專利名稱：豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒。
背景技術：
豬圓環病毒2 型(Porcine circocirus type2, PCV-2)、豬偽狂犬病毒 (Pseudorabies virus, PRV)和豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是目前常見的引起豬繁殖障礙病的DNA病毒。目前，很多豬場都同時存在上述三種病毒引起的疾病，給養豬業造成巨大的經濟損失。以上三種病毒常呈現混合感染，在臨床上以受感染母豬產死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬為主要特征，不容易區分。國內外豬病現有常用診斷技術主要包括臨床診斷、病原診斷、血清學診斷，分子生物學診斷等。臨床診斷主要依據流行病學、臨床癥狀和尸體剖檢來判斷疾病種類，難以做到確診。病原分離是最經典和可靠的病原診斷方法，特異性高，可直接確診，但病毒分離所需時間較長，成本較高。血清學檢測技術有血清中和試驗(Neutralization test)、 凝集性試驗(Agglutination test)、焚光抗體技術(Fluorescent-labelled abtibody technic)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、斑點金免疫滲濾法、膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatography)等。熒光抗體技術具有快速、鑒別準確、可靠、分辨率高等優點，但費用昂貴(需配備熒光顯微鏡)、特異性差、主觀性強(需有經驗的檢驗員)，同時難區分非特異性染色。其他血清學技術主要用于檢測血清抗體水平。目前最常用的血清學診斷方法是ELISA，應用很廣，發展很快，是檢測抗體的主要免疫學方法，也是監測豬群抗體水平的主要技術手段，常用于規模化養豬場的免疫水平監測。分子生物學檢測技術包括聚合酶鏈式反應(PCR)、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT - PCR)、實時熒光定量PCR (Real Time Quantitative PCR)、實時熒光定量 RT-PCR (Real Time Quantitative RT-PCR)核酸探針技術、基因芯片檢測技術等。常規單項PCR及實時定量PCR—次只能檢測一種病毒，費時費力，多種病因混合感染時，難以應用常規方法進行早期快速檢測。多重PCR及實時定量PCR 可以同時檢測多種病毒，方便快捷，省時省力。本發明首次將實時定量PCR技術應用于同時檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測領域，提供了針對豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測的特異性引物、探針序列、試劑盒和檢測方法。
發明內容
本發明要解決的第一個技術問題是提供一組特異性強、靈敏度高的同時檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的核苷酸序列，包括引物和探針。本發明要解決的第二個技術問題是提供快速、準確、使用方便的同時檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒。
為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案
本發明提供了檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的引物和探針，具體如
下
1.通過序列比較，根據PCV 0RF2基因的序列(GenBank :EU257513)，在其保守區設計一對引物及一條探針
1)PCV 正義引物(PCV-F) 5’ CCTCCCGCCATACCATAACC 3’ (SEQ ID NO 1)；
2)PCV 反義引物(PCV-R) 5，CTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTTGG 3，(SEQ ID NO 2)；
3)PCV 探針(PCV-probe) 5，(FAM) CCCTTCTCCTACCACTCCCGSTACTTTAC (ECLIPSE) 3， (SEQ ID NO :3)，該探針的5，端標記報告熒光基團FAM, 3'端標記淬滅熒光基團ECLIPSE ；
其中，S代表兼并堿基G或C。2.通過序列比較，根據PRV gH基因的序列(GenBank :X58868)，在其保守區設計一對引物及一條探針
4)PRV 正義引物(PRV-F) 5，ACATGGAGGAGCAGCTCATG 3，，(SEQ ID NO 4)；
5)PRV 反義引物(PRV- R) 5，AAGAGCATCAGGGCCTTGAC 3，，(SEQ ID NO 5)；
6)PRV 探針(PRV- probe)
5，(TAMARA )CGCCAACTCCACCATCCCCAGC(ECLIPSE) 3，，(SEQ ID NO :6)。3.通過序列比較，根據PPV VP2基因的序列(GenBank :DQ464345)，在其保守區設計一對引物及一條探針
7)PPV 正義引物(PPV-F) 5，CAAGAAATATTCAATGTAGTRCTTAAAAC 3，(SEQ ID NO 6)；
8)PPV 反義引物(PPV-R) 5，GTGTGTATGGAAGTGTGTTATTGG 3，(SEQ ID NO 7)；
9)PPV 探針(PPV-probe)
5，(JOE) CAGAATCAGCAACCTCACCACCAACCAA (ECLIPSE) 3，(SEQ ID NO :9)，該探針的 5’端標記報告熒光基團J0E，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE ； 其中，R代表兼并堿基A或T。本發明還提供了一種豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒，由以下組分組成
1)DNA提取試劑；通常可以使用商業購買的DNA提取試劑盒或使用常規SDS裂解法中通常使用的各種試劑，DNA提取試劑盒可以選擇例如上海博彩生物科技有限公司的DNA提 ￠( ^ (Genomic DNA Purification kit, cat. no K201)；
2)DNA標準品含豬圓環病毒靶基因的T載體質粒，含豬偽狂犬病毒靶基因的T載體質粒和含豬細小病毒靶基因的T載體質粒；
3)實時定量PCR反應液，其包括含有Ti^DNA聚合酶、dNTP的PCR緩沖液，檢測豬圓環病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，檢測豬偽狂犬病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，檢測豬細小病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，熒光定量PCR參比染料；
優選使用1X含有7 沖NA聚合酶、dNTP PCR緩沖液，檢測豬圓環病毒的正義引物 0. 2μΜ、反義引物0. 2Μ和熒光探針0. 4μΜ，檢測豬偽狂犬病毒的正義引物0. 2μΜ、反義引物 0. 2μΜ和熒光探針0. 4μΜ，檢測豬細小病毒的正義引物0. 2μΜ、反義引物0. 2μΜ和熒光探針 0. 4μΜ，1 X熒光定量PCR參比染料；
進一步地，所述含有iTaq DNA聚合酶、dNTP的PCR緩沖液為premix Ex TaqTM,購自Takra，貨號(DRR039)，所述熒光定量PCR參比染料為ROX Reference Dye購自大連寶生物公司，貨號(DR0X01 )，所述引物和探針均委托大連寶生物公司合成。所述premix Ex TaqTM為2X實時定量PCR緩沖液，包含有以下成分Taq DNA聚合酶，200U ;dNTP，5mM ;MgCL2，5mM ;KC1， 100 mM ； Tris_HCl，20 mM ；0. 2% Triton X-IOO0
4)陰性對照=DEPC水；
5)DEPC水；ImLx2管，自來水兩次蒸餾，經過Millipore純水儀純化，電阻率大于 18. OM Ω · CM。其中，檢測豬圓環病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No :2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :3所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE ；檢測豬偽狂犬病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :4所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No: 5所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :6所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團TAMARA，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE ；檢測豬細小病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :7所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No :8所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :9所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團J0E，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE。本發明還提供了上述豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒的使用方法
1.樣品采集、運送及制備
臨床發病的豬場，采集病死豬的腎、脾和淋巴結，用50mL離心管收集，置于4°C保鮮盒中，運送回實驗室。取IOOmg腎、脾和淋巴結，加入500μ L的0. OlM PBS液，用組織搗碎機搗碎，4000rpm離心20 min，取上清200 μ L。_70°C凍存備用。2. DNA 提取
有兩種方法試劑盒法和SDS裂解法試劑盒法
按照上海博彩生物科技有限公司的DNA提取試劑盒(Genomic DNA Purification kit, cat. no K201)提供的方法提取病毒DNA，具體方法如下 1)取400yL裂解液移入到1.5ml離心管中。2)加入200μ L病料上清液，在漩渦振蕩器上混勻(1 )，加入3μ L (UOyg)蛋白酶K ；混勻，55°C保溫10-60分鐘。3)高速室溫12000轉、分離心5分鐘，將上清轉移到1. 5ml無菌離心管中，加入 300 μ 1 SolutionB，混勻。4)將樣品全部轉移到3S柱，柱子放入2ml收集管中，蓋上離心管蓋子，12000轉， 室溫離心1分鐘。5)取下3S柱，棄去離心管中的廢液。將柱子放回同一根離心管中，加入500 μ L Wash Solution, 12000轉室溫離心1分鐘。6)重復步驟5);
7)取下3S柱，棄去離心管中的全部廢液。將柱子放回同一根離心管中，10000轉室溫離心2分鐘，以出去殘余的Wash Solution。
8)把柱子放進1.5ml無菌離心管中，棄去收集管，小心打開蓋子，加入80 μ L TE, 蓋上蓋子，室溫或37-55°C放置2分鐘，12000轉室溫離心1分鐘，棄去柱子，1. 5ml離心管中即為病毒DNA。SDS 裂解法
1)取病料200 μ L，加入等體積樣品裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH 7.4，20mMEDTA, 1% SDS)及10 μ L 200 μ g/mL的蛋白酶K，56°C水浴30分鐘， 2) 5000轉/分鐘，離心15分鐘。3)酚氯仿、氯仿各抽提一次，吸取水相。4)用2. 5倍樣品體積的異丙醇-70°C沉淀DNA 30分鐘，10000轉/分鐘離心10分鐘。5)70% 預冷乙醇洗滌 2 次，自然干燥后用 200 μ L TE (10 mM Tris-HCl, ImM EDTA, ρΗ8· 0)溶解，加入50 μ g/mL的RNase A，37°C作用1小時。3.實時定量RT-PCR反應
96孔PCR板，第一排12孔作為標準曲線和陰性對照孔，其余為樣品檢測孔。反應體系為20 μ L，見表1 表權利要求
1.一組檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的核苷酸引物和探針，其特征在于，所述核苷酸引物和探針為序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :9，其中序列SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO :2分別為檢測豬圓環病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO 3為檢測豬圓環病毒的熒光探針，序列SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5分別為檢測豬偽狂犬病毒的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO :6為檢測豬偽狂犬病毒的熒光探針，序列SEQ ID NO 7 和SEQ ID NO :8分別為檢測豬細小病的正義引物和反義引物，序列SEQ ID NO :9為檢測豬細小病的熒光探針。
2.根據權利要求1所述的檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的核苷酸引物和探針，其特征在于所述探針SEQ ID NO 3的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE。
3.根據權利要求1所述的檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的核苷酸引物和探針，其特征在于所述探針SEQ ID NO 6的5’端標記報告熒光基團TAMARA，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE。
4.根據權利要求1所述的檢測豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的核苷酸引物和探針，其特征在于所述探針SEQ ID NO 9的5，端標記報告熒光基團J0E，3，端標記淬滅熒光基團ECLIPSE。
5.一種豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒，其特征在于，由以下組分組成1)DNA提取試劑；2)DNA標準品含豬圓環病毒靶基因的T載體質粒，含豬偽狂犬病毒靶基因的T載體質粒和含豬細小病毒靶基因的T載體質粒；3)實時定量PCR反應液，其包括含有Ti^DNA聚合酶、dNTP的PCR緩沖液，檢測豬圓環病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，檢測豬偽狂犬病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，檢測豬細小病毒的正義引物、反義引物和熒光探針，熒光定量PCR參比染料；4)陰性對照=DEPC水；5)DEPT/K ；其中，檢測豬圓環病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No :2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :3所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE ；檢測豬偽狂犬病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :4所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No :5所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :6所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團TAMARA，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE ；檢測豬細小病毒的正義引物為序列表SEQ ID No :7所示的核苷酸序列，反義引物為序列表SEQ ID No :8所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID No :9所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團J0E，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE。
6.根據權利要求5所述的豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA提取試劑為DNA提取試劑盒。
7.根據權利要求5所述的豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述實時定量PCR反應液包括1 X含有Taq]Mk聚合酶、dNTP的PCR緩沖液，檢測豬圓環病毒的正義引物0. 2μΜ、反義引物0. 2μΜ和熒光探針0. 4μΜ，檢測豬偽狂犬病毒的正義引物0. 2μΜ、反義引物0. 2Μ和熒光探針0. 4μΜ，檢測豬細小病毒的正義引物0. 2μΜ、反義引物0. 2μΜ和熒光探針0.4μΜ，IX熒光定量PCR參比染料。
8.根據權利要求7所述的豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒，其特征在于，所述含有Ti^DNA聚合酶、dNTP的PCR緩沖液為premix Ex Ti^ ，所述熒光定量 PCR 參比染料為 ROX Reference Dye。
全文摘要
本發明公開了豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒。所述檢測用引物和探針為序列表SEQIDNO1至SEQIDNO9，本發明還提供了豬圓環病毒、豬偽狂犬病毒和豬細小病毒的檢測試劑盒。本發明所選引物和探針特異性非常強，一次能檢測三種病毒，節約成本、減少步驟，提高效率。本發明方法具有高特異性、高靈敏度，高效率、低成本的特點，適合較大量樣品的分析。
文檔編號C12Q1/68GK102277455SQ20111024054
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月22日 優先權日2011年8月22日
發明者徐麗華, 李軍星, 王一成, 袁秀芳, 郭勇 申請人:浙江省農業科學院