一種制備il28b的方法及專用重組菌的制作方法

專利名稱：一種制備il28b的方法及專用重組菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種制備IU8B的方法及專用重組菌。
背景技術：
感染性疾病是嚴重威脅人類健康的公共衛生問題。據世界衛生組織2002年報告， 在對人類危害最嚴重的疾病病種中，有約80%是傳染病和寄生蟲病。而在臨床微生物感染癥中，由病毒引起的約占75%。病毒性疾病由于具有傳染性強、傳播迅速、流行廣泛、死亡率高、缺乏特異性藥物等特點，給人類健康與經濟社會發展帶來巨大的危害。在眾多抗病毒制劑中，幾十年前發現的干擾素(IFN)及基于干擾素的各種治療方案目前仍然是治療多種病毒感染的最基本的治療策略。人類白細胞介素 29 (HumanInterleukin 29，hIL-29)家族成員包括三個重要分子，它們分別是IL_29， IL-28A和IL-28B，又分別稱為干擾素λ 1，λ2和λ 3，屬于一大類新發現的III型干擾素。2003年，由Skppard等的工作首次報道了人IU8A、IL28B及IU9基因及其編碼產物，具有干擾素樣活性(Si印pard P, Kindsvogel W, Xu W, Henderson K, Schlutsmeyer S, WhitmoreTE, Kuestner R, Garrigues U,Birks C, Roraback J, Ostrander C, Dong D, Shin J, Presnell S, Fox B, Haldeman B, Cooper E, Taft D, Gilbert T, Grant FJ, Tackett M, Krivan W,McKnightG,Clegg C,Foster D,Klucher KM. IL-28,IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R. Nat Immunol. 2003 Jan ；4(1) :63-8. Epub 2002 Dec 2·)。自 2003年被發現以來，III型干擾素在很大程度上一直被認為是I型干擾素的一個“窮親戚”， 許多功能似乎和I型干擾素重疊而且直至現在也少有其作為一個獨立的、具有重要臨床作用的細胞因子的證據。一直以來，人們對III型干擾素的生物學研究主要集中在IU9和 IL28A。依據受體相似性，IFN-λ s屬于II型細胞因子家族。II型細胞因子家族包含三個類型的干擾素(I、II、III型)以及白細胞介素IO(IL-IO)相關的細胞因子。I型干擾素包括IFN-α和IFN-β，II型干擾素即為IFN-γ。III型干擾素包括IU9，IL28A和 IL28B.其中，IL28B與IL28A氨基酸序列高度同源(96%),而與IL29的同源性較低(81%) (Sheppard P,Kindsvogel W,Xu W,Henderson K,Schlutsmeyer S,Whitmore TE,Kuestner R,Garrigues U,Birks C, Roraback J, Ostrander C,Dong D, Shin J,Presnell S,Fox B, Haldeman B, Cooper E, Taft D, Gilbert T, Grant FJ, Tackett M, Krivan W, McKnightG, Clegg C, Foster D, Klucher KM. IL-28, IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R. Nat Immunol. 2003 Jan ；4(1) :63-8. Epub 2002 Dec 2·)。目前，針對三種不同的 IFN- λ s細胞因子生物學特性的比較數據還很有限。盡管II型細胞因子在氨基酸水平上差異很大，但它們在結構上卻是通過各自相關的異源二聚體跨膜蛋白受體，共享一個α螺旋模式和信號。但是，干擾素的生物學活性最終取決于沒有關聯的受體細胞質區域，因而可能導致這些干擾素之間結構相似但生物學功能不同。這意味著除了他們的受體在不同細胞類型中分布模式不同外，不同類型的Π型細胞因子在功能上也是不同的。
III型干擾素具有多種生物學功能，其刺激細胞可產生數百種干擾素誘導基因(ISGs)。Marcello等利用丙型肝炎病毒(HCV)復制子細胞培養系統檢測了在IFN-α 和IFNX刺激條件下ISG的表達、蛋白產量和HCV RNA的復制。在這個系統中兩種細胞因子最終都抑制了 HCV的復制。但STAT的活化動力學和所誘導的潛在效應基因卻不同。特別是，IFN-as誘導的基因達到高峰后迅速下降，而IFN-Xs所誘導的基因穩步增長。因此，I型和III型干擾素之間功能上的區別和相互作用可能是由于信號轉導通路的這個細節引起(Marcello T, Grakoui A, Barba-Spaeth G, Machlin ES, KotenkoSV, MacDonald MR, Rice CM. Interferons alpha and lambda inhibit hepatitis C virusreplication with distinct signal transduction and gene regulation kinetics. Gastroenterology. 2006 Dec ；131 (6) : 1887-98. Epub 2006 Oct 1·)。IFN-Xs 的功能尚未完全闡明，產生IFN-Xs的細胞分布不同，但他們都可以利用合適的受體對 IFN-λ s做出應答。IFN-λ s在免疫細胞上的功能與IFN-α相似，是非常復雜多樣的。獼猴接種HIV抗原后，IFN- λ s能降低Th2型細胞因子(IL-4和IL-5和IL-13和IL-14和IL-15) 的產生，這可能有利于Thl免疫途徑，增加調節性T細胞，提高⑶8T細胞的細胞毒性和應答記憶(DaiJ，Megjugorac NJ, Gallagher GE, Yu RY, Gallagher G. IFN-lambdal (IL-29) inhibitsGATA3 expression and suppresses Th2 responses in human naive and memory T cells. Blood. 2009 Jun 4 ；113(23) :5擬9_38.)。然而，又有學者表明，免疫細胞亞群(單核細胞，NK細胞，T細胞)對IFN-λ 1和IFN-X2的反應遲鈍，推測原因是外周血單核細胞產生的一種可溶性受體引起。IFN- λ s的抗病毒作用已比較明確，在體外IFN-λ s可保護人細胞系抵抗水泡口炎病毒(VSV)和心肌炎病毒引起的細胞病變；IFN-λ 1可抑制HBV和HCV在肝細胞中的復制(Doyle SE, Schreckhise H, Khuu-Duong K, Henderson K, Rosier R, Storey H, Yao L, Liu H, Barahmand-pour F, Sivakumar P, Chan C, Birks C, FosterD, Clegg CH, Wietzke-Braun P, Mihm S, Klucher KM. Interleukin-29 uses a type 1interferon-1ike program to promote antiviral responses in human hepatocytes. Hepatology. 2006 Oct ；44 (4) :896-906.)。III型IFNs的產生。一般來說，IFN- λ家族和IFN- α都具有抗病毒的免疫調節的功能，但他們也有重要的差異。所有有核細胞均可產生IFN-α s，而IFN-λ s只能有少數細胞類型表達。漿單核細胞衍生的樹突狀細胞(pDC和MDDC)和巨噬細胞在應答流感病毒感染禾口 / 或細菌禾口病毒模擬分子(艮口 Toll—like receptor agonistslipopolysaccharide and poly I :C)時產生 IFN-λ s (Megjugorac NJ, Gallagher GE, GallagherG. IL-4 enhances IFN-Il(IL-29)production by plasmacytoid DCs via monocyte secretion ofIL-lRa. Blood 2010 ；115 :4185e90.)。有趣的是，將巨噬細胞與IFN-α預培養可顯著增加IFN-λ s 的產生，這也是二者信號通路相互影響的證據。有證據表明，IFN-λ s的分泌可能是受細胞因子的影響，例如，PDCs細胞通過單核細胞介導的信號應答于IL-4，產生更多的IFN-λ S。 還有證據表明IFN-λ s在皮膚生物學具有特定的作用，那里的調節性T細胞和樹突狀細胞很容易產生IFN- λ s,作用于角質形成細胞和黑色素細胞。與HCV感染密切相關的細胞， 肝癌細胞系(HepG2和Huh7. 5)，體外培養的原代肝細胞和肝活檢標本中獲得的肝組織，均會應答于病毒感染而產生 IFN-λ s (Mihm S, Frese M, Meier V, Wietzke-Braun P, Scharf JG, Bartenschlager R, Ramadori G. Interferon type I geneexpression in chronichepatitis C. Lab Invest. 2004 Sep ；84 (9) :1148-59.)。相反的，人類原代中樞神經組織不產生 IFN-λ S。近年來的研究表明，IL28B基因多態性對于HCV感染者對IFN治療的病毒學應答具有一定的影響。與細胞因子IL28B相關的單核苷酸多態性(SNPs)，在群體水平上， 是決定HCV感染治療結果的一個主要的宿主因素(Ge D，Fellay J，Thompson AJ, Simon JS, Shianna KV, Urban TJ, Heinzen EL, Qiu P, Bertelsen AH, Muir AJ, Sulkowski Μ, McHutchison JG, Goldstein DB. Genetic variaion in IL28B predicts hepatitis Ctreatment-induced viral clearance. Nature. 2009 Sep 17 ；461 (7262) :399_401·)。由此，人們有理由相信IL28B參與體內的病毒學應答，盡管目前機制方面并不十分清楚。目前，關于IU9的功能研究較多，美國zymogenetics公司與BMS聯合研發的PEG-IU9細胞因子已經進入臨床研究，并展示出良好的抗HCV前景。但是IL28B作為藥物的研究目前還是個空白。重組蛋白類藥物的制備方法主要包括大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、動植物生物反應器等基因工程方法。酵母表達系統具有如下優點屬于真核表達系統，具有一定的蛋白質翻譯后加工，有利于真核蛋白的功能；強效啟動子，外源基因產物表達量高，可以達到每升數克表達產物的水平；適合大規模工業化生產；可以誘導表達，也可以分泌表達，便于產物純化；以甲醇作為誘導物，生產成本低，無毒。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種優化的人白細胞介素^B的編碼基因。本發明所提供的優化的人白細胞介素^B的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1 所示。含有上述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達盒也屬于本發明的保護范圍。其中，重組表達載體，是將SEQ ID N0:1所示基因插入表達載體pPinka-HC的多克隆位點得到的。具體的，是將SEQ ID NO :1所述基因插入表達載體pPinka-HC的Mu I和KpnI 酶切位點間得到的。其中，重組酵母菌，是將SEQ ID NO 1所示編碼基因導入宿主酵母菌中得到的；所述宿主酵母菌具體為畢赤酵母，再具體為如下四種菌株中的至少一種ade2蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/prbl蛋白酶缺陷型畢赤酵母和ade2/ prbl/p印4蛋白酶缺陷型畢赤酵母。上述重組酵母菌中，所述編碼基因是通過上述任一所述重組表達載體導入的。上述任一所述的重組酵母菌在制備人白細胞介素^B中的應用也屬于本發明的保護范圍。本發明的另一個目的是提供一種制備人白細胞介素^B的方法。本發明所提供的制備人白細胞介素^B的方法，包括如下步驟1)將上述任一所述的重組酵母菌預培養至對數生長期；(誘導前進行培養的主要目的是讓菌體達到對數生長期，該期是細胞增殖最旺盛活力最好的時期，適合蛋白的誘導表達)2)用甲醇對步驟1)得到的菌進行誘導培養，誘導培養完畢，收集上清液，即得到人白細胞介素^B。所述步驟2)中，所述甲醇占誘導培養體系的0.5%-10.0%或0.5%-4.0% (體積百分比)，具體為_4%、或2% -4%或2% -3%。所述步驟2)中，所述誘導培養的時間為36h_72h，具體為4他-7池或60h_72h。所述步驟1)中，所述預培養包括如下步驟將上述任一所述的重組酵母菌接種于用于培養酵母的培養基中，培養至培養體系的0D600為5. 0 6. 0 ；所述步驟2、中，在所述用甲醇進行誘導之前，包括如下步驟將步驟1)得到的菌體重懸于用于誘導酵母菌的培養基中，再培養10-14h ；所述用于培養酵母菌的培養基為用于培養畢赤酵母菌的培養基，具體為BMGY培養基；所述用于誘導酵母菌的培養基為用于誘導畢赤酵母菌的培養基，具體為BMMY培養基；所述培養的溫度為30°C。實驗證明，用本發明的重組菌制備IU8B，表達量高，純化過程簡便，且表達產物具有較強的活性。因此，本發明重組菌及本發明方法在IL28B的制備及免疫調節、抗病毒治療等領域中有廣闊的應用前景。


圖1為pPink α HC-0pt_hIL28B重組質粒的酶切鑒定。圖2為opt-hIL28B在PichiaPink strain 2號菌株中高表達克隆的篩選。圖3為opt_hIL28B重組蛋白高效表達株的表達條件的優化。本圖為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色結果。圖4為重組hIL28B蛋白的純化。本圖為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色結果。圖5為重組hIL28B蛋白的質譜分析。圖6為利用本發明制備并純化的opt_hIL28B重組蛋白及購自美國R&D公司的重組IU8B、II^9蛋白及購自先靈葆雅公司的IFN- α 2b對人肝癌細胞系IfepG2細胞內信號通路分子STATl (Tyr701)磷酸化的激活。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。胎牛血清及DMEM 培養基購自hvitrogen公司，質粒大量提取試劑盒、轉染試劑購自Giantagen公司。一次性細胞培養板以及移液管等耗材購自Corning公司。實施例1、重組菌的制備及應用一、重組菌制備1、基因
人工合成經密碼子優化后的人IL-28B基因，該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。密碼子優化前的基因名稱為hIU8B，密碼子優化后的基因名稱為opt-hII^8B。與 hIL28B基因相比，opt-hIL28B基因的核苷酸序列發生變化，氨基酸序列不變。該基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。密碼子優化前的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。2、重組表達載體pPinka-HC 載體購自美國 Invitrogen 公司，目錄號A11153。將人工合成的opt_hIL28B基因，通過Mu I和KpnI酶切位點克隆到PichiaPink 酵母菌專用表達載體pPinka-HC的相應酶切位點中，獲得的重組表達質粒記作 pPinka HC-opt-hIL28B。將重組質粒pPinka HC-opt_hIL28B進行酶切鑒定，結果如圖1。圖中，M1:DNA 分子量標準(TAKARA 公司DL 2, 000) ；M2 :DNA 分子量標準(TAKARA 公司DL15, 000) ；1 pPink a HC-opt-hIL28B 質粒以 Xho I 和 Kpn I 雙酶切；2 :pPink a HC-opt-hIL28B 質粒以 Spe I單酶切。結果雙酶切泳道可見在500bp上方有插入片段被切出。表明構建的重組表達質粒正確。將重組質粒pPinkaHC-opt-hIL28B進行測序鑒定。結果顯示在載體pPink a-HC 的乂11 I和Kpn I酶切位點間沿著從Mu I至Kpn I的方向，插入的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。測序結果完全正確的質粒用Giantagen公司GIANTPREP質粒大量提取試劑盒(目錄號G06030;3)按說明書進行大量制備。3、重組菌(1) pPink a HC-opt"hIL28B 質粒 DNA 的線性化取IOyg pPinka HC-opt-hIL28B重組質粒，用限制性內切酶Spe I按照說明書建議的反應體系進行線性化，線性化后的DNA經純化后，溶于IOul的無菌去離子水中。(2)酵母菌感受態細胞的制備酵母菌株1#、2#、3#和4#均購自美國hvitrogen公司，目錄號A11154。這四株菌均屬于目錄號為AlllM的試劑盒，不同菌株都有清晰的標記，使用者很容易區分開。PichiaPink表達系統中酵母菌株1#、2#、3#和4#分別為蛋白酶缺陷型，缺陷的基因分別為 ade2、ade2/p印4、ade2/prbl 和 ade2/prbl/p印4。ade2、prbl、p印4 是公知的,酵母菌株1#、2#、3#和4#均購自美國^witrogen公司，其說明書上標明它們是通過基因敲除方式構造的缺陷株。1.分別挑取PichiaPink酵母表達系統中的菌株的單菌落，接種至含有IOml YPD 培養基的125ml三角瓶中，30°C，260r/min培養1天；2.分別取上述步驟中復蘇后的四種菌株培養物100 500 μ 1，接種至含有IOOml 新鮮YPD培養基的IL三角搖瓶中，調整接菌濃度使初始OD6tltl = 0.2，30°C，260rpm/min培養過夜，至OD6tltl達到1.3 1.5 ；3.將步驟2中酵母細胞培養物轉移至300ml無菌離心瓶中，4°C，1500g離心5min， 棄上清，菌體沉淀用200ml冰預冷的無菌水重懸；4.按步驟3離心，用50ml的冰預冷的無菌水將菌體沉淀重懸；
5.按步驟3離心，用IOml的冰預冷的IM山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；6.按步驟3離心，用300ul的冰預冷的IM山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為500ul。制備好的感受態置冰上放置，并且當天使用。(3)酵母菌的電轉化1.分別取5μ g 丨111^!1(-0 {-1111^288純化后的線性化0嫩與8(^1四種菌株的感受態細胞混合均勻，轉移至0. 2cm冰預冷的電轉杯中，冰浴5min ；2.運用Bio-fcid公司的MicroPulser Electroporator，進行電轉，電轉條件為 2kV, 25 Ω，200 μ F ；電擊時間為5ms左右。電擊完畢后，加入Iml冰預冷的YPDS培養基將菌體混合均勻，轉移至30°C，靜置培養濁；3.每管取100 300 μ 1菌體懸液涂布于PAD選擇培養板上，將平板置于30°C培養，直至單個菌落出現；4.從步驟3中每板分別挑取3-8個白色克隆至新鮮的PAD選擇培養板中，重新劃線分離純化培養至出現單菌落。PAD、YPDS均購自美國 hvitrogen 公司，目錄號:A11156。PichiaPink Media Kit。同時設如下兩組對照對照1 轉入SEQ ID NO :3所示編碼基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#。制備方法與實驗組基本相同，只是轉入的基因不同，為優化前基因。對照2 轉入空載體pPink α -HC的酵母菌株1#、2#、3#和4#。制備方法與實驗組基本相同，不同的是只轉入空載體PPink α -HC。二、蛋白的表達BMGY培養基組成及各成分在培養基中的濃度如下酵母粉(yeast extract), 2%蛋白胨(ρ印tone)，1. 34% YNB，0. 0004%生物素(biotin)，1 %甘油，用 100mM、pH 6.0 的磷酸鹽緩沖液(potassium phosphate)補足體積。所述百分含量除甘油為體積百分比外， 其余均為質量百分含量。BMMY培養基組成及各成分在培養基中的濃度如下酵母粉(yeast extract), 2% 蛋白胨(peptone), 1. 34% ΥΝΒ,Ο. 0004% 生物素(biotin)，0. 5 % 甲醇，用 100mM、pH 6.0的磷酸鹽緩沖液(potassium phosphate)補足體積。所述百分含量除甲醇為體積百分比外，其余均為質量百分含量。(一)重組hIL28B在四種不同菌株中表達量的比較及高表達株的篩選實驗組和對照組在相同條件下進行蛋白表達和目的蛋白含量檢測。1.挑取含有opt-hII^8B的單菌落接種至含有10ml BMGY培養基的125ml三角瓶中，30°C，260rpm/min 培養 1 天；2.將培養物轉移至50mL錐底離心管中，1500g室溫離心5min，棄上清，沉淀重懸于 Iml BMMY培養基中，30 °C，260rpm/min培養過夜；3.次日加入IOOul 40% (體積百分比)甲醇水溶液，30°C，260rpm/min繼續培養過夜；4.第二天1500gX IOmin離心收集上清，取20ul經SDS-PAGE分析比較不同菌株中表達量的變化。結果顯示，與hIL28B相比密碼子優化后的opt-hIL28B在PichiaPink表達系統strainl#、strain2#、strain3#、strain4#四種不同菌株中的表達量均上升。
5. opt-hIL28B 在 PichiaPink 表達系統 strainl#、strain2#、strain3#、strain4# 四種不同菌株中表達量的比較。分別挑取轉入SEQ ID NO :1所示編碼基因的酵母菌株1#、 姊、3#和4#各32個克隆進行誘導表達，收集上清液，用Bicinchoninic acid (BCA)法檢測上清液中各蛋白的表達量，結果取平均數，具體如下實驗組轉入SEQ ID NO :1所示編碼基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中目的蛋白表達量依次為0. 149ug/ul、0. 163ug/ul、0. 062ug/ul、0. 049ug/ul。顯示 opt-hIL28B在strain^的表達量高于其他三種菌株。對照1 轉入SEQ ID NO 3所示編碼基因的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中目的蛋白表達量依次為:0. 106ug/ul、0. 117ug/ul、0. 043ug/ul、0. 032ug/ul。對照2 轉入空載體pPink α -HC的酵母菌株1#、2#、3#和4#的上清液中均沒有檢測到目的蛋白的表達。6. opt_hIL28B在PichiaPink表達系統strain^!菌株中高表達克隆的篩選。在確定opt-hIL28B在strains中的表達量高于其他三種菌株的基礎上，進一步大規模挑取轉有opt-hII^8B的strain^單菌落進行誘導表達，通過SDS-PAGE分析比較(圖2)，篩選出 5株0pt-hIU8B的高表達株，選擇其中表達量最高的2號菌株進一步進行下游實驗。電泳為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色。(二)重組hIL28B高效表達株的表達條件優化。1.將篩選出的opt_hIL28B高效表達2號菌株接種至含有IOml BMGY培養基的 125ml 三角瓶中，30°C，260rpm/min 培養 1 天；2.將步驟1中的培養物分別接種至5個含有50mLBMGY培養基的IL三角瓶中， 30 0C，260rpm/min 培養 1 天；3.第二天1500gX5min離心，棄上清，沉淀重懸于IOmLBMMY培養基中，30°C， 260rpm/min培養過夜；4.次日分別加入100%甲醇至終濃度(即甲醇占培養體系的體積百分比)為 0. 5%U. 0%,2. 0%,3. 0%,4. 0%,30°C,260rpm/min 誘導，分別在誘導時間為 36h、48h、 60h、72h時收取上清進行蛋白表達量檢測和SDS-PAGE檢測。結果如圖3所示，在相同誘導時間下，2%與3%終濃度的甲醇誘導的目的蛋白表達量相對較高在相同終濃度的甲醇誘導下，誘導時間為60h與7 時目的蛋白表達量相對較高。電泳為12%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及考馬斯亮藍染色。具體表達量如下表1、各種條件下的蛋白表達量(ug/ul)
36h48h60h72h0. 5%0. 0780. 0860. 0900. 0831. 0%0. 0890. 1130. 1380. 1352. 0%0. 0950. 1460. 1520. 1413. 0%0. 1330. 1670. 1780. 163
9
權利要求
1.一種人白細胞介素^B的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.含有權利要求1所述編碼基因的重組載體、重組菌、轉基因細胞系、重組病毒或表達品.ο
3.一種重組表達載體，是將SEQ ID N0:1所示基因插入表達載體pPinka-HC的多克隆位點得到的。
4.一種重組酵母菌，是將SEQ ID NO :1所示編碼基因導入宿主酵母菌中得到的；所述宿主酵母菌具體為畢赤酵母，再具體為如下四種菌株中的至少一種ade2蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母、ade2/prbl蛋白酶缺陷型畢赤酵母和ade2/ prbl/pep4蛋白酶缺陷型畢赤酵母。
5.根據權利要求4所述的重組酵母菌，其特征在于所述編碼基因是通過權利要求2 或3所述重組表達載體導入的。
6.權利要求4或5所述的重組酵母菌在制備人白細胞介素^B中的應用。
7.一種制備人白細胞介素^B的方法，包括如下步驟1)將權利要求4或5所述的重組酵母菌預培養至對數生長期；2)用甲醇對步驟1)得到的菌進行誘導培養，誘導培養完畢，收集上清液，即得到人白細胞介素^B。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述甲醇占誘導培養體系的0.5% -10. 0%或0.5% -4.0% (體積百分比)，具體為-4%、或2%-4%或 2% -3%。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述誘導培養的時間為 36h-72h，具體為 48h-7ai 或 60h_7ai。
10.根據權利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述預培養包括如下步驟將權利要求1-4中任一所述的重組酵母菌接種于用于培養酵母菌的培養基中，培養至培養體系的0D600為5. 0 6. 0 ；所述步驟幻中，在所述用甲醇進行誘導之前，包括如下步驟將步驟1)得到的菌體重懸于用于誘導酵母菌的培養基中，再培養10-14h ；所述用于培養酵母菌的培養基為用于培養畢赤酵母菌的培養基，具體為BMGY培養基； 所述用于誘導酵母菌的培養基為用于誘導畢赤酵母菌的培養基，具體為BMMY培養基；所述培養的溫度為30°C。
全文摘要
本發明公開了一種制備IL28B的方法及專用重組菌。本發明的重組酵母菌，是將SEQ ID NO1所示基因導入宿主酵母菌中得到的。實驗證明，用本發明的重組菌制備IL28B，表達量高。且表達產物具有較強的活性。因此，本發明重組菌及本發明方法在IL28B的制備領域中有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N7/01GK102250917SQ201110106859
公開日2011年11月23日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者司有輝, 楊威, 楊洋, 程敏 申請人:中國醫學科學院病原生物學研究所