專利名稱：靈芝屬內重組的真菌免疫調節蛋白基因、該基因編碼的蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基因工程技術領域的基因及其應用，具體是一種重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的基因、該基因編碼的蛋白及其應用。
背景技術：
真菌免疫調節蛋白是從高等真菌的子實體中提取的、與植物凝集素和免疫球蛋白的結構及免疫功能相似的一類小分子蛋白質。自1989年日本學者Kino等從赤靈芝Oianoderma lucidium)子實體中分離提取出第一個真菌免疫調節蛋白(LZ-8)以來， 已分別從松杉靈芝(G. tsugae)、金針菇(Flammulina velutipes)、草菇(Volvariella volvacea)、紫芝(G. japoncium)、小孢靈芝(G. microsporum)以及中國紫芝(G. sinense)中分離得到了七種 FIPs，即 LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FIP-gja、FlP-gmi 和FlP-gsi，形成了一個新的蛋白質家族——Fib。林忠平等在《遼寧師范大學學報(自然科學版)》2006年第1期83-87頁發表了題為《真菌免疫調節蛋白(FIP)結構與功能研究》一文，文中評述，真菌免疫調節蛋白家族成員的一級結構有著60% 70%的同源性，該家族蛋白也具有相似的免疫調節功能，如FIP能夠促進人外周血淋巴細胞和小鼠脾細胞的有絲分裂；誘導脾淋巴細胞產生細胞因子；減少抗原誘導型抗體的形成以及抑制非胖糖尿病小鼠的自身免疫。但是，不同的真菌免疫調節蛋白家族成員在氨基酸序列上仍然存在著一定的差異，其免疫調節功能在體內與體外也有不同程度的表現。此外，在真菌免疫調節蛋白進行重要的免疫調節功能的同時，并未表現出對機體的負面效應。因此，該蛋白家族在藥物臨床應用方面存在著巨大的潛在應用價值。然而值得注意的是，由于天然的真菌免疫調節蛋白產量較低，如Kino，K.等在《Journal of Biological Chemistry》(生物化學雜志)1989 年第 1 期 472 478 頁發表了題為《Isolation and characterization of a new immunomodulatory protein, ling zhi-8 (LZ-8), from Ganoderma lucidium))(從赤芝中分離和描述了一種新的免疫調節蛋白lingzhi-8(LZ-8)) —文，文中評述，340g靈芝菌絲體中僅分離純化得到5 IOmg的LZ-8。并且分離純化工藝成本較高且費時，所以，應用基因工程思路改造真菌免疫調節蛋白基因，并采用可大規模生產化的工程菌有效表達， 就具有著重要的研究意義和實際價值。利用基因工程手段，將真菌免疫調節蛋白在微生物以及植物中高效表達的報道已經屢見不鮮。例如，白杰英等在《分子植物育種》2006年第 5期645-649頁發表了題為《靈芝LZ-8在煙草中的表達及產物特性的初步研究》一文，文中評述，LZ-8 (FIP-glu)在大腸桿菌中的表達量約為36. 46mg/L，在煙草中的表達量約為 149μ g/g鮮葉片；李奇璋等在《西北植物學報》2010年第1期35-40頁發表了題為《紫芝免疫調節蛋白基因的原核表達與功能分析》一文，文中評述，在大腸桿菌中表達的FlP-gsi約占大腸桿菌總蛋白的46. 1%。對真菌免疫調節蛋白基因進行改造，提高FIP在原核生物中的表達，以及提高FIP 的生物學活性，是FIP應用于工業化生產的重要途徑之一。DNA改組技術是一種非常有效的分子水平的體外定向進化技術。實際上是一種依賴于PCR的體外誘變技術，其過程是將單基因或相關基因家族的靶序列隨機性的片段化之后，根據這些小片段之間一定程度的同源性，通過PCR技術將其合成為嵌合基因，然后進行高通量的篩選以期得到理想的突變體。與隨機突變、盒式突變以及同源重組相比，以DNA重組技術為基礎的DNA改組技術能夠獲得更加多樣性的突變文庫及更高的適應性。目前國內外尚未發現有利用基因重組技術對靈芝真菌免疫調節蛋白進行重組并獲得有效蛋白的報道。
發明內容
本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種靈芝屬內重組的真菌免疫調節蛋白基因、該基因編碼的蛋白及其應用。重組后的基因表達于大腸桿菌獲得目的蛋白，并且證明其仍然能具有很好的免疫調節活性，這對于FIP的大規模生產與作為藥物或其他健康產品的應用提供了一種新的思路與探索途徑。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及一種重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，該核苷酸序列，具有與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-333位的核苷酸序列有至少85%
的同源性；或能在中度嚴謹條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-333位的核苷酸序列雜 、-父。所述的中度嚴謹條件是指核苷酸序列之間能在2XSSC(0.3M檸檬酸鈉，3M氯化鈉，ρΗ7· 0) mo.1% SDS 的條件下。本發明涉及一種重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。所述的靈芝屬內真菌免疫調節蛋白是指赤芝(G. Iucidium)真菌免疫調節蛋白和紫芝(G. sinense)真菌免疫調節蛋白。本發明涉及上述重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白在促血紅細胞凝集、誘導細胞因子轉錄或表達中的應用，包括用于促小鼠血紅細胞凝集以及用于誘導小鼠脾細胞轉錄或表達細胞因子。本發明的重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因所編碼的重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白在大腸桿菌中的表達量比同樣在大腸桿菌中表達的赤芝真菌免疫調節蛋白和紫芝真菌免疫調節蛋白的表達量有所提高，提高到1 % 204%。并且重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因表達載體構建容易，表達方法簡單，只需添加少量IPTG即可實現大量穩定的表達。表達蛋白的分離純化過程簡單，制備得到的重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白可以促小鼠血紅細胞凝集以及誘導小鼠脾細胞細胞因子轉錄表達。本發明具有重要的實際應用價值。本發明中所涉及的大腸桿菌M15已在《和生琦，丁國富，李斌，李軍，羅平，董燕，張蓉，顏偉，周紅；青霉素結合蛋白加C-末端在大腸桿菌M15中的表達、純化及鑒定，創傷外科雜志，2007，9(1) :28-31》中公開；本發明中涉及的M15大腸桿菌菌株可通過公開市售的商業渠道取得，如北京博邁德科技發展有限公司，公司地址北京市海淀區西四環中路甲59號。
圖1基因片段重組電泳圖。圖2菌落雜交篩選圖。圖3重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因序列比對圖。圖4重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白氨基酸序列比對圖。圖5重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白電泳圖。圖6重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白Western Blot檢測圖。圖7重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白血液凝集圖。圖8重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白誘導細胞因子轉錄電泳圖。
具體實施例方式下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的基因重組1.片段合成根據大腸桿菌偏愛密碼子，在不改變其蛋白質序列的前提下，將赤芝真菌免疫調節蛋白基因(FlP-glu)和紫芝真菌免疫調節蛋白基因(FlP-gsi)重新編碼。將按照大腸桿菌偏愛密碼子重新編碼的FlP-glu和FlP-gsi基因按照其DNA順序分割成50 60bp長短的片段，每相鄰的兩個片段之間有約18bp的核苷酸重疊(SEQ ID N0. 3至SEQ ID N0. 20)， 并且合成這些片段。2.無引物 PCR將如SEQ ID N0. 3至SEQ ID N0. 20所示的寡聚核苷酸等量混合。利用KOD plus 聚合酶(日本東洋紡)對混合的基因片段進行PCR反應。反應體系中無引物。反應程序為94°C預變性anin后，按照94°C，1 ；55°C,15s ；72°C,25s進行20個循環，最后72°C延伸7min。用小量DNA膠回收試劑盒(Bio Basic Inc)分別純化PCR產物，得到產物I。3.有引物 PCRA.引物合成根據靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因核苷酸序列比對結果，設計并合成如下引物SN-F GGCTCTAGAGCCGAGCTCGCGGGATCCATGAGCGATACCGCGCTGATTTTTCG (下劃線為 BamH I
酶切位點)SN-R CCGGAATTCCGGAACTGCAGAACCCCAAGCTTTTAGTTCCACTGCGCAATAATAAAATC (下劃線為 Hind III酶切位點)
將SN-F與SN-R等體積混合，獲得引物SN。B.靈芝屬內基因重組將實施例1. 2中獲得的產物I稀釋10倍做為模板，實施例1. 3中獲得的引物SN做為引物進行PCR擴增。反應程序為94°C預變性aiiin后，按照94°C，30s ；5530s ；72°C, 40s進行10個循環，最后72°C延伸lOmin。將PCR擴增產物用小量DNA膠回收試劑盒(Bio Basic Inc)純化，獲得產物II，如圖1所示。實施例2、重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因表達載體的構建及篩選將實施例1. 3中獲得的產物II經限制性內切酶BamH I和Hind III酶切過夜，并且與經同樣限制性內切酶酶切的表達載體PQE-30連接。將構建好的表達載體轉化大腸桿菌M15宿主細胞，用含有lOOmg/mL的羧芐西林鈉及50mg/mL的卡那霉素的LB平板篩選轉化子。提取克隆質粒，即得到重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白表達載體。所得到的轉化子即為重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因重組文庫。將重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因轉化子進行篩選。待轉化子菌落生長至直徑為Imm時，將菌落在PVDF膜上做印記。之后將膜移至含有lOOmg/mL羧芐西林鈉、50mg/mL卡那霉素以及ImM IPTG的LB平板上，克隆面朝上，與印記后的平板同時在37°C下培養4 他。取出PVDF膜做Wfestern blot檢測。一抗使用真菌免疫調節蛋白抗體，稀釋倍數為1 10，000;二抗選用堿性磷酸酶標記的羊抗兔IgG，稀釋倍數為1 10，000。顯色后，選擇在PVDF膜上顏色較深的點所對應的克隆(圖 2)。重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因轉化子篩選得到的克隆中含有的表達載體，即為重組載體PQE30-FIP-SN。將所選擇的克隆送上海桑尼生物工程有限公司測序鑒定。測序結果表明，重組載體PQE30-FIP-SN所編碼的重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的核苷酸序列， 其開放閱讀框(ORF)為序列表中SEQ IDN0. 1中從核苷酸第1_333位的核苷酸序列(圖3 所示為重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的核苷酸序列與FlP-glu和FlP-gsi基因序列比對圖)，編碼氨基酸序列為序列表中SEQ ID N0. 2所述的氨基酸序列(圖4所示為重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白氨基酸序列與FlP-glu和FlP-gsi氨基酸序列比對圖)。提取克隆質粒，即得到重組表達載體PQE30-FIP-SN。實施例3、重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的誘導表達與純化1.重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的誘導表達及Western blot檢測將實施例2中獲得的單克隆接種于含有lOOmg/mL的羧芐西林鈉及50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養基中，37°C振搖培養過夜。次日以2%接種量接種于較大體積培養液。37°C繼續培養，至0D600達到0. 5 0. 7時，加入IPTG，使IPTG的終濃度達到ImM。 培養后，將所取得菌液樣品5，OOOrpm離心20min以收集菌體。去上清，菌體用IOOyL 2X SDS-PAGESample buffer (IOOmM pH 6. 8Tris-Cl,4% (ff/V) SDS,0. 2% (ff/V)BPB,20% (ff/V) glycerine, 2% (ff/V) β -ME)懸浮，并在95°C水浴鍋中保溫5min。之后再分別用兩塊 15% SDS-PAGE膠檢測。一塊用于考馬斯亮藍染色(圖5)，另一塊用于Western blot檢測 (圖6)。圖5所示，為含有重組表達載體PQE30-FIP-SN的大腸桿菌M15細胞經IPTG誘導蛋白表達電泳圖。箭頭所示即為重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白。圖6為重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白Western Blot檢測。經大腸桿菌發酵，重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的產量提高到1 % 204%。2.重組真菌免疫調節蛋白的分離純化
將經過IPTG誘導的菌液5，OOOrpm離心20min以收集細胞，用1/10體積的Lysis buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, IOmM imidazole, pH 8.0)懸浮；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化；將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎，200 300W超聲6次，每次10s，期間間隔IOs ；超聲處理過的菌液于4°C下12，OOOrpm離心20 30min ； 取上清，使用Ni-NTA柱純化(預先用10倍柱體積的Lysis buffer平衡)；用20倍柱體積的 Wash buffer (50mMNaH2P04, 300mM NaCl,20mM imidazole, pH 8.0)洗柱；目的蛋白由 Elution buffer (50mMNaH2P04, 300mM NaCl,250mM imidazole, pH 8.0)洗脫出來。實施例4、重組真菌免疫調節蛋白促小鼠血紅細胞凝集昆明小鼠心臟取血，1，200rpm離心5min,并用PBS洗滌3次，每次1，200rpm離心 5min收集血細胞，最后用PBS配制成1.5% (V/V)的血紅細胞溶液。在96孔U型板內加入 100 μ Li. 5%的血細胞，并按照倍比稀釋法加入100 μ L重組真菌免疫調節蛋白溶液，使重組蛋白的終濃度從0. 03 μ g/mL到50 μ g/mL。并以ConA蛋白作為陽性對照，PBS做為陰性對照，37°C培養。結果如圖7顯示重組真菌免疫調節蛋白血液凝集實驗。其中A表示重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白凝血反應，B為陰性對照，C為陽性對照。實施例5、重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白誘導小鼠脾細胞細胞因子的轉錄表達1.細胞培養取雄性昆明小白鼠0 8周齡)，采用頸部脫臼法處死，取出脾臟，在RPMI 1640 培養基中研磨至碎，過濾網Ooo目)，4°〇，1，500印111離心3 51^11;用紅細胞裂解液(碧云天公司)輕輕懸浮沉淀，4°C，1，500rpm離心3 5min ；RPMI 1640培養基洗滌沉淀兩次， 40C，1，500rpm離心3 5min ；RPMI 1640培養基輕輕懸浮細胞，血細胞計數板計數，確定細胞濃度。用RPMI1640培養基將細胞濃度稀釋至1 X IO7個/mL，分別加入重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白至濃度為0 μ g/mL、0. 5 μ g/mL、1 μ g/mL、2 μ g/mL、3 μ g/mL,于M孔細胞培養板中培養4h。2. RT-PCR 檢測A. RNA 提取采用柱離心式小量總RNA抽提試劑盒(華舜公司)，分別提取與不同濃度重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白共培養的小鼠脾細胞總RNA。B.引物設計根據文獻中報道的細胞因子核苷酸序列，設計并合成如下引物IL-2F :TTCAAGCTCCACTTCAAGCTCTACAGCGGAAGIL-2R :GACAGAAGGCTATCCATCTCCTCAGAAAGTCCIL-4F :ATGGGTCTCAACCCCCAGCTAGTIL-4R GCTCTTTAGGCTTTCCAGGAAGTCIFN- γ F TGAACGCTACACACTGCATCTTGG
IFN-yR CGACTCCTTTTCCGCTTCCTGAGTNF- α F :ATGAGCACAGAAAGCATGATCCGCTNF- α R CCAAAGTAGACCTGCCCGGACTCβ -actinF GTGGGCCGCTCTAGGCACCAAβ -actinR CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC
C. RT-PCR 反應采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV)，對重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白誘導小鼠脾細胞細胞因子的轉錄水平進行檢測。反應程序IL-2 :50°C 30min, RT 反應；94°C 2min, RNase 失活；94°C變性 30s ；65°C退火 30s ； 72°C延伸40s，共25個循環。IL-4 :50°C 30min, RT 反應；94°C 2min, RNase 失活；94°C變性 30s ；65°C退火 30s ； 72°C延伸40s，共30個循環。IFN-y :50°C 30min, RT 反應；94°C 2min, RNase 失活；94°C 變性 30s ；60°C 退火 30s ；72°C延伸40s，共25個循環。TNF-α :50 °C 30min, RT 反應；94°C 2min, RNase 失活；94°C 變性 30s ；60°C 退火 30s ；72°C延伸40s，共25個循環。結果如圖8所示為，重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白誘導小鼠脾細胞產生細胞因子電泳圖。從圖中可以看出，重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白能夠誘導小鼠脾細胞產生細胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α及IL-4。并且，重組蛋白的濃度與細胞因子的轉錄水平呈現一定的劑量關系。說明重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白具有一定的免疫調節作用。
權利要求
1.一種重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示 ο
2.根據權利要求1所述的重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白，其特征是，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
3.一種根據上述任一權利要求所述重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白在促血紅細胞凝集、誘導細胞因子轉錄或表達中的應用，其特征在于，包括用于促小鼠血紅細胞凝集以及用于誘導小鼠脾細胞轉錄或表達細胞因子。
全文摘要
一種基因工程技術領域的重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的基因、該基因編碼的蛋白及其應用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的蛋白質氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明對靈芝屬內真菌免疫調節蛋白基因進行重組，重組后的基因表達于大腸桿菌獲得目的蛋白，并且證明其仍然具有很好的免疫調節活性。這對于FIP的大規模生產與作為藥物或其他健康產品的應用提供了一種新的思路與探索途徑。
文檔編號C12N15/31GK102199201SQ20111006876
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月22日 優先權日2011年3月22日
發明者叢蔚然, 周選圍, 李奇璋, 王雪飛, 蘇愷琪 申請人:上海交通大學