一種酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法
【專利摘要】一種酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，包括7-ACCA在水相經由氨水調溶后，加入固定化酶，保持溫度10～35℃，滴加入苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽或苯甘氨酸甲酯甲磺酸鹽，不斷保持反應pH值，pH值范圍在5.5～7.5，隨著酶化反應的發生，生成的頭孢克洛不斷從體系中析出，將酶催化液不斷采用過濾分離的辦法，將固定化酶M-1與頭孢克洛分離，母液循環回反應器，直至7-ACCA完全反應，將所得的頭孢克洛濕品純化即得頭孢克洛。本發明在頭孢克洛的析出過程中，即將頭孢克洛從酶促反應液中分離出來，從而解決了酶催化反應的分離、反應濃度問題。
【專利說明】一種酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，特別涉及一種由頭孢克洛母核7-ACCA經生物酶法與苯甘氨酸衍生物在水相中直接生物催化合成頭孢克洛的分離、純化方法，屬于生物醫藥化工【技術領域】。
【背景技術】
[0002]頭孢克洛是美國Eli Lilly公司于20世紀80年代初研究的第二代口服頭孢抗生素，其合成方法最早均是采用化學合成法。頭孢克洛化學合成法的缺點是:1、化學合成過程中要使用大量有機溶劑，如二氯甲烷、DMF等。2、反應條件也較為苛刻，一般是深冷條件下進行縮合酰化。3、反應結束后經由水中結晶或形成DMF溶劑化物提純結晶，過程中能耗大、溶劑使用量大、所得產品雜質含量多。酶催化合成頭孢抗生素是21世紀逐漸發展成熟的新型生物技術，其特征是純水中反應，污染少，副反應少，由于酶的特異性和專一性，轉化率高。反應直接由母核7-ACCA和側鏈完成，不再加入像化學合成法中所需的輔助物料和溶劑，所得產品質量好，有關物質少，經濟、環保，是藥物合成中最新技術和發展方向。由于頭孢克洛在水中溶解度小，且在酶催化的PH值條件下，它不能形成氨鹽溶解在反應體系中，而是逐漸析出來，隨著酶催化反應的進行，反應體系會逐漸粘稠，而使控制反應變得困難。有時只能以降低投料濃度，增加水量來解決，但水量增加又不適應工業化生產，而且批量太小給后續的純化帶來不便。
【發明內容】
[0003]本發明目的是提供一種酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法。
[0004]為達到上述目的，本發明采用的技術方案是:一種酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，
[0005]包括一酶催化反應體系，該酶催化反應體系為在固定化酶存在的條件下，用7-氨基-3-氯頭孢烷酸(7-ACCA)和活性形式的D-苯甘氨酸衍生物進行酶催化合成反應得到含有頭孢克洛晶體的酶促反應液；所述酶催化合成反應的PH值為5.5^7.5，所述酶催化合成反應的溫度為1(T35°C ;所述固定化酶的粒徑為200-500微米；
[0006]在所述酶催化合成反應的過程中，間斷地或者連續地將所述酶促反應液首先過125~150微米的篩網，篩上物返回至所述酶催化反應體系中，篩下物再經過濾后得到濾出物和濾液，所述濾液返回至所述酶催化反應體系中，所述濾出物即為頭孢克洛濕品；
[0007]在(T25°C溫度條件下，將所述頭孢克洛濕品用酶促反應液母液溶解，然后用鹽酸調節PH值至0.1-2使頭孢克洛溶解得到質量濃度為5~20%的頭孢克洛水溶液；接下來向所述頭孢克洛水溶液中加入活性炭脫色，所述活性炭與所述頭孢克洛水溶液兩者之間的質量比例為f 10: 100;接下來進行過濾得到濾液，然后向所述濾液中加入氨水調節pH值至
2.5^5.5使頭孢克洛析出，過濾后得到濾出物和濾液，該濾液即為重結晶母液，所述濾出物經洗滌和干燥步驟即得頭孢克洛產品。[0008]優選的技術方案為:所述酶催化合成反應的pH值為6.5^7.5 ;所述酶催化合成反應的溫度為20~28°C。
[0009]優選的技術方案為:在所述酶催化合成反應結束后，將所述固定化酶從所述酶促反應液中分離出來得到固定化酶和酶促反應液母液。
[0010]優選的技術方案為:在(Tio°C溫度條件下，將所述頭孢克洛濕品用酶促反應液母液溶解。
[0011]優選的技術方案為:用鹽酸調節pH值至0.1~0.8使頭孢克洛溶解得到質量濃度為8^15%的頭孢克洛水溶液。
[0012]優選的技術方案為:所述活性炭與所述頭孢克洛水溶液兩者之間的質量比例為2~6: 100 。
[0013]優選的技術方案為:加入氨水調節pH值至3.5^4.5使頭孢克洛析出。
[0014]優選的技術方案為:所述D-苯甘氨酸衍生物選自D-苯甘氨酸乙酯鹽酸鹽、D-苯甘氨酸甲酯甲磺酸鹽、D-苯甘氨酸乙酯甲磺酸鹽。
[0015]優選的技術方案為:所述重結晶母液中加入β -萘酚生成β -萘酚頭孢克洛復合物，過濾得到的濾出物經過丙酮洗滌、干燥后回收頭孢克洛。
[0016]上述技術方案中的有關內容解釋如下:
[0017]1、上述方案中，所述D-苯甘氨酸衍生物可以是D-苯甘氨酸的低級烷基(Cf C4)酯，例如D-苯甘氨酸的甲、乙或異丙酯。優選的是D-苯甘氨酸甲酯和D-苯甘氨酸乙酯，最好是D-苯甘氨酸乙酯鹽酸鹽、D-苯甘氨酸甲酯甲磺酸鹽、D-苯甘氨酸乙酯甲磺酸鹽。
[0018]2、上述方案中，固定化酶中的酶可以選用適合在7-ACCA與D-苯甘氨酸衍生物的反應中作為催化劑以制備頭孢克洛的任何酶。例如青霉素酰基轉移酶或青霉素G酰基轉移酶，其還可被稱為青霉素G酰胺酶或苯甲基青霉素酰基轉移酶。青霉素G酰基轉移酶來自微生物的一組水解酶，其能水解青霉素的6-酰基或頭孢菌素的7-酰基。固定化酶是將酶固定在載體上，ΕΡ222462和W097/04086中所公開的E.coli青霉素酰基轉移酶就可以直接應用于本發明。固定化酶例如將青霉素G酰胺酶固定于吖內酯聚合物上。
[0019]3、上述方案中，酶促反應液母液是在酶催化合成反應終了時(即酶催化反應體系中7-ACCA殘留低于lmg/ml)的酶促反應液分離出固定化酶后得到的。
[0020]由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點和效果:
[0021]1、本發明在頭孢克洛的析出過程中，即將頭孢克洛從酶促反應液中分離出來，從而解決了酶催化反應的分離、反應濃度問題，而且更易于7-ACCA的轉化，減少了側鏈消耗，可以增加投料批量，投料可以達到化學法2~4倍，質量穩定，收率可以達90%以上。
[0022]1、本發明為了方便固定化酶和從酶促反應液中析出的頭孢克洛的分離，因此將固定化酶的尺寸設計為200-500微米。
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例對本發明作進一步描述:
[0024]實施例一:一種酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法
[0025]在1000ml酶反應器中，加入300ml水，25g7_氨基_3_氯頭孢烷酸(7-ACCA)，控制溫度If 20°C，滴加氨水溶液至pH值7.0±0.1，攪拌溶解，加入固定化酶25g，再通過滴液漏斗滴加24gD-苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽溶液獲得酶促反應體系，然后通過PH值自動控制裝置，控制酶促反應體系的pH值恒定6.5^6.8,每間隔30min分離一次固定化酶和反應生成頭孢克洛。分離方法為首先將酶促反應液過125微米的篩網，篩上物即固定化酶返回至所述酶催化反應體系中，篩下物再經過濾后得到濾出物和濾液，濾液洗滌濾出物一次然后循環回酶反應器中，收集濾出物即頭孢克洛濕品。循環多次，至3小時左右，取樣測7-ACCA殘留低于lmg/ml，反應結束，分離、洗滌固定化酶，固定化酶5~10°C保存備用。收集頭孢克洛濕品和酶促反應液母液，將所得頭孢克洛轉入1000ml三口瓶中，加入酶促反應液母液250ml，降溫至5~10°C,加入鹽酸溶液調節pH值至0.6~0.8,溶清,加入2g活性炭脫色,30min后過濾，30ml純化水洗滌，控溫5~10°C，滴加氨水，pH值1.2~1.4時，加入頭孢克洛做晶種，養晶30min后，繼續調節pH值至3.8~4.0，控制時間約3h，降溫至O~5°C，養晶Ih,過濾，80ml冷純化水洗滌，抽干，50°C真空干燥至水分合格，得白色頭孢克洛結晶37.5g，收率91.2%。收集反應母液和重結晶母液，在母液中加入3gi3 -萘酚，控溫10~15°C，攪拌反應2h，過濾，20ml丙酮洗滌，干燥得約4gi3 -萘酚頭孢克洛復合物。
[0026]對白色頭孢克洛結晶進行檢測，結果如下表:
[0027]
【權利要求】
1.一種酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于: 包括一酶催化反應體系，該酶催化反應體系為在固定化酶存在的條件下，用7-氨基-3-氯頭孢烷酸和活性形式的D-苯甘氨酸衍生物進行酶催化合成反應得到含有頭孢克洛晶體的酶促反應液；所述酶催化合成反應的PH值為5.5^7.5，所述酶催化合成反應的溫度為1(T35°C ;所述固定化酶的粒徑為200-500微米； 在所述酶催化合成反應的過程中，間斷地或者連續地將所述酶促反應液首先過125~150微米的篩網，篩上物返回至所述酶催化反應體系中，篩下物再經過濾后得到濾出物和濾液，所述濾液返回至所述酶催化反應體系中，所述濾出物即為頭孢克洛濕品； 在(T25°C溫度條件下，將所述頭孢克洛濕品用酶促反應液母液溶解，然后用鹽酸調節pH值至0.1~2使頭孢克洛溶解得到質量濃度為5~20%的頭孢克洛水溶液；接下來向所述頭孢克洛水溶液中加入活性炭脫色，所述活性炭與所述頭孢克洛水溶液兩者之間的質量比例為廣10: 100;接下來進行過濾得到濾液，然后向所述濾液中加入氨水調節pH值至2.5^5.5使頭孢克洛析出，過濾后得到濾出物和濾液，該濾液即為重結晶母液，所述濾出物經洗滌和干燥步驟即得頭孢克洛產品。
2.根據權利要求1所述的酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于:所述酶催化合成反應的PH值為6.5^7.5 ;所述酶催化合成反應的溫度為2(T28°C。
3.根據權利要求1所述的酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于:在所述酶催化合成反應結束后，將所述固定化酶從所述酶促反應液中分離出來得到固定化酶和酶促反應液母液。
4.根據權利要求1所述的酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于:在(TlO°C溫度條件下，將所述頭孢克洛濕品用酶促反應液母液溶解。
5.根據權利要求1所述的酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于:用鹽酸調節PH值至0.r0.8使頭孢克洛溶解得到質量濃度為8~15%的頭孢克洛水溶液。
6.根據權利要求1所述的酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于:所述活性炭與所述頭孢克洛水溶液兩者之間的質量比例為2飛:100。
7.根據權利要求1所述的酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于:加入氨水調節pH值至3.5^4.5使頭孢克洛析出。
8.根據權利要求1所述的酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于:所述D-苯甘氨酸衍生物選自D-苯甘氨酸乙酯鹽酸鹽、D-苯甘氨酸甲酯甲磺酸鹽、D-苯甘氨酸乙酯甲磺酸鹽。
9.根據權利要求1所述的酶法合成頭孢克洛的分離及純化方法，其特征在于:所述重結晶母液中加入β-萘酚生成β-萘酚頭孢克洛復合物，過濾得到的濾出物經過丙酮洗滌、干燥后回收頭孢克洛。
【文檔編號】C12P35/04GK103571907SQ201310525754
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月30日 優先權日:2013年10月30日
【發明者】周自金, 羅新祖, 王金龍, 楊虎星, 龔仁巍 申請人:蘇州中聯化學制藥有限公司