一種脂肪酶納米高分子生物催化顆粒及其制備方法

專利名稱：一種脂肪酶納米高分子生物催化顆粒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種脂肪酶納米高分子生物催化顆粒及其制備方法。
背景技術：
脂肪酶(Lipase)作為應用最為廣泛的工業酶之一，可以催化水解、酯化等多種反應過程，并且具有較高的手性/區域選擇性。其常見應用領域包括有機合成、食品工業、洗滌劑工業、能源工業、生物轉化、生物醫藥、生物傳感器等等。化學修飾法是酶分子改造過程中的常見方法，且隨著近年來納米科技的發展，納米高分子生物催化顆粒正逐漸成為生化催化領域一個新型課題。脂肪酶納米高分子生物催化顆粒不僅可以有效實現均相催化，解決現有固定化脂肪酶因高傳質阻力而導致酶催化活性較低的問題，而且還可以有效提高熱穩定性，增強有機溶劑耐受能力。傳統兩步法制備脂肪酶納米高分子生物催化顆粒采用丙烯酸琥珀酰亞胺酯作為第一步引入蛋白質表面雙鍵基團的修飾劑，然后經過中間產物分離后進入第二步水相原位自由基聚合得到目標產物。該方法的修飾劑成本高，中間分離步驟耗時長，嚴重制約了其在實際工業生產中的應用。因此，開發一種原料成本低、工藝簡單、能耗少的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的制備方法具有重要意義。

發明內容
本發明的目的是提供一種脂肪酶納米高分子生物催化顆粒及其制備方法。本發明所提供的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒，是以下述質量份的物質為原料制成的脂肪酶10份、甲基丙烯酸縮水甘油酯(酶修飾劑)2-200份、乙烯基單體75-375份和引發劑體系20-30份；具體制備方法包括如下步驟1)將所述脂肪酶和所述甲基丙烯酸縮水甘油酯加入PH值為3-8的緩沖溶液中，在0-50°C下反應0. 5 3小時；2)向步驟1) 的反應液中加入所述乙烯基單體和所述引發劑體系，在0-50°C繼續反應5-12小時，得到脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。其中，所述酶修飾劑甲基丙烯酸縮水甘油酯是以甲基丙烯酸縮水甘油酯的二甲基甲酰胺溶液形式加入的，由于二甲基甲酰胺與修飾劑以及水的互溶性較好，所以作為修飾劑的溶劑，可促進其在水相中溶解并與脂肪酶反應。本發明中所述脂肪酶來源于商品酶、動物提取物或微生物提取物。本發明中，所述乙烯基單體是指可通過自由基聚合反應形成聚合物的乙烯基單體；所述乙烯基單體具體可選自下述至少一種丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、N，N’ -甲叉雙丙烯酰胺、順丁二烯和三羥基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。本發明中，所述引發劑體系是指在0-50°C條件下能夠引發產生自由基，導致乙烯基單體發生自由基聚合的熱引發劑體系或氧化還原引劑體系。所述引發劑體系具體可由下述A和B中的物質組成，所述A選自下述至少一種過硫酸鉀、過硫酸銨、過氧化氫、叔丁基過氧化氫和過氧化苯二甲酰，所述B選自下述至少一種亞鐵鹽、亞硫酸鹽、N，N’_ 二甲基苯胺、氨水、N，N’ - 二甲基-對甲苯胺、N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基嗎啉。所述引發劑體系優選由過硫酸銨和N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺組成，其質量比可為1.5 2。所述緩沖溶液可為下述至少一種物質的水溶液醋酸、醋酸鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鈉、硼酸、硼酸鈉、硼酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、 碳酸鉀和碳酸氫鉀。所述方法還包括將步驟2、得到的含脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的反應液進行透析，并將透析后的液體凍干的步驟。在本發明提供的制備方法中，乙烯基單體也可在步驟1中加入，具體方法如下1)將所述脂肪酶、所述甲基丙烯酸縮水甘油酯和所述乙烯基單體加入pH值為3-8 的緩沖溶液中，在0-50°C下反應0.5 3小時；2)向步驟1)的反應液中加入所述引發劑體系，在0-50°C繼續反應5-12小時，得到脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。上述先加入乙烯基單體的方法較后加入乙烯基單體的方法，聚合反應收率較低， 從最終聚合產物收率方面考慮，優選后加入乙烯基單體的方法。本發明采用疏水性試劑甲基丙烯酸縮水甘油酯作為酶修飾劑，在脂肪酶表面引入碳碳雙鍵基團，無需中間產物分離，直接加入含有碳碳雙鍵的乙烯基單體引發自由基聚合， 得到目標脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。該脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的粒徑為 20-50nm，其核心為脂肪酶，外殼為高分子材料，核殼之間有化學鍵連接。本發明方法核心在于新型疏水性修飾劑(甲基丙烯酸縮水甘油酯)的引入，可以有效實現脂肪酶活性的激發，得到高酶活收率，避免傳統制備方法中修飾步驟對脂肪酶酶活造成的損失。同時，一鍋法的制備過程可以顯著提高生產效率，降低生產成本，并且制備得到具有更高熱穩定性的100納米以下尺度的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒，更便于工業生產和放大。


圖1為利用傳統兩步法丙烯酸琥珀酰亞胺酯(NAS)修飾，新兩步法甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)修飾，新一鍋法甲基丙烯酸縮水甘油酯(One-Pot)修飾，三種方法雙鍵修飾度(Acryloylation% )，及各步產物剩余活性比較(Intermediate ProductRA% /CRL-pAM nanogel RA% )。圖2為本發明甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)修飾法所得目標產物，傳統丙烯酸琥珀酰亞胺酯(NAS)修飾法得到產物，以及天然脂肪酶的各酶動力學參數(Km，Vmax，Kcat)對比圖；圖中NAS :CRL-pNIPAAM以及GMA :CRL_pNIPAAM是指以N-異丙基丙烯酰胺為乙烯基單體制備的催化顆粒。圖3為本發明制備方法(One-pot)，傳統兩步法(Two-st印)與天然脂肪酶在 50°C、60°C下熱穩定性比較圖。圖4為本發明制備方法(One-pot)工藝過程與傳統兩步法(Two-st印)工藝過程的流程示意圖比較。圖5為實施例3在不同修飾劑投料量范圍下的脂肪酶納米凝膠產物聚合產物收率及剩余活性收率比較圖。
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圖6為實施例4在不同單體投料量范圍下的脂肪酶納米凝膠產物聚合產物收率及剩余活性收率比較圖。圖7為實施例5在不同pH范圍下的脂肪酶納米凝膠產物聚合產物收率及剩余活性收率比較圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明方法做進一步地說明，但本發明并不局限于此。實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。實施例中使用脂肪酶為Lipase from Canadida rugosa，脂肪酶來自sigma公司，商品目錄號為L1754，Type VII，彡700unit/mg。上述脂肪酶在使用前需進行純化，具體方法如下將上述100份脂肪酶溶解于pH 值3 8的緩沖液中，在0 30°C下離心5 20min，取上清液置于截留分子量為IOKDa的透析袋中，在PH為3 8、50mM緩沖液中透析M小時，測量蛋白濃度確定脂肪酶蛋白含量。 下述實施例中所用的脂肪酶的量以脂肪酶蛋白質量計。實施例1、One-pot法制備脂肪酶納米高分子生物催化顆粒原料為重量份計脂肪酶10份，酶修飾劑(甲基丙烯酸縮水甘油酯)200份，乙烯基單體(丙烯酰胺)250份，引發劑體系為15份過硫酸銨和12份N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的混合物。將上述脂肪酶溶解在5000質量份pH為4、50mM乙酸緩沖液中，加入酶修飾劑 (50% ν/ν 二甲基甲酰胺溶液)，在30°C條件下反應2小時。加入250份丙烯酰胺溶解后及加入上述引發劑體系后，在攪拌條件下于30°C繼續反應12小時，然后將反應液置于截留分子量為IOKDa的透析袋中，在pH為7、50mM磷酸緩沖液中透析M小時，收集透析后液體凍干即可得到目標產物脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。以對硝基酚棕櫚酸酯類作為底物測量脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的生物催化活性總收率(RA%=待測脂肪酶酶活力/天然脂肪酶活力*100%)為108%，聚合反應收率為50%。具體活性測定方法如下采用對硝基酚棕櫚酸酯作為底物測定酶活時，首先將對硝基酚棕櫚酸酯溶解在丙酮中，然后在攪拌下緩慢加入到含有1.25% (w/v)的Triton X-100的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(50mM，pH 7.0)中配制成0. 5mM的底物溶液，溶液中丙酮濃度控制在5% (ν/ ν)。測酶活時，一定量酶液加入到底物溶液中，混合10秒后在紫外分光光度計上測定348nm 處的吸收值變化，通過計算斜率得到脂肪酶的水解相對活性。1分鐘內催化對硝基酚棕櫚酸酯水解產生1 μ mol棕櫚酸所需的酶量定義為一個酶活單位。聚合物反應收率以^Onm紫外檢測下的體積排阻色譜圖為準。其中，酶納米凝膠產物聚合收率％=聚合物出峰面積/總峰面積X100%。對比例1、傳統兩步法原料為重量份計脂肪酶10份，酶修飾劑(丙烯酸琥珀酰亞胺酯)15份，乙烯基單體(丙烯酰胺)250份，引發劑體系為15份過硫酸銨和12份N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的混合物。
將上述脂肪酶溶解在5000質量份pH為4、50mM乙酸緩沖液中，加入酶修飾劑二甲基亞砜)，在30°C條件下反應6小時，在pH為7、50mM磷酸緩沖液中透析Mh除去過量修飾劑。加入250份丙烯酰胺，溫度保持30°C，磁力攪拌，加入上述引發劑體系，溫度保持30°C，繼續反應12小時，然后將反應液置于截留分子量為IOKDa的透析袋中，在pH為7、 50mM磷酸緩沖液中透析M小時，收集透析后液體凍干即得傳統丙烯酸琥珀酰亞胺酯修飾下兩步法制備的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。對比例2、新修飾劑下兩步法原料為重量份計脂肪酶10份，酶修飾劑(甲基丙烯酸縮水甘油酯)200份，乙烯基單體(丙烯酰胺)250份，引發劑體系為15份過硫酸銨和12份N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的混合物。將上述脂肪酶與酶修飾劑(50% ν/ν 二甲基甲酰胺溶液)加入pH為4的50mM乙酸緩沖液中，在30°C條件下反應2小時，在緩沖液中透析24h除去過量修飾劑。加入250份丙烯酰胺溶解后及加入上述引發劑體系后，在攪拌條件下繼續反應12小時，然后將反應液置于截留分子量為IOKDa的透析袋中，在pH為7、50mM磷酸緩沖液中透析M小時，收集透析后液體凍干即得到目標產物脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。對實施例1、對比例1、對比例2分別利用TNBS法測定雙鍵修飾度，和以對硝基酚棕櫚酸酯類作為底物的測定各步產物的生物催化活性收率，其對比結果如圖1所示。由圖 1可知，實施例1方法可以有效實現脂肪酶酶活的激發，得到高酶活收率。進一步檢測新修飾劑對于酶學基本性能的影響，采用上述酶活測定方法，分別在 0. 1 0. 9mM底物濃度溶液中測定脂肪酶酶解反應起始反應速率，根據米氏方程以底物倒數為橫坐標，初始反應速率倒數為縱坐標進行雙倒數作圖，計算得到Km(斜率―1)，Vmax (截距,，!(cat = Vmax/[E] total，如圖2所示，發現原修飾劑修飾后產物(CRL-NAQ及聚合產物(NANOGEL(N))的Km，Vmax，Kcat值均有所下降，而新修飾劑修飾后產物(CRL-GMA)及聚合產物(NANOGEL(G))的Km和Vmax值略有上升，同時Kcat值顯著提高。說明新疏水性修飾劑會在一定程度上影響酶與底物結合的緊密程度，但其形成的疏水性通道卻可以有效提高酶的最大反應速率，顯著改善催化效率，降低聚合物殼層的引入對酶催化效率的不利影響。分別在50°C和60°C下測定天然脂肪酶，傳統兩步法丙烯酸琥珀酰亞胺酯修飾目標產物，和本發明One-pot法制備得到的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒熱穩定性比較， 如圖3所示。根據圖3以及半衰期計算公式t1/2 = -ln2/k(其中k為ln(RA% ) t斜率)可以得到如下結果
Half-life t1/2 (h'1)CRL Nanogel(N) Nanogel(G)
50°C 2.28 3.81 8.73 60°C 1.41_L63_5.61由此可見，本發明相比天然酶和傳統方法，能夠有效提高酶活半衰期，所制備的脂肪酶納米凝膠具有更好的熱穩定性。圖4表明了比較例1和實施例1制備流程示意圖的對比，說明新方法可以在溫和恒定溫度固定反應器中進行，并且有效節省中間產物分離步驟，降低生產成本，提高生產效率(縮短生產時間約M小時/批次)。實施例2、One-pot法改變單體投料時間制備脂肪酶納米高分子生物催化顆粒原料為重量份計脂肪酶10份，酶修飾劑(甲基丙烯酸縮水甘油酯)200份，乙烯基單體(丙烯酰胺)為250份，引發劑體系為15份過硫酸銨和12份N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的混合物。將上述脂肪酶、酶修飾劑(50% ν/ν 二甲基甲酰胺溶液)與250份丙烯酰胺加入 PH為4的50mM乙酸緩沖液中，在30°C條件下反應2小時。后加入上述引發劑體系引發自由基聚合，在攪拌條件下繼續反應12小時，然后將反應液置于截留分子量為IOKDa的透析袋中，在PH為7、50mM磷酸緩沖液中透析M小時，收集透析后液體凍干即可得到目標產物脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。以對硝基酚棕櫚酸酯類作為底物測量納米高分子生物催化顆粒的生物催化活性總收率為94%，聚合反應收率約為45%。實施例3、One-pot法改變修飾劑投料量將實施例1中的修飾劑投料量分別改為2-200份甲基丙烯酸縮水甘油酯，其余配方和步驟與實施例1相同。此時，得到的產物以對硝基酚棕櫚酸酯類作為底物測量納米高分子生物催化顆粒的生物催化活性總收率和聚合反應收率如圖5所示。其中，整體聚合反應收率(Nanogel yield% )相當，生物催化活性總收率體現在產物的剩余相對酶活(CRL-pAM nanogel RA% )上。在低修飾劑投料下，由于酶活激活現象不顯著，因此獲得脂肪酶納米凝膠的收率較低，當修飾劑投料量超過50份后，酶活激活現象開始顯現，酶活收率開始提高，當修飾劑投料量增至200份時，可以得到相當于天然酶酶活114%的酶納米凝膠酶活收率。實施例4、One-pot法改變單體投料量將實施例1中的單體投料量分別改為75、150、225、300、375份丙烯酰胺，其余配方和步驟與實施例1相同。此時，得到的產物以對硝基酚棕櫚酸酯類作為底物測量納米高分子生物催化顆粒的生物催化活性總收率和聚合反應收率如圖6所示。脂肪酶納米凝膠的聚合反應收率(Nanogel yield% )隨單體投料量的增大而提高，當投料量超過300份時達到飽和。而產物的生物催化活性總收率(CRL-pAM nanogelRA% )亦會在單體投料量在225 300份時達到最高收率。實施例5、One-pot法改變體系pH值將實施例1中的反應體系緩沖液分別改為pH值為3. 0,4. 0,6. 0,8. 0，其余配方和步驟與實施例1相同。此時，得到的產物以對硝基酚棕櫚酸酯類作為底物測量納米高分子生物催化顆粒的生物催化活性總收率和聚合反應收率如圖7所示。當pH > 3時，脂肪酶納米凝膠的聚合反應收率(yield% )有明顯提高，后保持一定。而生物催化活性總收率(RA% )則在pH6附近達到最佳收率。本發明可用其它的不違背本發明的精神或主要特征的具體形式來概述。因此，本發明的上述實施方案都只能認為是對本發明的說明而不能限制本發明，權利要求書指出了本發明的范圍，因此，在與本發明的權利要求書相當的含有和范圍內的任何改變，都應當認為是包括在權利要求書的范圍內。
權利要求
1.一種制備脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的方法，其特征在于所述脂肪酶納米高分子生物催化顆粒是以下述質量份的物質為原料制成的脂肪酶10份、甲基丙烯酸縮水甘油酯2-200份、乙烯基單體75-375份和引發劑體系20-30份；包括如下步驟1)將所述脂肪酶和所述甲基丙烯酸縮水甘油酯加入PH值為3-8的緩沖溶液中，在0-50°C下反應0. 5 3小時；2)向步驟1)的反應液中加入所述乙烯基單體和所述引發劑體系，在0-50°C繼續反應 5-12小時，即得到脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述乙烯基單體是可通過自由基聚合反應形成聚合物的乙烯基單體；所述乙烯基單體優選自下述至少一種丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、 丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、N，N’_甲叉雙丙烯酰胺、順丁二烯和三羥基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；所述引發劑體系是在0-50°C條件下能夠引發產生自由基，導致乙烯基單體發生自由基聚合的熱引發劑體系或氧化還原引劑體系；所述引發劑體系優選由下述A和B中的物質組成，所述A選自下述至少一種過硫酸鉀、過硫酸銨、過氧化氫、叔丁基過氧化氫和過氧化苯二甲酰，所述B選自下述至少一種亞鐵鹽、亞硫酸鹽、N，N’ - 二甲基苯胺、氨水、N，N’ - 二甲基-對甲苯胺、N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基嗎啉；所述引發劑體系最優選由過硫酸銨和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺組成其質量比為1.5 2；所述緩沖溶液為下述至少一種物質的水溶液乙酸、乙酸鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鈉、硼酸、硼酸鈉、硼酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀和碳酸氫鉀。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述甲基丙烯酸縮水甘油酯是以甲基丙烯酸縮水甘油酯的二甲基甲酰胺溶液形式加入PH值為3-8的緩沖溶液中。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于所述方法還包括將步驟2)得到的含脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的反應液進行截留分子量為IOKDa的透析，并將透析后的液體凍干的步驟。
5.一種制備脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的方法，其特征在于所述脂肪酶納米高分子生物催化顆粒是以下述質量份的物質為原料制成的脂肪酶10份、甲基丙烯酸縮水甘油酯2-200份、乙烯基單體75-375份和引發劑體系20-30份；包括如下步驟1)將所述脂肪酶、所述甲基丙烯酸縮水甘油酯和所述乙烯基單體加入 PH值為3-8的緩沖溶液中，在0-50°C下反應0. 5 3小時；2)向步驟1)的反應液中加入所述引發劑體系，在0-50°C繼續反應5-12小時，即得到脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述乙烯基單體是可通過自由基聚合反應形成聚合物的乙烯基單體；所述乙烯基單體優選自下述至少一種丙烯酰胺、N-異丙基丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酰化聚乙二醇、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羥乙酯、 丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、甲基丙烯酸羥丙酯、N，N’_甲叉雙丙烯酰胺、順丁二烯和三羥基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯；所述引發劑體系是在0-50°C條件下能夠引發產生自由基，導致乙烯基單體發生自由基聚合的熱引發劑體系或氧化還原引劑體系；所述引發劑體系優選由下述A和B中的物質組成，所述A選自下述至少一種過硫酸鉀、過硫酸銨、過氧化氫、叔丁基過氧化氫和過氧化苯二甲酰，所述B選自下述至少一種亞鐵鹽、亞硫酸鹽、N，N’ - 二甲基苯胺、氨水、N，N’ - 二甲基-對甲苯胺、N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺、哌啶和N-甲基嗎啉；所述引發劑體系最優選由過硫酸銨和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺組成其質量比為1.5 2；所述緩沖溶液為下述至少一種物質的水溶液乙酸、乙酸鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鈉、硼酸、硼酸鈉、硼酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀和碳酸氫鉀。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述甲基丙烯酸縮水甘油酯是以甲基丙烯酸縮水甘油酯的二甲基甲酰胺溶液形式加入PH值為3-8的緩沖溶液中。
8.根據權利要求5-7中任一項所述的方法，其特征在于所述方法還包括將步驟2)得到的含脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的反應液進行截留分子量為IOKDa的透析，并將透析后的液體凍干的步驟。
9.權利要求1-8中任一項所述方法制備得到的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒。
10.根據權利要求9所述的脂肪酶納米高分子生物催化顆粒，其特征在于所述脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的粒徑為20-50nm。
全文摘要
本發明公開了一種脂肪酶納米高分子生物催化顆粒及其制備方法。該方法的核心是采用疏水性試劑甲基丙烯酸縮水甘油酯對脂肪酶表面進行化學修飾，引入碳碳雙鍵基團，然后無需中間產物分離步驟，直接加入含有碳碳雙鍵的乙烯基單體為原料，引發自由基聚合得到目標產物。該方法生產條件溫和，制備過程簡單，可以有效避免中間修飾步驟的酶活損失，實現高酶活收率，同時顯著提高脂肪酶納米高分子生物催化顆粒的熱穩定性，并且新方法簡化了中間產物分離步驟，降低生產成本，便于實現大規模工業制備。
文檔編號C12N11/08GK102229923SQ20111010688
公開日2011年11月2日 申請日期2011年4月27日 優先權日2011年4月27日
發明者劉錚, 盧滇楠, 須丹丹 申請人:清華大學