專利名稱：一種體外分離有核細胞且能去除紅細胞的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于體外分離純化骨髓、臍帶血或外周血中有核細胞并且能去除紅細胞的方法和試劑盒。
背景技術：
干細胞是具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞，是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的原始細胞。干細胞可以從骨髓、臍帶血和外周血中分離純化干細胞，單個核細胞常用的分離方法主要有以下幾種6%羥乙基淀粉沉降法、甲基纖維素沉降法、Ficoll分離法、Percoll分離法、3%明膠分離法、氯化銨溶解紅細胞法，直接離心法等。常用的單核細胞的分離方法為Ficoll或Percoll直接分離法。即將血液稀釋后直接加于分離液上經密度梯度離心獲得單個核細胞。Ficoll和Percoil均為常用的淋巴細胞分離液，有人曾對這兩種分離液對比研究，認為Ficoll分離獲得的單個核細胞最為純凈。 現有技術中從骨髓、臍帶血和外周血中分離純化干細胞的方法存在著干細胞活率及回收率較低等缺點，并且不能裂解其中的紅細胞。我們的實驗通過對比研究認為，采用6%羥乙基淀粉結合Ficoll用于分離血液中單核細胞提高了單核細胞的回收率，但是還是混有紅細胞。為此利用氯化銨溶解紅細胞法，能夠全部裂解紅細胞的方法。
發明內容
本發明提供了一種用于體外分離純化骨髓、臍帶血或外周血中有核細胞并且能去除紅細胞的試劑盒以及該試劑盒的使用方法。本發明所述的試劑盒包括各自隔離包裝的沉淀液、純化液、懸浮液和紅細胞裂解液，其中沉淀液是溶于生理鹽水的羥乙基淀粉，其重量體積濃度為6%，純化液是聚蔗糖泛影鈉，懸浮液是生理鹽水，紅細胞裂解液是7. 47g/L的氯化銨+2. 6g/L的三羥甲基氨基甲烷。所謂隔離包裝是指沉淀液、純化液和懸浮液各自密封在互不相通的容器中，優選地，各自獨立包裝。本發明所述的試劑盒，其中所述的沉淀液純化液懸浮液和紅細胞裂解液的體積比為(40-180) (60-180) : 20 : I。本發明的試劑盒其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟(I)將經過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘。(2)用IOml的移液管將上清液轉到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細胞沉淀，并配平。(3)將兩個離心管4°C，離心力710xg (轉速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄
去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細胞。
(4)將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉速2000rpm) ,20分鐘離心,關閉離心機剎車功能。(5)離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,配平。離心力400xg(轉速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細胞兩次。(6)棄上清，向細胞沉淀中加入紅細胞裂解液輕輕吹打15 20s混勻。(7)4°C,離心力400xg(轉速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細胞三次；(8)將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。本發明所述的試劑盒，用于體外分離純化骨髓/臍帶血/外周血中有核細胞。它利用細胞與無機鹽離子聯合聚集沉淀的原理，采用逆向收集法分離純化有核細胞。本發明 的試劑盒通常在2-8 °C保存。本發明所述的試劑盒，使用的樣品類型為骨髓/臍帶血/外周血，可以按照通用的方法收集所需的骨髓/臍帶血/外周血樣本；確保骨髓/臍帶血/外周血收集后轉入一次性抗凝血袋；骨髓/臍帶血/外周血收集后應在6小時內進行分離純化有核細胞。本發明所述的試劑盒，回收率可以達到》90%，分離的有核細胞活率> 96%，最大程度地維持了干細胞在體外微環境的恒定。本發明還公開了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟(I)將經過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘。(2)用IOml的移液管將上清液轉到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細胞沉淀，并配平。(3)將兩個離心管4°C，離心力7IOxg (轉速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄
去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細胞。(4)將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉速2000rpm) ,20分鐘離心,關閉離心機剎車功能。(5)離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C,配平。離心力400xg(轉速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細胞兩次。(6)棄上清，向細胞沉淀中加入紅細胞裂解液輕輕吹打15 20s混勻。(7) 4°C,離心力400xg (轉速1500rpm), 8分鐘離心洗漆細胞三次；(8)將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。本發明的細胞活率是采用如下方法進行檢測的I.吸管吸取90微升分離后的有核細胞懸液。2.加入0. 2%的臺盼藍染色液10微升，混勻。3 靜置3分鐘。4.吸取混合溶液，滴一滴至細胞計數板，均勻鋪開后，顯微鏡下觀察。5.顯微鏡200倍下人工計數，藍染的細胞為死細胞(A)，無染色的細胞為活細胞(B)。有核細胞活率=B/(A+B)*100%
具體實施例方式實施例I細胞處理試劑盒的制備方法沉淀液的制備羥乙基淀粉2. 40g溶解在生理鹽水40ml中，濃度為6%，37°C水浴，從水浴鍋溫度穩定在37°C開始計時8小時，37°C水浴8小時后，從水浴鍋中取出，室溫半小時，保存。純化液的制備HIST0PAQUE1077液(聚蔗糖泛影鈉)60ml，從冰箱溫度穩定在4°C開始計時8小時。4°C 8小時后，從4度冰箱中取出，室溫半小時，保存。懸浮液的制備用量筒量取20ml生理鹽水，保存。
紅細胞裂解液的制備3. 735g氯化銨、I. 3g三羥甲基氨基甲烷，加水溶解并稀釋至500ml。0. 22iim濾膜過濾除菌，4°C保存。
權利要求
1.體外分離純化有核細胞且能去除紅細胞的試劑盒，包括各自隔離包裝的沉淀液、純化液、懸浮液和紅細胞裂解液，其中沉淀液是溶于生理鹽水的羥乙基淀粉，其重量體積濃度為6%，純化液是聚蔗糖泛影鈉，懸浮液是生理鹽水，紅細胞裂解液是7. 47g/L的氯化銨+2. 6g/L的三羥甲基氨基甲烷。
2.如權利要求I的試劑盒，其中所述的沉淀液、純化液、懸浮液和紅細胞裂解液和懸浮液各自獨立包裝。
3.如權利要求2的試劑盒，其中所述的沉淀液純化液懸浮液和紅細胞裂解液的體積比為(40-180) (60-180) : 20 : I。
4.如權利要求1-3的任一權利要求所述的試劑盒，其中所述試劑盒中還包括使用說明書，所述說明書載明了所述試劑盒的使用方法，所述方法包括如下步驟 (1)將經過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘； (2)用IOml的移液管將上清液轉到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細胞沉淀，并配平； (3)將兩個離心管4°C，離心力710xg(2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細胞； (4)將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg(轉速2000rpm) ,20分鐘離心,關閉離心機剎車功能； (5)離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C，配平。離心力400xg(轉速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細胞兩次； (6)棄上清，向細胞沉淀中加入紅細胞裂解液輕輕吹打15 20s混勻； (7)4°C，離心力400xg(轉速1500rpm)，8分鐘離心洗滌細胞三次； (8)將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。
5.如權利要求1-4的試劑盒的使用方法，包括如下步驟 (1)將經過抗凝處理的骨髓/臍帶血/外周血倒入沉淀液試劑瓶中，擰緊瓶蓋顛倒混勻5次，擰松瓶蓋，靜置22-25分鐘； (2)用IOml的移液管將上清液轉到50ml的離心管中，每管25ml，盡量不要吸到紅細胞沉淀，并配平 (3)將兩個離心管4°C，離心力710xg(轉速2000rpm)，5分鐘離心，離心完畢后，棄去上清，用手指輕輕震開沉淀，每管加25ml生理鹽水重懸細胞； (4)將純化液按每管25ml加到另外兩個50ml新的離心管中，將第3步中的細胞懸液用移液管緩慢加到純化液的液面上，保證兩種液體之間的液面清晰，然后，4°C，離心力710xg (轉速2000rpm), 20分鐘離心,關閉離心機剎車功能； (5)離心后，吸取中間層細胞，加到新的離心管中，用50ml注射用生理鹽水稀釋，4°C，配平。離心力400xg(轉速1500rpm) ,8分鐘離心洗漆細胞兩次； (6)棄上清，向細胞沉淀中加入紅細胞裂解液輕輕吹打15 20s混勻； (7)4°C，離心力400xg(轉速1500rpm)，8分鐘離心洗滌細胞三次； (8)將洗后的細胞加到懸浮液中，備用。
全文摘要
體外分離純化有核細胞且能去除紅細胞的試劑盒，包括各自隔離包裝的沉淀液、純化液、懸浮液和紅細胞裂解液，其中沉淀液是溶于生理鹽水的羥乙基淀粉，其重量體積濃度為6％，純化液是聚蔗糖泛影鈉，懸浮液是生理鹽水；紅細胞裂解液是7.47g/L的氯化銨+2.6g/L的三羥甲基氨基甲烷。本發明還提供了所述試劑盒的使用方法。
文檔編號C12N5/0786GK102747035SQ20111009731
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者蔡云松, 遲明國 申請人:北京同盛頤和生物科技有限公司