專利名稱：家蠶蛻皮激素氧化酶eo基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體是一種來自家蠶的具有氧化昆蟲體內蛻皮激素活性的蛻皮激素氧化酶基因。
背景技術：
昆蟲的變態發育主要是由前胸腺合成分泌的蛻皮激素(Molting hormone, ΜΗ) 和咽側體合成分泌的保幼激素(Juvenile hormone, JH)協同控制的。蛻皮激素的主要作用是引發昆蟲在不同的發育階段有規律地蛻皮，從而決定昆蟲幼蟲蟲體的大小和形態的變化，對于完全變態昆蟲來說，在其幼蟲的最后一個齡期，幼蟲停止分泌保幼激素，在高濃度的蛻皮激素作用下，幼蟲完成向蛹的轉變，開始昆蟲的變態發育。從這可以看出，蛻皮激素在不同的發育時期的滴度是有規律變化的。蛻皮激素的滴度變化對昆蟲的發育起著十分重要的作用。昆蟲消減體內蛻皮激素濃度主要有兩種方式，一是通過排泄排出體外，另外是通過將蛻皮激素轉化為非活化形式從而降低體內蛻皮激素的濃度。目前研究證明，有很多轉化途徑能使蛻皮激素失活(Rees 1995)，例如形成非活性的3位差向異構化蛻皮激素 (3-epiecdysone)。先前研究認為這一失活途徑在鱗翅目昆蟲中尤為重要。昆蟲中蛻皮激素的3位差向異構化途徑主要經過兩步蛻皮激素在蛻皮激素氧化酶(Ecdysone Oxidase, E0)的作用下合成3位脫氫蛻皮激素，3位脫氫蛻皮激素進一步在 3 位脫Si兌皮激素 α 還原(3dehydro-ecdysone-3 α -reductase, 3DE-3 α -reductase) 的作用下形成非活性形式3位差向異構化蛻皮激素，從而使蛻皮激素活性喪失。其中蛻皮激素氧化酶(EO)是該途徑的限速酶。因此，研究EO對于理解昆蟲蛻皮激素的周期性變化起著重要作用。目前為止，蛻皮激素氧化酶的生理、生化性質已經在很多昆蟲中有研究。但是，編碼該酶的基因的研究卻很少。家蠶是重要的經濟型昆蟲，也是鱗翅目昆蟲的模式代表，但是被確認為家蠶蛻皮激素氧化酶基因的研究尚未見報道。
發明內容
本發明的目的在于利用生物信息學、生物工程等方法在家蠶中克隆并鑒定蛻皮激素氧化酶基因。將該基因導入真核表達系統中，經誘導使其表達。酶活性測定證實其具有蛻皮激素氧化酶的活性。最后利用轉基因手段將該基因轉入家蠶體內，通過特異性啟動子使目的基因特異地高量表達，從而降低蟲體內蛻皮激素的滴度，進而人為地調節家蠶的生
長發育。本發明申請人利用生物信息學方法在家蠶基因組中鑒定了一個蛻皮激素氧化酶基因。利用家蠶5齡3天總cDNA為模板，設計了一對特異的蛻皮激素氧化酶EO引物，然后進行克隆，得到了一段序列。測序驗證為目的序列。然后將該基因連接在表達載體PPIC9K 上。并經誘導表達，證實了酶活性，為下一步將該基因導入家蠶中奠定了物質基礎。本發明的家蠶蛻皮激素氧化酶萬0基因通過以下步驟得到(1)首先以NCBI上已報道的鱗翅目昆蟲海灰翅夜蛾〈Spodopteralittoral is)中蛻皮激素氧化酶基因(S1E0登錄號為AY035784)為問詢序列，用Blast程序在家蠶表達數據庫 (EST)和基因組數據庫搜尋家蠶的同源基因。通過信息分析，最終得到一條匹配度最高的基因。該基因的核苷酸序列長2007 bp，有5個外顯子，位于家蠶第17號染色體上。該基因編碼一個含668個氨基酸的蛋白質，具有典型的葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶基因家族結構域，該序列與海灰翅夜蛾的SlEO相似性達到56%，并且該蛋白質具有保守的蛻皮激素結合位點(Leu96，Met346, Ala446, Thr533和Trp536)。因此，該基因為家蠶蛻皮激素氧化酶的候選基因。基于候選基因的核苷酸序列設計特異性引物，上游為5’ GAATTCATGGTTTGCGGGTTG 3’，下游為5’ GCGGCCGCTCATGCGACATTGAC 3’ ；劃線部分為酶切位點，其中上游引物的酶切位點為SnaB I，下游引物的酶切位點為Not I ；
(2)提取家蠶5齡3天幼蟲的全蠶RNA，然后將其反轉成cDNA，并以其為模板，用設計的特異性引物進行擴增，獲得目的條帶，PCR產物回收后與PMD-19-T載體連接轉化入大腸桿菌Dffia感受態細胞，獲得陽性克隆后送往上海生工生物工程公司測序，測序結果表明擴增的序列與預期的結果一致；
(3)將含有目的片段的T克隆與酵母表達載體pPIC9K分別用SnaBI和Not I進行雙酶切，分別回收目的片段，電泳檢測后，用DNA連接酶將其連接，并轉化大腸桿菌Dffia感受態細胞，篩選獲得含有pPIC9K-BmE0重組質粒的克隆，然后將擴大培養的菌液送往上海生工生物工程公司測序，測序結果與第一次測得的序列一致，獲得正確的克隆；
(4)提取重組質粒pPIC9K-BmE0將其進行線性化和去磷酸化，然后用電擊轉化的方法轉入酵母感受態細胞O0ZcAia pas tor is X_33)，再涂于MD板上培養兩天，挑取單菌落，之后點種于含G418的YPD板上進行陽性克隆的篩選，再進行PCR驗證確認其BmEO基因已導入酵母菌中，再置于BMMY中培養，添加甲醇以誘導BmEO的表達，取上清液進行蛻皮激素氧化酶酶活性的測定；
(5)對蛻皮激素氧化酶的酶活性進行測定。 通過上述方法獲得家蠶蛻皮激素氧化酶萬0基因，其完整的CDS及推斷的氨基酸序列如下
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昆蟲正常變態發育要求高量的蛻皮激素，如果能在家蠶的蛹期有效地降低蛹體內的蛻皮激素濃度就有可能阻斷家蠶的變態發育進程，從而使其永遠停留在蛹期，稱為“永久蛹”。 蠶業生產上為了獲得蠶絲，收繭后必須及時烘繭以殺死蠶蛹，否則，蠶蛹發育成成蟲一蛾子就會咬破蠶繭出殼，破壞蠶絲的完整度。因此，“永久蛹”在蠶業生產上有巨大的經濟和生態效益價值。本發明獲得的蛻皮激素氧化酶萬0基因，其表達產物能有效地催化作用于蛻皮激素，使得蛻皮激素的活性降低，可以有效地降低昆蟲體內蛻皮激素的滴度。將萬0基因利用轉基因技術導入家蠶體內，使其在蛹期高量表達，從而調節蛻皮激素的滴度，進而人為地控制家蠶的發育。
具體實施例方式實施例1
家蠶蛻皮激素氧化酶基因的生物信息學鑒定
首先以NCBI上已報道的鱗翅目昆蟲海灰翅夜蛾〈Spodoptera littoral is)中蛻皮激素氧化酶基因(S1E0登錄號為AY035784)為問詢序列，用Blast程序在家蠶表達數據庫 (EST)和基因組數據庫搜尋家蠶的同源基因。通過生物信息學分析，最終得到一條匹配度最高的基因。該基因編碼的蛋白質序列與海灰翅夜蛾的SlEO相似性達到56%，并且該蛋白質具有保守的蛻皮激素結合位點(Leu96，Met346, Ala446, Thr533和Trp536)。因此，該基因為家蠶蛻皮激素氧化酶的候選基因。實施例2
家蠶蛻皮激素氧化酶基因的克隆
基于候選基因的核苷酸序列設計特異性引物，上游為5’ GAATTCATGGTTTGCGGGTTG 3’，下游為5’ GCGGCCGCTCATGCGACATTGAC 3’ ；劃線部分為酶切位點，其中上游引物的酶切位點為SnaB I，下游引物的酶切位點為Not I。提取家蠶5齡3天的全蠶RNA，用MLV反轉
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7錄酶(promega公司生產)將其反轉成cDNA，然后以其為模板，用設計的特異性引物進行擴增，獲得目的條帶，PCR產物回收后與PMD19-T載體連接轉化入大腸桿菌Dffia感受態細胞， 獲得陽性克隆后送往上海生工生物工程公司測序，測序結果表明擴增的序列與預期的結果一致。 實施例3:
家蠶蛻皮激素氧化酶基因的真核表達及酶活測定
將含有目的片段的τ克隆與PPIC9K空質粒分別用SnaB I和Not I進行雙酶切，分別回收目的片段，以solution I連接酶將其連接并轉化大腸桿菌Dffia感受態細胞，篩選獲得含有pPIC9K-BmE0的克隆，然后將擴大培養的菌液送往上海生工生物工程公司測序，測序結果與第一次測得的序列一致，獲得正確的克隆；提取質粒PPIC9K-E0將其進行線性化和去磷酸化處理，然后用電擊轉化的方法轉入畢赤酵母感受態中，再涂于MD板上培養兩天， 挑取最先長的單菌落，之后點種于含G418的YPD板上進行陽性克隆的篩選，再進行PCR驗證確認其BmEO基因已導入酵母菌中，然后置于BMMY中培養，添加甲醇以誘導BmEO基因的表達。利用飽和硫酸銨法沉淀表達上清液中的蛋白，用Tris-Hcl緩沖液溶解蛋白，過夜透析。然后取溶解液加入蛻皮激素進行酶促反應，反應產物用高效液相色譜(HPLC)檢測。結果表明除了蛻皮激素的色譜峰以外，還有一個多出的色譜峰，根據3位脫氫蛻皮激素標準品的出峰時間，鑒定結果多出的色譜峰即為3位脫氫蛻皮激素，進而證實了該酶具有蛻皮激素氧化酶活性。
權利要求
1.家蠶蛻皮激素氧化酶EO基因，其特征在于具有如說明書序列表所示的核苷酸序列。
2.家蠶蛻皮激素氧化酶EO基因編碼的蛋白質，其特征在于具有如說明書序列表所示的氨基酸序列。
全文摘要
一種來自家蠶的具有氧化昆蟲體內蛻皮激素活性的蛻皮激素氧化酶EO基因，利用生物信息學、生物工程等方法在家蠶中克隆得到。其表達產物能有效地催化作用于蛻皮激素，使得蛻皮激素的活性降低，可以有效地降低昆蟲體內蛻皮激素的滴度。將EO基因利用轉基因技術導入家蠶體內，使其在蛹期高量表達，從而調節蛻皮激素的滴度，進而人為地控制家蠶的發育。
文檔編號C12N15/10GK102250930SQ201110199448
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月18日 優先權日2011年7月18日
發明者向仲懷, 孫偉, 張澤, 沈以紅 申請人:西南大學