專利名稱：一種分離脂肪中無脂滴的有核細胞的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于體外分離純化脂肪組織中無脂滴的有核細胞的方法和試劑盒。
背景技術：
脂肪組織中的干細胞種類與數量僅次于骨髓組織，是人體的第二大干細胞庫。臨床采集骨髓和采集腹部的脂肪，兩者相比，采集脂肪病人更容易接受，相比而言痛苦也小一點。近年來減肥的吸脂手術后可獲得大量的脂肪，這些脂肪為干細胞分離提取提供了非常便捷的來源。本試劑盒采用的方法法可將妨礙細胞生長的細胞間質包括基質、纖維等去除，使細胞分散，形成懸液，易于從外界吸收養分和排除代謝產物，這樣就可以很快得到大量活 細胞，細胞也可以在短時間內生長成片。現有技術中從脂肪中分離純化干細胞的方法存在著干細胞活率及回收率較低等缺點。
發明內容
本發明涉及一種用于體外分離純化脂肪組織中無脂滴的有核細胞的試劑盒以及該試劑盒的使用方法。采用本發明的試劑盒從脂肪中分離純化干細胞干細胞活率高及回收率高。本發明所述的試劑盒包括各自隔離包裝的消化液、純化液和懸浮液，其中消化液是溶于生理鹽水的蛋白酶，其重量體積濃度為0. 25% ;純化液是溶于生理鹽水的聚蔗糖，其重量體積濃度為10% ;懸浮液是生理鹽水，優選地，各自獨立包裝。本發明所述的試劑盒，其中所述的消化液純化液懸浮液的體積比為(20-1500) (10-45) 20。本發明的試劑盒其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟(I)將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻；(2)將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時；(3)孵育完成后，用100目的濾網過濾混合溶液；(4)將混合溶液以離心力400xg(轉速1500rpm) IOmin的條件下離心，去除上清；(5)用IOOml生理鹽水重懸沉淀細胞；(6)將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg (轉速2000rpm)，20分鐘離心；(7)離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,離心力400xg (轉速1500rpm), 8分鐘離心洗漆細胞兩次；(8)將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。
本發明所述的試劑盒，用于體外分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞。本試劑盒利用蛋白酶分解脂肪的原理，采用梯度離心法分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞。本發明所述的試劑盒，使用的樣品類型為用于體外分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞，可以按照通用的方法收集脂肪樣本；脂肪收集后應在6小時內進行分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞。本發明所述的試劑盒，回收率可以達到》90%，分離的有核細胞活率> 96%，最大程度地維持了干細胞在體外微環境的恒定。本發明還公開了所述試劑盒的使用方法，包括如下步驟(I)將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻； (2)將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時； (3)孵育完成后，用100目的濾網過濾混合溶液；(4)將混合溶液以離心力400xg (轉速1500rpm) IOmin的條件下離心，去除上清；(5)用IOOml生理鹽水重懸沉淀細胞；(6)將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg (轉速2000rpm)，20分鐘離心；(7)離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,離心力400xg (轉速1500rpm), 8分鐘離心洗漆細胞兩次；(8)將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。本發明的細胞活率是采用如下方法進行檢測的I吸管吸取90微升分離純化后脂肪中無脂滴的有核細胞懸液。2加入0. 2%的臺盼藍染色液10微升，混勻。3靜置3分鐘。4吸取混合溶液，滴一滴至細胞計數板，均勻鋪開后，顯微鏡下觀察。5顯微鏡下計數，藍染的細胞為死細胞(A)，無染色的細胞為活細胞(B)。有核細胞活率=B/(A+B)*100%
具體實施例方式實施例I細胞處理試劑盒(脂肪)的制備方法消化液的制備125g蛋白酶溶解在50000ml生理鹽水中，濃度為0. 25%，37°C水浴，從水浴鍋溫度穩定在37°C開始計時8小時。37°C水浴8小時后，從水浴鍋中取出，室溫半小時，用量筒量取500ml，裝入試劑瓶中，貼好標簽，然后置于包裝盒中。純化液的制備聚蔗糖450g溶解在生理鹽水4500ml中，濃度為10%，37°C水浴，從水浴鍋溫度穩定在37°C開始計時8小時。37°C 8小時后，從水浴鍋中取出，室溫半小時，用量筒量取45ml，裝入試劑瓶中，貼好標簽，然后置于包裝盒中。懸浮液的制備生理鹽水2000ml 37°C水浴，從水浴鍋溫度穩定在37°C開始計時8小時。37°C 8小時后，從水浴鍋中取出，室溫半小時，用量筒量取20ml，裝入試劑瓶中，貼好標簽，然后置于包裝盒中。
細胞處理試劑盒(脂肪)F500型說明書廣品名稱通用名細胞處理試劑盒(脂肪)英文名CellIsolation Kit包裝規格F500型消化液500ml純化液45ml懸浮液20ml預期用途用于體外分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞作用原理利用蛋白酶分解脂肪的原理，采用梯度離心法分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞。
主要組成組份L消化液(蛋白酶和磷酸鹽緩沖液)2.純化液(聚蔗糖和生理鹽水)3.懸浮液(生理鹽水)貯存條件及有效期2-8°C保存，有效期24個月。適用儀器低溫離心機、離心管和移液管要求使用一次性產品(使用者自備，推薦使用無菌產品)。樣本要求
本方法推薦的樣品類型為脂肪； 按照通用的方法收集所需的脂肪樣本； 脂肪收集后應在6小時內進行分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞； 微生物污染的樣本對測定結果的影響尚未確定。試驗方法本試劑盒可分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞。細胞回收率和活率檢測I吸管吸取90微升分離純化后脂肪中無脂滴的有核細胞懸液。2加入0. 2%的臺盼藍染色液10微升，混勻。3靜置3分鐘。4吸取混合溶液，滴一滴至細胞計數板，均勻鋪開后，顯微鏡下觀察。5顯微鏡下計數，藍染的細胞為死細胞(A)，無染色的細胞為活細胞(B)。有核細胞活率=B/(A+B)*100%操作步驟I將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻。2將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時。3孵育完成后，用100目的濾網過濾混合溶液。4將混合溶液以離心力400xg (轉速1500rpm) IOmin的條件下離心，去除上清。5用IOOml生理鹽水重懸沉淀細胞。6將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉速2000rpm), 20分鐘離心。5離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,離心力400xg(轉速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細胞兩次。6將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。
正常參考值分離脂肪中無脂滴的有核細胞活率>96%。注意事項
本品用于體外分離純化脂肪中無脂滴的有核細胞； 操作前應仔細閱讀使用說明書，嚴格按說明書的操作程序進行； 各試劑使用前應觀察有無渾濁，如有則應更換試劑，嚴格控制每步離心的時間和溫度。
權利要求
1.一種用于體外分離脂肪中無脂滴的有核細胞的試劑盒，包括各自隔離包裝的消化液、純化液和懸浮液，其中消化液是溶于生理鹽水的蛋白酶，其重量體積濃度為0. 25% ;純化液是溶于生理鹽水的聚蔗糖，其重量體積濃度為10% ;懸浮液是生理鹽水。
2.如權利要求I的試劑盒，其中所述的消化液、純化液和懸浮液各自獨立包裝。
3.如權利要求2的試劑盒，其中所述的消化液純化液懸浮液的體積比為(20-1500) (10-45) 20。
4.如權利要求1-3的任一權利要求所述的試劑盒，其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟 (1)將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻； (2)將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時； (3)孵育完成后，用100目的濾網過濾混合溶液； (4)將混合溶液以離心力400xg(轉速1500rpm)IOmin的條件下離心，去除上清； (5)用IOOml生理鹽水重懸沉淀細胞； (6)將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉速2000rpm)，20分鐘離心； (7)離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C，離心力400xg(轉速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細胞兩次； (8)將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。
5.如權利要求1-4的試劑盒的使用方法，包括如下步驟 (1)將抽取的500ml脂肪與500ml消化液完全混勻； (2)將混合溶液放置到37°C的水浴箱中，孵育I小時； (3)孵育完成后，用100目的濾網過濾混合溶液； (4)將混合溶液以離心力400xg(轉速1500rpm)IOmin的條件下離心，去除上清； (5)用IOOml生理鹽水重懸沉淀細胞； (6)將純化液按每管15ml加到50ml離心管中，將第5步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4 °C，離心力710 X g (轉速2000rpm)，20分鐘離心； (7)離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C，離心力400xg(轉速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細胞兩次； (8)將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。
全文摘要
本發明涉及一種分離脂肪中無脂滴的有核細胞的試劑盒。本發明所述的試劑盒包括各自隔離包裝的消化液、純化液和懸浮液，其中消化液是溶于生理鹽水的蛋白酶，其重量體積濃度為0.25％；純化液是溶于生理鹽水的聚蔗糖，其重量體積濃度為10％；懸浮液是生理鹽水。本發明還涉及該試劑盒的使用方法。采用本發明的試劑盒從脂肪中分離純化干細胞干細胞活率高及回收率高。
文檔編號C12N5/0775GK102747031SQ201110097318
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者蔡云松, 遲明國 申請人:北京同盛頤和生物科技有限公司