專利名稱：新的氧化酶基因及使用該基因生產3-吲哚-丙酮酸的方法
技術領域：
本發明涉及新的氧化酶基因及利用該基因生產3-吲哚-丙酮酸的新方法。
背景技術：
在Giovanna De Luca等的用于生產3-吲哚-丙酮酸的化學方法中，通過在存在 用于使質子受體脫水的堿的條件下使作為起始材料的色氨酸與吡啶醛反應，以50-62%產 率獲得了 3-吲哚-丙酮酸(參見JP Sho-62-501912[專利文件1]，國際公開87/00169小 冊子[專利文件2])。在此方法中，所需要的堿和吡啶醛價格昂貴，而且產率低。結果， 其生產成本似乎很高。通過使用吲哚和3-溴-2-肟基丙酸乙酯(ethyl-3-bromopyruvate ester oxime)作為原料進行的縮合反應及隨后進行的酸水解，Politi Vincenzo等以64%產 率獲得了 3-吲哚-丙酮酸(參見歐洲專利申請公開No.421946[專利文件3])。在此方法 中，需要使用硅膠進行的純化步驟，產率低，原料昂貴，而且工業生產的成本很高。另一方面，作為生產3-吲哚-丙酮酸的酶促方法，使用氨基轉移酶進行的方法 是已知的(參加下文反應式1)。(反應式1)
氣基轉移酶已經報告了如下的一種方法，其中通過容許源自麥芽糖假絲酵母(Candida maltosa)的L-色氨酸(L-Trp)氨基轉移酶作用于L-Trp而自40mM L-色氨酸和80mM 2_酮戊二酸生成3-吲哚-丙酮酸，并通過離子交換樹脂純化以實現72%的產率(參見 Bobe Ruediger等，東德專利DD 297190[專利文件4])，還已經報告了如下的一種方法， 其中容許天冬氨酸氨基轉移酶作用于L-Trp和2-酮戊二酸以生成3-吲哚-丙酮酸，然 后通過用石油醚萃取反應液和通過柱層析進行的分級進行純化，并收集級分(參見Mario Materazzi 等，JPSho_59-95894_A[專利文件 5])。國際公開 No.2003/091396 小冊子[專 利文件6]和美國專利申請公開No.2005/0282260[專利文件7]記載了由源自大腸桿菌 (Escherichia coli)的aspC基因和tyrB基因編碼的氨基轉移酶。在使用氨基轉移酶進行的 這些方法中，產率是低的，需要作為氨基受體的酮酸(如2-酮戊二酸)作為L-Trp之外 的原料，而且以與待產生的3-吲哚-丙酮酸等摩爾的量生成與所存在的氨基受體對應的 一種氨基酸作為副產物。此外，為了提高產率，向反應體系添加相對于L-Trp過量的酮 酸。如此，在反應后剩余未反應的酮酸。由于這些原因，為了自反應液收集目標3-吲 哚-丙酮酸，需要使用離子交換樹脂進行的純化步驟。如此，操作是復雜的，而且成本 是高的。作為自L-Trp生產3-吲哚-丙酮酸的方法，使用L-氨基酸氧化酶的方法也是已知的。然而，在這點上，3-吲哚-丙酮酸被L-氨基酸氧化酶氧化色氨酸(參見下文反 應式2)時作為副產物生成的過氧化氫分解成吲哚乙酸(參見下文反應式3)。如此，產生 了通過向反應體系添加過氧化氫酶來分解過氧化氫(參見下文反應式4)的方法(參見美 國專利No.5,002,963，授予De Luca等，1991[專利文件8])。(反應式2)
權利要求
1.選自如下(a) (e)的多核苷酸(a)編碼具有SEQID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質的多核苷酸；(b)編碼具有在SEQID NO: 2所示氨基酸序列中取代、缺失和/或插入一個或數個 氨基酸而得到的氨基酸序列且具有氧化酶活性的蛋白質的多核苷酸；(C)編碼具有與SEQ ID NO 2所示氨基酸序列有90%或更高的同源性的氨基酸序列 且具有氧化酶活性的蛋白質的多核苷酸；(d)具有SEQID NO 1所示核苷酸序列中核苷酸編號第61-1476位的核苷酸序列的 多核苷酸；(e)與SEQID NO 1所示核苷酸序列中核苷酸編號第61-1476位的核苷酸序列的互 補核苷酸序列或與能夠由該序列制備的探針在嚴格條件下雜交，且編碼具有氧化酶活性 的蛋白質的多核苷酸。
2.如權利要求1所述的多核苷酸，其中所述嚴格條件是以相當于1XSSC和0.1 % SDS 的鹽濃度于60°C進行清洗的條件。
3.—種重組多核苷酸，其具有如權利要求1或2所述的多核苷酸。
4.一種轉化體，其中導入了如權利要求3所述的重組多核苷酸。
5.—種生產氧化酶的方法，其特征在于在培養基中培養如權利要求4所述的轉化體， 從而在該培養基和/或轉化體中積累氧化酶。
6.一種生產3-吲哚-丙酮酸的方法，其包括在如權利要求4所述的轉化體和/或其 培養物的存在下將色氨酸轉變成3-吲哚-丙酮酸的步驟。
7.如權利要求6所述的生產3-吲哚-丙酮酸的方法，其中向將色氨酸轉變成3-吲 哚_丙酮酸的反應體系中添加超氧化物歧化酶。
8.如權利要求6所述的生產3-吲哚-丙酮酸的方法，其中向將色氨酸轉變成3-吲 哚_丙酮酸的反應體系中添加表達超氧化物歧化酶的轉化體和/或其培養物。
9.如權利要求8所述的生產3-吲哚-丙酮酸的方法，其中所述培養物是通過破裂表 達所述超氧化物歧化酶的所述轉化體的細胞膜而獲得的。
全文摘要
本發明提供了實現3-吲哚-丙酮酸的節約且便利生產的手段。使用具有限定堿基序列的多核苷酸構建了轉化體，該限定堿基序列編碼具有氧化酶活性的蛋白質。然后，在培養基中培養此轉化體，如此通過在培養基和/或轉化體中積累氧化酶而生成氧化酶。另外，在存在上文所述轉化體和/或其培養物的條件下將色氨酸轉變成3-吲哚-丙酮酸，由此生成3-吲哚丙酮酸。
文檔編號C12N1/21GK102027117SQ20088010414
公開日2011年4月20日 申請日期2008年8月15日 優先權日2007年8月24日
發明者原誠一, 杉山雅一, 橫關健三, 渡部乙比古, 田場登志希, 鈴木俊一, 高倉康彰 申請人:味之素株式會社