專利名稱：一種快速篩選加氧酶微生物或加氧酶基因的方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種快速篩選加氧酶微生物或者加氧酶基 因的方法。
背景技術：
生物催化以其高度的化學、區域、立體選擇性和反應條件溫和，后處理容易，能耗 低等優勢成為當今化工生產和相關技術領域的發展潮流，并已成功應用于許多領域。生物 酶是生物催化技術的核心，新型高效催化酶的獲得成為該領域的技術瓶頸。目前，加氧酶的 開發利用還非常有限，其中重要的原因之一就是傳統加氧酶的篩選方法存在許多局限，使 得很難篩選到高效、高選擇性的加氧酶菌株和基因。本發明提到的加氧酶，包括環氧化酶和芳環雙加氧酶，如萘雙加氧酶等，目前其篩 選方法主要有三類。一類是通過利用唯一碳源篩選菌株。由于環境樣品可利用同一碳源的 微生物種群非常豐富，這種方法在篩選過程中往往會得到大量的微生物，而目標產加氧酶 菌株很難從中篩選到，特別是在處理特殊環境樣本時，如加氧酶豐富的活性污泥，極易受到 其他功能微生物的干擾，如瓊脂利用型細菌，假陽性率很高。一類是直接用薄板層析、高壓 液相或氣相等分析手段檢測所篩目標加氧酶的催化產物，如苯乙烯環氧化酶篩選中，通過 測定產物苯乙烯環氧的生成來檢測酶的存在(例如，Park et al. (2005)Korean J. Chem. Eng.，22 (3)，418 424)。這種方法通量低，耗時長，更重要的是，由于采用天然底物，其氧 化產物在微生物體內往往會被下游多個酶迅速連續代謝，很難捕捉到中間的目標加氧酶的 催化產物，導致漏檢率極高。第三類是根據加氧酶氧化其他易檢測的底物來間接證明酶的 存在，如加氧酶(環氧化酶，P450單加氧酶等)篩選中可用1-氫吲哚為底物，通過檢測顏 色生成來獲知加氧酶的存在(如，Hellemond et al. (2007) Appl. Environ. Microbiol., 73(18)，5832 5839)。這種方法已被應用于重組酶的篩選，而針對環境樣本篩選天然源微 生物則尚未見報道。此方法較為直觀簡便，但以1-氫吲哚為底物，顯色時間長，多達4天以 上，而且產物為靛藍和靛玉紅的混合物，導致形成的藍色淺，產物摩爾吸光系數較低，與大 腸桿菌菌體的黃色混合后呈黃綠色，不易識別，極易造成加氧酶有益資源的漏篩。有文獻報 道4-取代吲哚經氧化偶聯后由于4位的位阻原因無法生成4，4’- 二取代靛玉紅，只能生成 單一的產物4，4’ - 二取代靛藍，這個特點顯示出4-取代吲哚在顯色反應方面的應用潛力 優于 I-氫吲哚(Polychronopoulos et al. (2004) J. Med. Chem.，47，935 946 ；Wu etal. (2005)Chem. Biodivers. ,2,51 65)。在重組酶細胞色素P4502A6的定向進化研究中，報 道了利用4-氯吲哚開展突變子篩選的方法，但是迄今為止，也尚未見報道針對環境樣品篩 選天然源微生物。
發明內容
本發明目的是提供一種從環境樣品中快速篩選加氧酶的方法，即在篩選培養基中 加入4-取代吲哚，經加氧酶氧化生成可直接觀察的藍色物質4，4’- 二取代靛藍，從而簡便、快速、靈敏的從環境樣品中篩選出目的加氧酶。本發明的具體方案是1.環境樣品中篩選產加氧酶菌株產加氧酶菌株篩選包括以下步驟為①富集環境樣品環氧化酶富集采用苯乙烯或環己烯或對溴苯乙烯或甲基苯乙烯 為唯一碳源；萘雙加氧酶富集選用萘或者蒽為唯一碳源；并添加無機鹽，30°C震蕩培養富 集環境樣品5 15天。②以無機鹽、唯一碳源、4-取代吲哚以及0. 01% 0. 的酵母粉制備瓊脂固體 培養基，富集的環境樣品涂布于培養基上，生長1 5天，出現藍色菌落，將藍色菌落以相同 組分的培養基分離，純化，獲得產目標加氧酶的微生物菌株。無機鹽可為常用的M9無機鹽(分子克隆實驗指南，中文版，第三版，下冊，頁 碼1595 1596)或者文獻報道的 M12 無機鹽(Hartmans et al. (1989)Appl. Environ. Microbiol.，55(11)，2850 2855)。唯一碳源的濃度為0. 05 8mM。4-取代吲哚濃度為0.05 ImM，4-取代吲哚為4-甲基吲哚或4_吲哚甲酸甲酯或 4-氯吲哚或4-溴吲哚或4-氟吲哚或4-甲氧基吲哚。2.環境樣品構建的元基因組庫中篩選加氧酶基因包括以下步驟①構建環境樣品的元基因組文庫以CTAB法從環境樣品中提取總DNA，并純化，將 純化好的總DNA酶切，經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后，回收1 IOKb之間的片段；載體質粒以 相同酶酶切，并用去磷酸化酶(CIP)處理。將回收得到1 IOKb之間的DNA片段連入載體， 連接產物經醇沉處理，用去離子水溶解，電轉化大腸桿菌感受態細胞，構建環境樣品元基因 組文庫。②從元基因組文庫中篩選加氧酶基因將元基因組文庫質粒轉入宿主大腸桿菌，涂布于固體篩選平板上。培養基組分為 LB固體培養基中加入4-取代吲哚、IPTG 0. 2 ImM和載體相應的抗生素。轉化子在篩選 平板上生長1 2天或者于4°C再放置1 5天，可出現藍色重組菌落，挑出，得到含有加氧 酶基因的重組子。環境樣品基因組文庫可以是環境樣品基因組總DNA直接構建的文庫，也可以是經 樣品富集后構建的目標加氧酶文庫。文庫構建中選用的載體為pBluescript SK或pBluescript KS或pUC18或pUC19 或pKK233或pKK223或pET_28或pET_32載體；文庫篩選中宿主大腸桿菌為DHl或DH5 α 或 DHlOB 或 JM109 或 MC1061 或 BL21 (DE3)或 XL-Blue。本發明利用許多加氧酶可以將4-取代吲哚氧化，生成單一的深藍色物質4，4’_ 二 取代靛藍，其產物單一，摩爾吸光系數高，因此大大提高了篩選靈敏度。可以高通量，簡便， 快速，靈敏的篩選環境樣品中存在的加氧酶資源。本方法可用于篩選環氧化酶和芳環雙加 氧酶，如萘雙加氧酶等多種加氧酶。
圖1為篩選平板；
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圖2為純化平板；圖3為篩選菌株進化樹；圖4為篩選菌株環氧化酶進化樹；圖5為整細胞轉化4-取代吲哚后的萃取物照片，其中(1)為4-溴吲哚，(2)為 4_氟吲哚，⑶為4-吲哚甲酸甲酯，(4)為4-甲氧基吲哚，(5)為4-甲基吲哚，(6)為4-氯 吲哚。
具體實施例方式實施例1以4-氯吲哚為底物篩選產環氧化酶菌株于某污水處理廠取活性污泥樣品，富集于含有M12無機鹽和苯乙烯(濃度為2mM) 的培養基中，30°C，225rpm培養10天。將富集培養液稀釋至篩選平板上(M12+苯乙烯 2mM+4-氯吲哚0. ImM+O. 01%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養3天，每支平板上可見多 個成片藍色菌斑(圖1)，挑出，繼續純化(圖2)，得到11株純菌株。實施例2以4-甲基吲哚為底物篩選產環氧化酶菌株樣品及富集方法同實施例1，將富集培養液稀釋至篩選平板上(M9+苯乙烯 2mM+4-甲基吲哚0. 2mM+0. 05%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養3天，出現藍色菌斑，繼 續純化，得到15株純菌株。實施例3以4-引哚甲酸甲酯為底物篩選產環氧化酶菌株樣品及富集方法同實施例1，將富集培養液稀釋至篩選平板上(M9+苯乙烯 3mM+4-引哚甲酸甲酯0. 3mM+0. 06%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養4天，出現藍色菌 斑，繼續純化，得到12株純菌株。實施例4以4-溴吲哚為底物篩選產環氧化酶菌株取自另一污水處理廠樣品，富集方法同實施例1，將富集培養液稀釋至篩選平板上 (M9+苯乙烯3mM+4-溴吲哚0. 2mM+0. 05%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養4天，出現深 藍色菌斑，繼續純化，得到10株純菌株。實施例5篩選菌株碳源利用情況實施例1、2、3、4篩選的菌株，分別以苯乙烯和苯乙烯環氧為唯一碳源培養，分別 為M12+苯乙烯5mM ；M12+苯乙烯環氧3mM。24h后，所有菌株均能在兩種培養基中生長，即 篩選菌株能以苯乙烯和苯乙烯環氧為唯一碳源，具有苯乙烯至苯乙烯環氧這一代謝途徑， 因此可產生這一途徑所需的環氧化酶。實施例6產環氧化酶菌株的16S rRNA鑒定實施例1、2、3、4篩選的菌株是可利用苯乙烯、苯乙烯環氧為唯一碳源生長， 并使4-取代吲哚變藍的菌株。為驗證這些菌株為目的菌株，對其進行16S rRNA鑒 定。以細菌通用引物擴增16S rRNA序列。引物為F :5，-AGAGTTTGATCCTCGCTCAG, R 5‘-GGTCTACCTTGTTACGACTT,得到擴增片段大小為1498bp。經比對，其基因序列有數十個堿 基差異。其中，實施例1有三種16S rRNA序列不同的菌株，實施例2、3所得菌株與實施例 1完全相同(實施例1和2、3來自同一活性污泥樣品)，而實施例4則有二種16S rRNA序 列不同的菌株。經比對分析，所篩菌株全部為假單胞菌屬。選擇實施例1、2、3篩選的16S rRNA序列不同的三株菌WLS1-1、WLS1-5、WLS1_8和實施例4篩選的WLS4_1、WLS4_9作進化
5樹分析。圖3為篩選菌株進化樹，其中Pseudomonas sp. VLB 120為已報道的具有環氧化酶 功能的假單胞菌，所篩菌株與VLB 120菌株已報道的16S rRNA基因序列相似度均>99%， 證明采用本發明篩選的菌株為產環氧化酶的假單胞菌。實施例7環氧化酶基因特征片段的驗證經實施例6鑒定，篩選菌株為假單胞菌。為進一步證實這些菌株含有環氧化 酶基因序列，將上述5株篩選菌擴增環氧化酶基因StyA部分特征片段。根據NCBI基 因庫中報道的假單胞菌環氧化酶序列，設計引物，F 5 ’ -ATGAAAAAGCGTATCGGTATTG ； R 5，-TTCTCGAAGGGCGAGTTTTC, PCR擴增得到488bp片段，命名為styAsp。圖4為篩選菌株特 征片段styAsp-Ι和styAsp-2與已報道的假單胞菌來源的環氧化酶的相似度分析，其相應 片段相似度為97% 100%。因此，采用本發明篩選的菌株為產環氧化酶(苯乙烯單加氧 酶)的假單胞菌菌株。實施例8以4-甲基氧吲哚為底物篩選產萘雙加氧酶的菌株樣品來源同實施例1，富集于含有M12無機鹽和萘(濃度為7mM)的培養基 中，30°C，225rpm培養12天。將富集液稀釋至篩選平板上(M12+萘7mM+甲氧基吲哚 0. 6mM+0. 06%酵母粉+1. 5%瓊脂粉)于30°C培養7天，平板上有藍色菌斑出現，分離、純化 得到23株純菌株(編號為NPCL-I至NPCL-23)。實施例9以4-氟吲哚為底物篩選產萘雙加氧酶的菌株樣品來源同實施例4，培養方法同實施例8，篩選底物為4-氟吲哚(濃度為 0. 3mM)，將藍色菌斑分離純化得到15株菌株(編號為NPF-I至NPF-15)。實施例10篩選菌株以萘為唯一碳源生長情況實施例8、9篩選的菌株以萘為唯一碳源培養，即M12+萘5mM，結果顯示所有菌株均 能以萘為唯一碳源生長，可產萘雙加氧酶。實施例11產萘雙加氧酶菌株的16S rRNA鑒定為驗證實施例8和9得到的菌株為產萘雙加氧酶的菌株，任選其中標號為NPCL-2、 NPCL-5、NPF-7、NPF-11的4株進行16S rRNA鑒定。其中NPCL-5鑒定為銅綠假單胞菌屬細 菌，NPCL-2、NPF-7、NPF-11為伯克霍爾德菌屬細菌。這兩類菌均有產萘雙加氧酶的報道，進 一步證明采用本發明方法篩選到的菌株為產萘雙加氧酶的菌株。實施例12萘雙加氧酶基因特征片段的驗證對實施例11所述的4株菌的萘雙加氧酶基因進一步驗證，分別擴 增PAH基因，該基因為革蘭氏陰性細菌降解PAHs類化合物的環羥基化雙加氧酶 (ring-hydroxylating-dioxygenase, RHD) α 亞基白勺部分基因。PAH 基因擴增采用簡并弓丨物，F :5，-GAGATGCATACCACGTKGGTTGGA ;R 5，-AGCTGTTGTTCGGGAAGAYWGTGCMGTT，擴增片段長度為 306bp。表1篩選菌株PAH基因片段驗證
權利要求
一種快速篩選加氧酶微生物的方法，其特征在于包含以下步驟①富集環境樣品環氧化酶富集采用苯乙烯或環己烯或對溴苯乙烯或甲基苯乙烯為唯一碳源；萘雙加氧酶富集選用萘或者蒽為唯一碳源；并添加無機鹽，30℃震蕩培養富集環境樣品5～15天；②以無機鹽、唯一碳源、4 取代吲哚以及0.01％ 0.1％的酵母粉制備瓊脂固體培養基，富集環境樣品涂布于培養基上，生長1 5天，出現藍色菌落，將藍色菌落以相同組分的培養基分離，純化，獲得產目標加氧酶的微生物菌株。
2.一種快速篩選加氧酶基因的方法，其特征在于包含以下步驟①構建環境樣品的元基因組文庫以CTAB法從環境樣品中提取總DNA，并純化，將純化 好的總DNA酶切，經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后，回收1 IOKb之間的片段；載體質粒以相同 酶酶切，并用去磷酸化酶(CIP)處理；將回收得到1 IOKb之間的DNA片段連入載體，連接 產物經醇沉處理，用去離子水溶解，電轉化大腸桿菌感受態細胞，構建環境樣品元基因組文 庫；②從元基因組文庫中篩選加氧酶基因將元基因組文庫質粒轉入大腸桿菌，涂布于固體篩選平板上；培養基組分為LB固體 培養基中加入4-取代吲哚、IPTG 0. 2-lmM和載體相應的抗生素；轉化子在篩選平板上生長 1-2天或者于4°C再放置1-5天，出現藍色重組菌落，挑出該藍色重組菌落，得到含有加氧酶 基因的重組子。
3.權利要求1所述的快速篩選加氧酶微生物的方法，其特征是無機鹽為常用的M9無 機鹽或者M12無機鹽；唯一碳源的濃度為0. 05-8mM。
4.權利要求1所述的快速篩選加氧酶微生物的方法，其特征是4_取代吲哚濃度為 0. 05-lmM, 4-取代吲哚為4-甲基吲哚或4-吲哚甲酸甲酯或4-氯吲哚或4-溴吲哚或4-氟 吲哚或4-甲氧基吲哚。
5.權利要求2所述的快速篩選加氧酶基因的方法，其特征是4_取代吲哚濃度為 0. 05-lmM, 4-取代吲哚為4-甲基吲哚或4-吲哚甲酸甲酯或4-氯吲哚或4-溴吲哚或4-氟 吲哚或4-甲氧基吲哚。
6.權利要求2所述的快速篩選加氧酶基因的方法，其特征是環境樣品基因組文庫為 環境樣品基因組總DNA直接構建的文庫或為經樣品富集后構建的目標加氧酶文庫 ’文庫 構建中選用的載體為pBluescript SK或pBluescript KS或pUC18或pUC19或pKK233或 ΡΚΚ223或ρΕΤ-28或ρΕΤ_32載體，宿主大腸桿菌為DHl或DH5 α或DHlOB或JM109或MC1061 或 BL21(DE3)或 XL-Blue。
全文摘要
本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種快速篩選加氧酶微生物或者加氧酶基因的方法。本發明快速篩選加氧酶微生物的方法包含用唯一碳源富集環境樣品和將富集環境樣品涂布于培養基上，進行培養、分離和純化，獲得產目標加氧酶的微生物菌株；快速篩選加氧酶基因的方法包含構建環境樣品的元基因組文庫和從元基因組文庫中篩選加氧酶基因。本發明具有篩選靈敏度高，可高通量、簡便、快速地篩選環境樣品中存在的加氧酶資源。
文檔編號C12Q1/04GK101942497SQ20091005992
公開日2011年1月12日 申請日期2009年7月8日 優先權日2009年7月8日
發明者劉艷, 吳中柳, 張志剛, 張超 申請人:中國科學院成都生物研究所