)對于用INHCl水溶液稀釋50 倍的培養基測量0D660。使用Biosensor BF_5 (王子測定機器公司，日本)測量培養基中的甘油濃度，并使用 Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co.，Ltd.，日本)測量 L-賴氨酸濃度。[MS4Y 培養基](終濃度)甘油40g/L (單獨滅菌)
MgSO4 · 7H201 g/L (單獨滅菌)
(NH4)2S0424 g/L
KH2PO41 g/L
酵母提取物8 g/L
FeSO40.01 g/L
MnSO40.01 g/L
CaCO330 g/L (單獨滅菌)
NaCl20 g/L (單獨滅菌)在過量補充酵母提取物的培養基中，需鈉弧菌28-15 Δ fuc0/pCABD2蓄積了 61mM 的L-賴氨酸(圖4)。在此情況中，基于消耗的甘油，L-賴氨酸得率為(w/w) 0此外， 對于VLD01/pCABD2，亦觀察到蓄積了 45mML_賴氨酸，而且基于消耗的甘油，L-賴氨酸收率為21% (w/w) 0對于需鈉弧菌ATCC14048/pCABD2基本上未觀察到L-賴氨酸的蓄積。[序列表說明]SEQ ID NO=I 需鈉弧菌的fucO基因的核苷酸序列SEQ ID NO 2 由需鈉弧菌的fucO基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 3 用于擴增sacB基因的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 4 用于擴增sacB基因的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 5 用于擴增fucO基因兩側0. 8kbp序列的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 6 用于擴增fucO基因兩側0. 8kbp序列的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 7 用于擴增fucO基因兩側0. 8kbp序列的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 8 用于擴增fucO基因兩側0. 8kbp序列的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 9 用于確證染色體上fucO基因的破壞的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 10 用于確證染色體上fucO基因的破壞的PCR引物的核苷酸序列SEQ ID NO 11 需鈉弧菌的AKO基因的核苷酸序列SEQ ID NO 12 由需鈉弧菌的AKO基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 13 需鈉弧菌的thrA基因的核苷酸序列SEQ ID NO 14 由需鈉弧菌的thrA基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 15 需鈉弧菌的metL基因的核苷酸序列SEQ ID NO 16 由需鈉弧菌的metL基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 17 需鈉弧菌的IysC基因的核苷酸序列SEQ ID NO 18 需鈉弧菌的IysC基因編碼的氨基酸序列SEQ ID NO 19 需鈉弧菌的推定AK基因的核苷酸序列SEQ ID NO 20 由需鈉弧菌的推定AK基因編碼的氨基酸序列產業上的利用可能性依照本發明的方法，可使用弧菌屬細菌高效地生產L-賴氨酸。具體而言，使用fucO基因有缺陷的弧菌屬細菌，抑制隨時間蓄積的L-賴氨酸的分解，從而可非常高效地蓄積L-賴氨酸。
權利要求
1.一種產生L-賴氨酸的方法，其包括在培養基中培養具有L-賴氨酸生產能力的弧菌屬(Vibrio)細菌，以在該培養基中或細菌細胞內產生并蓄積L-賴氨酸，并從該培養基或細胞收集L-賴氨酸，其中所述弧菌屬細菌經過修飾而減少了由fucO基因編碼的蛋白的活性。
2.權利要求1的方法，其中所述蛋白的活性是通過向fucO基因的編碼區和/或該基因的表達調控區中導入突變而減少的。
3.權利要求1或2的方法，其中破壞了染色體上的fucO基因。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述蛋白是如下述(A)或(B)所限定的蛋白(A)具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白，(B)具有在SEQID NO :2所示的氨基酸序列中包含一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，并且在細菌中活性減少時可改善L-賴氨酸生產能力的蛋白。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述fucO基因是如下述(a)或(b)所限定的DNA (a)包含SEQID NO 1的核苷酸序列的DNA，(b)與SEQID NO :1的核苷酸序列或能夠從該核苷酸序列制備的探針在嚴格條件下雜交，并編碼在細菌中活性減少時可改善L-賴氨酸生產能力的蛋白的DNA。
6.權利要求1至5中任一項的方法，其中一種或兩種或更多種選自下組的酶的活性得到增強二氫吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、二氫吡啶二羧酸還原酶和二氨基庚二酸脫氫酶。
7.權利要求1至6中任一項的方法，其中所述弧菌屬細菌是需鈉弧菌(Vibrio natriegens)0
8.權利要求1至7中任一項的方法，其中所述培養基含有甘油作為碳源。
9.一種弧菌屬細菌，其具有L-賴氨酸生產能力，并經過修飾而減少了由fucO基因編碼的蛋白的活性。
10.權利要求9的弧菌屬細菌，其為需鈉弧菌。
全文摘要
通過如下產生L-賴氨酸在培養基中培養具有產生L-賴氨酸的能力，并經修飾使得由fucO基因編碼的蛋白活性降低的弧菌屬細菌以在培養基或細菌細胞中產生和蓄積L-賴氨酸，并從培養基或細胞收集L-賴氨酸。
文檔編號C12N1/21GK102471791SQ20108003456
公開日2012年5月23日 申請日期2010年6月28日 優先權日2009年8月3日
發明者井之上一平, 安枝壽 申請人:味之素株式會社