專利名稱：可用于艾滋病治療的rna干擾靶點的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學、細胞生物學和基因治療領域。更具體地，涉及可用于治療艾滋病的RNA干擾(RNAi)的32個靶點以及應用這些靶點的重組表達載體和應用這些靶點以不同方式獲得的用于制備治療艾滋病的藥物和方法。
背景技術：
由艾滋病毒(HIV)感染引起的獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS，艾滋病)是全世界面臨的最主要健康威脅之一。目前艾滋病已幾乎蔓延到世界各國，全球的艾滋病患者已超過 4000萬，已有近3000萬人被奪去生命(WHO，全球艾滋病流行報告，2004年)。近年來，我國艾滋病傳播呈快速增長趨勢，現感染者累計已達84萬人。目前，治療HIV感染的方法主要是采用高強度的抗逆轉錄病毒治療，如聯合使用針對病毒逆轉錄酶和蛋白酶的抑制劑。但由于HIV的高突變率及復雜的致病機理，該類型方法無法徹底根除體內病毒。因此，迫切需要發展新的治療手段以對付艾滋病的威脅。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA(dsRNA)介導的細胞內抑制基因表達的機制， 是1998年在線蟲中進行基因表達抑制研究中被首次提出(Fire A等，自然，1998年，391 卷806-811頁)。之后進一步發現RNAi廣泛存在于高等哺乳動物以及真菌、擬南芥、水螅、 渦蟲、錐蟲、斑馬魚等幾乎所有的真核生物中，是一種普遍存在和保守的抑制基因表達的機制，可起到調控基因表達、抗病毒入侵、抑制轉座子活動等作用(Dykxhoorn DM等，自然分子細胞生物學綜述，2003年，4卷457-467頁)。目前RNAi作用的機制已基本闡明內源或外源產生的dsRNA分子在細胞質中被屬RNA酶III的Dicer切割成小干擾RNA(siRNA)。典型的siRNA結構特征為5'端磷酸化，3'端呈對稱性突出2-3nt并帶羥基，長度為19_23nt 的 dsRNA。siRNA 分子與 RNA 誘導的沉默復合體(RNA-inducing silencing complex, RISC) 的蛋白復合體進行結合，RISC具有解螺旋酶和核酸內切酶活性。siRNA分子在復合體中被解聚，其中反義鏈可與匹配的靶mRNA按堿基配對原則結合，并引導與之結合的RISC將靶 mRNA在與反義鏈的結合區中部距5'端IOnt的位置處酶解，從而抑制靶基因的表達。目前獲得siRNA的方法主要有可表達小發夾RNA(shRNA)的質粒和重組病毒載體、化學合成方法、體外轉錄等。目前，RNAi在包括艾滋病在內的病毒性疾病以及腫瘤等疾病的防治研究已顯示出良好的應用前景。研究已顯示靶向HIV-ImRNA的siRNA可在體外培養的HIV-I易感細胞中抑制HIV-I的復制和病毒基因的表達(Martinez MA等，免疫學趨勢，2002年，23卷 559-561頁)。由于HIV的致病機理復雜，要達到有效的治療目的必須能夠高效抑制病毒復制和基因表達。然而，并非所有符合常規設計要求的RNAi靶點都能夠有效抑制靶基因的表達，不同靶點間的抑制效率各有差別。因此，選擇獲得合適的具有高抑制效率的RNAi靶點成為RNAi技術是否能夠成功應用于艾滋病治療的重要因素。選擇合適的RNAi靶點需要從結構特征、抑制效率、非人類基因同源性等方面進行綜合考慮。可使用的輔助方法包括目前已提出的siRNA輔助設計軟件、RNA分子結構分析、核酸序列分析比對以及實驗經驗等，并通過具體的抑制實驗予以驗證。以RNA干擾技術為基礎將有望開發出新型的更有效的艾滋病治療方法，該類型的治療方法需要提供可有效抑制HIV復制和表達的RNA干擾靶點。本發明滿足了這一要求， 提供了可用于該目的的RNA干擾靶點、重組表達載體等。
發明內容
本發明提供了可高效靶向HIV的RNA干擾靶點，可用于構建包含或導入了本發明涉及的RNA干擾靶點的編碼核酸序列的表達質粒、重組病毒載體和細胞，及可用于獲得包含有由本發明涉及的RNA干擾靶點獲得的艾滋病治療藥物。在一個具體方面，本發明具體涉及靶向HIVGAG、POL、VIF、或者VPU基因的RNA干擾靶點序列。本發明提供的RNA干擾靶點可高效靶向HIV，可高效抑制HIV的復制和病毒基因表達。本發明提供的RNA干擾靶點是通過以下方法獲得的選擇設計可靶向HIV的RNA干擾靶點序列，通過設計合適的引物構建shRNA，并克隆入pSUPER載體獲得相應的shRNA表達質粒，將該質粒分別與HIV感染性克隆質粒進行共轉染實驗，通過檢測HIV p24蛋白的表達水平及鑒定抑制特異性等分析篩選獲得高效的RNA干擾靶點。本發明提供特異靶向HIV的RNA干擾靶點序列，該序列選自(I)SEQ ID NO 1-32中任何一個所示的序列，或者(2)與(1)中序列具有至少70% (優選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高) 一致性的序列，或者(3)在嚴緊條件下或者高度嚴緊條件與(1)中序列能夠雜交的核苷酸序列，或者(4)與(1)中序列僅有1-3個(優選1-2個，更優選1個)核苷酸不同的序列；或
者(5)上述序列的片段或者互補序列。在一個具體方面，所述RNA干擾靶點序列可以靶向HIV GAG、P0L、VIF、或者VPU基因。本發明提供的RNA干擾靶點可以是DNA或RNA序列。在一個優選實施方案中，所述RNA干擾靶點選自siVIF037(SEQ ID NO 24), siPOLl102(SEQ ID NO :8)、siP0L1217(SEQ ID NO 10)、siP0L1327(SEQ ID NO :29)、禾口 siP0L2252(SEQ ID NO :22)。本發明還提供包含該RNA干擾靶點序列的核酸構建體或載體如表達載體。本發明還提供依據上述的RNA干擾靶點序列獲得的、能夠抑制HIV相應基因的表達和/或HIV的復制和/或感染的siRNA或miRNA或核酶或反義寡核苷酸。本發明提供了改造后的重組表達載體，其可用于表達本發明的靶向HIV的siRNA 和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸。在一個實施方案中，本發明重組表達載體具有以下特征包含了本發明提供的 RNA干擾靶點序列的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸的編碼核酸序列， 這些編碼核酸序列與表達控制序列可操作地連接，使得可在動物細胞(特別是哺乳動物細胞，如人細胞，如HIV受體細胞，優選CD4+細胞，如哺乳動物干細胞，優選造血干細胞)中表達所述靶向HIV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸。
本發明的重組表達載體可以是質粒載體或病毒載體，例如逆轉錄病毒載體，包括慢病毒載體。優選地，所述重組表達載體是逆轉錄病毒載體，更優選慢病毒載體。本發明提供了改造后的用于生產逆轉錄病毒載體(例如慢病毒載體)的包裝載體 (如包裝質粒)，其含有突變后的來源于HIV的用于表達包裝蛋白的基因序列，特別地改造后的基因序列可相互獨立地具有如下序列特征包裝載體的序列突變情況如下所示包裝載體--------GTAGACAGGATGAGGATTA--------突變為--------GTAGACAGGACGAAGATTA--------包裝載體--------GGATTTACCACACCAGACA--------突變為--------GGATTTACCACCCCCGACA--------包裝載體--------GCTGGACTGTCAATGACAT--------突變為--------GCTGGACTGTGAACGACAT--------包裝載體--------GCACTAACAGAAGTAGTAC--------突變為--------GCACTAACAGAAGTGGTGC--------包裝載體--------TAGTAGCCAGCTGTGATAA--------突變為--------TAGTAGCCAGCTGCGACAA--------本發明還涉及分離的細胞，其包含(1)本發明RNA干擾靶點序列，或者(2)含有本發明RNA干擾靶點序列的核酸構建體或載體如表達載體。本發明還涉及轉化或轉染或轉導了重組表達載體的分離的細胞，所述重組表達載體可表達本發明的靶向HIV的s iRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸。本發明還涉及轉化或轉染或轉導了或包含了本發明的包裝載體(如包裝質粒)的分離的細胞。本發明還涉及包含上述細胞的組織和生物，如動物。本發明還涉及一種改造的細胞(包括動物例如哺乳動物優選人的細胞，優選HIV 受體細胞和干細胞，如⑶4+細胞和⑶34+細胞)，其可表達或包含有本發明siRNA或miRNA 或核酶或反義寡核苷酸。本發明還涉及在基因組中或者基因組外攜帶本發明涉及的RNA干擾靶點的編碼核酸序列的細胞，包括原核細胞(如細菌細胞，如大腸桿菌細胞)和真核細胞(如真菌細胞，昆蟲細胞，植物細胞，動物細胞，優選哺乳動物如人的細胞，優選HIV受體細胞和干細胞，如⑶4+細胞和CD34+細胞)，其包含有本發明涉及的RNA干擾靶點的編碼核酸序列(這些編碼核酸序列可與表達控制序列可操作地連接，使得可在該細胞中表達所述的siRNA和 /或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸)。本發明還涉及導入了由本發明提供的RNA干擾靶點獲得的siRNA和/或miRNA和 /或核酶和/或反義寡核苷酸的細胞，包括原核細胞(如細菌細胞，如大腸桿菌細胞)和真核細胞(如真菌細胞，昆蟲細胞，植物細胞，動物細胞，優選哺乳動物如人的細胞，優選HIV 受體細胞和干細胞，如CD4+細胞和CD34+細胞)，其被導入了包含有由本發明涉及的RNA干擾靶點獲得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸。在一個優選的實施方案中，含有本發明獲得的RNA干擾靶點的編碼核酸序列的 shRNA表達元件導入HIV受體細胞后可使細胞獲得抑制HIV復制和病毒基因表達的能力。
本發明還涉及包含上述細胞的組織和生物，如動物。本發明還涉及包含本發明的細胞的藥物組合物。另一方面，本發明還涉及制備本發明改造細胞的方法，包括用本發明的重組表達載體轉化或轉染或轉導細胞(包括動物例如哺乳動物優選人的細胞，優選HIV受體細胞和干細胞，如CD4+細胞和CD34+細胞)。在一個實施方案中，所述方法包括用本發明重組逆轉錄病毒載體(例如慢病毒載體，如慢病毒Lenti-VIF037等)轉導哺乳動物優選人的HIV受體細胞和干細胞，如CD4+細胞和⑶34+細胞。在上述方法，所述細胞可以是分離的(或離體的)，例如從感染HIV的患者或者正常個體分離的，或者是在體的，或者是體外培養的細胞株。本發明還涉及DNA序列的組合，其包括或者由編碼正義RNA片段的第一 DNA序列和編碼反義RNA片段的第二 DNA序列組成，所述正義RNA片段包含本發明靶點序列所編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA能抑制HBV基因的表達和/或HBV的復制和/或感染。本發明還涉及小分子干擾核糖核酸(SiRNA)，其包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含本發明靶點序列編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，且該雙鏈RNA能抑制HIV相應基因的表達和/或HIV的復制和/或感染。本發明還涉及由本發明提供的RNA干擾靶點獲得的SiRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸在制備治療HIV感染或者HIV患者的藥物和/或藥物組合物中的用途。本發明還涉及由本發明提供的RNA干擾靶點獲得的SiRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸在制備抑制HIV復制或者HIV基因表達的藥物和/或藥物組合物中的用途。本發明還涉及本發明RNA干擾靶點序列、或核酸構建體或載體、或重組表達載體在制備治療HIV感染或者HIV患者的藥物中的用途。本發明還涉及本發明的經改造的細胞(包括動物例如哺乳動物優選人的細胞，優選HIV受體細胞和造血干細胞，如⑶4+細胞和⑶34+細胞)在制備治療HIV感染或者HIV 患者的藥物和/或藥物組合物中中的用途。本發明還涉及本發明的SiRNA靶序列在篩選抗HIV藥物中的應用。本發明還涉及治療HIV感染或者HIV患者的方法，包括向有需要的個體給予本發明的RNA干擾靶點序列、核酸構建體或載體、重組表達載體、siRNA或miRNA或核酶或反義寡核苷酸、或細胞。本發明還涉及本發明載體和細胞用于治療HIV感染或者HIV患者的用途。本發明還涉及治療HIV感染或者HIV患者的方法，包括向患者給予治療有效量的本發明所述RNA干擾靶點序列、核酸構建體或載體、siRNA或miRNA或核酶或反義寡核苷酸、 表達載體、細胞或siRNA。本發明還涉及抑制HIV復制或者HIV基因表達的方法，包括向有需要的個體給予有效量的本發明所述RNA干擾靶點序列、核酸構建體或載體、siRNA或miRNA或核酶或反義寡核苷酸、表達載體、細胞或siRNA。
本發明還涉及本發明所述RNA干擾靶點序列、核酸構建體或載體、SiRNA或miRNA 或核酶或反義寡核苷酸、表達載體、細胞或siRNA，用于治療HIV感染或者HIV患者，或者用于抑制HIV復制或者HIV基因表達。下面結合附圖對本發明進行更詳細的說明。從下文的詳細描述中，本發明的上述方面和本發明的其他方面將是明顯的。
圖1為pSUPER-siRNA系列表達質粒的構建流程示意圖。圖2顯示了分別靶向我們獲得的32個RNA干擾靶點的siRNA表達質粒在與HIV 感染性克隆質粒共轉染實驗中對HIV基因表達的抑制效果。結果顯示，這些RNA干擾靶點可抑制HIV。圖 3 顯示了構建獲得的表達載體 pDEST-VIF037、pDEST-P0L1102、pDEST-P0L1217、 PDEST-P0L1327、pDEST_P0L2252可有效表達所編碼的siRNA序列，且具有基因靶向特異性。pGL3-VIF與表達載體pDEST-VIF037共轉染時Iuciferase基因的表達受到了有效抑制，而pGL3-control與表達載體pDEST_VIF037共轉染時Iuciferase基因的表達不會受到抑制。PGL3-P0L 分別與表達載體 pDEST-P0L1102、pDEST_P0L1217、pDEST_P0L1327、 PDEST-P0L2252共轉染時Iuciferase基因的表達受到了抑制，而pGL3_control分別與表達載體 pDEST-P0L1102、pDEST_P0L1217、pDEST_P0L1327、pDEST_P0L2252 共轉染時 Iuciferase基因的表達不會受到抑制。圖4顯示了突變后的慢病毒包裝載體的表達不會受到表達靶向HIV的siRNA的慢病毒表達載體的影響。圖5顯示了經攜帶有靶向HIV的siRNA表達序列的重組慢病毒轉導后的HIV受體細胞MT-4細胞對HIV-1NM_3復制的抑制作用。圖6顯示了改造后的HIV受體細胞對HIV_1nm_3復制的抑制作用。圖7顯示了合成的靶向HIV的RNA干擾靶點的siRNA對HIV的抑制效果。 siR-VIF037轉染后可抑制HIV在細胞中的復制表達。圖8顯示了合成的并經2’-0me (2'-甲氧基)修飾和/或磷酸化修飾和/或固醇修飾的靶向HIV的RNA干擾靶點的siRNA對HIV的抑制效果。siRpo-VIF037、siRpo_P0L1217、 siRpoC-VIF037、siRpoC_P0L1217轉染后可抑制HIV在細胞中的復制表達。圖9顯示了靶向HIV的siRNA在H2K-PBL-SCID小鼠模型中具有抑制HIV復制的能力。VIF037雜合小鼠可顯示出抗HIV感染的能力，相比對照組可顯著降低血清中HIV蛋白的水平。
具體實施例方式除非特別說明，本發明的術語具有本領域通常使用的含義。本發明提供了可高效靶向HIV的RNA干擾靶點，包含如下序列或與其具有至少 70% (優選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列中的任何一個或幾個序列=SEQ ID NO :1-32。一致性(identity)可以按照本領域公知的方法計算。適合于確定序列一致性和序列相似性百分數的算法的一個優選例子是BLAST和BLAST 2. 0算法，它們分別描述在 Altschul 等(1977) Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 403-410。采用例如本文所述參數，BLAST和BLAST 2. 0可以用于確定本發明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分數。執行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術信息中心為公眾所獲得。在其它實施方案中，所述RNA干擾靶點的序列具有在嚴緊條件下或者高度嚴緊條件與本文提供的多核苷酸、或其片段、或其互補序列能夠雜交的多核苷酸序列。在分子生物學領域中雜交技術是熟知的。為了舉例說明的目的，所述雜交的條件是嚴緊條件，例如與濾膜結合的DNA在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中約45°C下雜交，之后在0. 2XSSC/0. 1%SDS 中于約50-65°C下作一或多次洗滌；高度嚴緊條件，例如與濾膜結合的核酸在6XSSC中約 45°C下雜交，之后在0. 1XSSC/0. 2% SDS中于約68°C下作一或多次洗滌；或本領域技術人員已知的其它嚴緊雜交條件(參見例如Ausubel，F. M.等編，1989，Current Protocols in Molecular Biology,第 1 卷，Green Publishing Associates, Inc.,禾口 John Wiley & Sons, Inc.，紐約，第 6. 3. 1-6. 3. 6 和 2. 10. 3 頁)。本發明還涉及在嚴緊條件下或者高度嚴緊條件與SEQ ID NO :1_32的任一序列、或其片段、或其互補序列能夠雜交的核苷酸序列。在本發明中，SiRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸可被設計成靶向目的基因或者調節序列，例如需要抑制其表達的基因或其調控序列，以便抑制或降低其表達。所針對的基因或其調控序列可以是需要抑制或降低其表達的任何基因或其調控序列， 例如來自病原體的、或者參與癌癥形成和發展的那些，特別是靶向HIV。本發明的siRNA、 miRNA、核酶和反義寡核苷酸可按照常規方法設計。“依據本發明RNA干擾靶點序列獲得的siRNA、miRNA、核酶和反義寡核苷酸”指的是通過設計表達或設計合成等方式得到的siRNA、miRNA、核酶和反義寡核苷酸，其所作用的靶序列(可以是DNA或RNA序列)為或包含有本發明涉及的RNA干擾靶點序列。siRNA的常規設計方法可參考文獻(如=Reyn0Ids A等，自然生物技術，2004年， 22卷3沈-330)或AmhioruQiagen等公司網站的公開資料或實施例1中的描述。miRNA的常規設計方法可參考文獻(Lo HL等，基因治療，2007年，14卷1503-1512頁)，選擇靶序列的方法與siRNA的設計方法相似，例如可將設計的含有靶序列的正義鏈及相應的反義鏈替換到pri-microRNA上，使構建的miRNA可阻止含有靶序列的mRNA的表達。核酶的常規設計方法可參考文獻(Haseloff J等，自然，1988年，334卷585-591頁)，例如可將與靶序列的前后序列互補的核苷酸序列分別置于核酶保守性核心的序列(如錘頭結構)前后，使構建的核酶能在靶序列處切割含有靶序列的核酸。反義寡核苷酸的常規設計方法可參考文獻 (Matveeva OV 等，核酸研究，2003 年，31 卷4989-4994 頁)。本發明使用的啟動子可以是任何適于在目的細胞中表達目的基因的啟動子。可以是組成型的，也可以是誘導型的。還可以是復合啟動子，如雙啟動子。“可操作地連接”是指所連接的分子的連接方式使得能夠實現預期的功能。例如， 表達控制序列與基因編碼序列的可操作的連接可實現表達控制序列對基因編碼序列的表達控制作用。“表達控制序列”是實現基因表達所需要的控制序列，是本領域熟知的。通常必須包括啟動子，常常也包括轉錄終止序列，也可以包含其他序列，如增強子序列。基因表達對于siRNA、miRNA、核酶和反義寡核苷酸等是指轉錄，也可以包括轉錄后加工；對于蛋白質編碼序列通常是指轉錄和翻譯，產生成熟的蛋白質。本發明提供可高效靶向HIV的RNA干擾靶點以及根據該靶點設計的siRNA、miRNA、 核酶和反義寡核苷酸。本發明的siRNA、miRNA、核酶和反義寡核苷酸包括對構成siRNA、 miRNA、核酶和反義寡核苷酸的磷酸骨架和/或核糖和/或堿基等構成部分進行化學修飾的修飾產物，修飾方法是本領域已知的，可以為硫代修飾和/或固醇修飾和/或PEG修飾和/ 或糖修飾和/或LNA修飾等，可參見文獻=Dykxhoorn DM等，生物醫學工程年度綜述，2006 年，8 卷:377-402 頁；Behlke MA 等，分子治療，2006 年，13 卷:644-670 頁等。在一個具體實施方案中，本發明涉及小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其包括正義 RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含本發明RNA干擾靶點編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，且該雙鏈RNA能抑制HIV相應基因的表達和/ 或HIV的復制和/或感染。在本發明中，術語“小分子核糖核酸”、“小分子干擾核糖核酸”或“siRNA”可互換使用，它們都指能夠抑制HIV靶基因表達、包括正義RNA片段區域和反義RNA片段區域的核糖核酸(RNA)。相關地，本發明還提供DNA序列的組合，其包括或者由編碼正義RNA片段的第一 DNA序列和編碼反義RNA片段的第二 DNA序列組成，所述正義RNA片段包含本發明靶序列所編碼的RNA序列，反義RNA片段和正義RNA片段能形成雙鏈RNA，且該雙鏈RNA能(通過 RNA干擾)抑制HIV基因的表達和/或HIV的復制和/或感染。在本發明的這方面，所述正義RNA片段和反義RNA片段可以存在于兩條不同的RNA 鏈上或者存在于一條RNA鏈上，例如在一個單鏈RNA分子包含正義RNA片段和反義RNA片段。例如，本發明的siRNA可以為發夾型單鏈RNA分子，其中正義RNA片段和反義RNA 片段之間的互補區域形成雙鏈RNA區域。正義RNA片段和反義RNA片段的長度優選為8_50個核苷酸，優選10_30 (更優選 15-27，19-23，如19、20或者21)個。但也可以更長或者更短。在正義RNA片段和反義RNA片段形成的雙鏈RNA的互補區域至少有10個(優選 15個，更優選18個，如19、20或者21個)堿基對。優選地，所述正義RNA片段與反義RNA 片段之間的互補區域含19、20、或21對互補堿基。在一個實施方案中，在正義RNA片段和反義RNA片段之間允許有少量的錯配，例如 1-5個，如1個或2個或3個或4個堿基錯配。在一個優選實施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段完全互補。在一個實施方案中，本發明的siRNA為具有10-30(優選，15-27，更優選19-23)對堿基的雙鏈RNA分子，所述雙鏈中至少有10個(優選15個，更優選18個)堿基互補配對。在一個優選的實施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段的GC含量為35%-75%， 例如 40-60%、45-55%、48-52%，如約 50%。在一個優選的實施方案中，正義RNA片段和反義RNA片段與已知人類基因和基因表達片段無顯著的一致性。顯著的一致性是指至少60%，例如70，80、90% —致性。
優選的是，所述正義RNA片段自5’端開始的19個核苷酸序列中的堿基為鳥嘌呤 (G)的核苷酸數量與堿基為胞嘧啶(C)的核苷酸數量之和占除去3’端的TT以外的19個核苷酸數量的比例為35% -75% (即G/C比例)，所述反義RNA片段及其一個核苷酸的突變體與已知人類基因和基因表達片段無顯著一致性。在本發明重組表達載體的一個實施方案中，本發明重組表達載體包含本發明涉及的RNA干擾靶點的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達控制序列可操作地連接，使得可在動物細胞(特別是哺乳動物細胞，如人細胞，如HIV受體細胞和干細胞)中表達所述靶向HIV的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸。類似地，在制備本發明改造細胞的方法中，可以通過用包含本發明涉及的RNA干擾靶點的編碼核酸序列的表達載體轉化或轉染或轉導細胞(包括動物例如哺乳動物優選人的細胞，優選HIV受體細胞和干細胞，如CD4+細胞和CD34+細胞)來獲得本發明改造細胞，只要最終得到的細胞包含本發明涉及的RNA干擾靶點的編碼核酸序列即可。也可以通過在所述細胞中導入包含有由本發明提供的RNA干擾靶點獲得的siRNA 和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸來獲得本發明改造細胞，只要得到的細胞包含有由本發明提供的RNA干擾靶點獲得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸即可。本發明的重組表達載體可以是質粒載體或病毒載體，例如逆轉錄病毒載體，包括慢病毒載體。優選地，所述重組表達載體是逆轉錄病毒載體，更優選慢病毒載體。本發明的改造的細胞優選是哺乳動物(優選人)的細胞，優選HIV受體細胞，如 ⑶4+細胞，優選干細胞，特別是造血干細胞，如⑶34+細胞。所述細胞在基因組中或基因組外攜帶本發明涉及的RNA干擾靶點的編碼核酸序列，這些編碼核酸序列與表達控制序列可操作地連接，使得可在該細胞中表達所述siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸。本發明的重組載體和改造細胞可以用于對HIV感染的治療。在具體的實施方案中，涉及以下內容1.靶向HIV的RNA干擾靶點序列siGAG0942 :AAATTGGATGACAGAAACC(SEQ ID NO. 1)siGAG1091 :CTGAAGCAATGAGCCAAGT(SEQ ID NO. 2)siGAG1273 :GATTGTACTGAGAGACAGGCT(SEQ ID NO. 3)siP0L0922 TGGAAAGGATCACCAGCAA(SEQ ID NO. 4)siP0L0927 :AGGATCACCAGCAATATTC(SEQ ID NO. 5)siP0L0937 :GCAATATTCCAGTGTAGCA(SEQ ID NO. 6)siP0L1026 :GTATGTAGGATCTGACTTA(SEQ ID NO. 7)siPOLl102 :GGATTTACCACACCAGACA(SEQ ID NO. 8)siP0L1131 :GAAAGAACCTCCATTCCTT(SEQ ID NO. 9)siP0L1217 :GCTGGACTGTCAATGACAT(SEQ ID NO. 10)siP0L1223 :CTGTCAATGACATACAGAA(SEQ ID NO. 11)siP0L1402 :CCGGTACATGGAGTGTATT(SEQ ID NO. 12)siP0L1411 :GGAGTGTATTATGACCCAT(SEQ ID NO. 13)0113]siP0L1468 :GGCCAATGGACATATCAAA(SEQ ID NO. 14)
0114]siP0L1470 CCAATGGACATATCAAATT(SEQ ID NO. 15)
0115]siP0L1544 CCCACACTAATGATGTGAA(SEQ ID NO. 16)
0116]siP0L1548 CACTAATGATGTGAAACAA(SEQ ID NO. 17)
0117]siP0L1550 :ACACTAATGATGTGAAACAATT(SEQ ID NO. 18)
0118]siP0L1734 :GAAGTTATGGTACCAGTTA(SEQ ID NO. 19)
0119]siP0L1762 CCCATAATAGGAGCAGAAA(SEQ ID NO. 20)
0120]siP0L2008 TCAGAGTTAGTCAGTCAAA(SEQ ID NO. 21)
0121]siP0L2252 TAGTAGCCAGCTGTGATAA(SEQ ID NO. 22)
0122]siVIF009 CAGATGGCAGGTGATGATT(SEQ ID NO. 23)
0123]siVIF037 :GTAGACAGGATGAGGATTA(SEQ ID NO. 24)
0124]siVIF038 TAGACAGGATGAGGATTAA(SEQ ID NO. 25)
0125]siGAG0432 TCAGGCCATATCACCTAGA(SEQ ID NO. 26)
0126]siGAG0738 :AATAGGATGGATGACACAT(SEQ ID NO. 27)
0127]siGAG1438 :GGAGCCGATAGACAAGGAA(SEQ ID NO. 28)
0128]siP0L1327 :GCACTAACAGAAGTAGTAC(SEQ ID NO. 29)
0129]siVIF090 TATTTCAAGGAAAGCTAAG(SEQ ID NO. 30)
0130]siVIF344 TTTCAGAATCTGCTATAAG(SEQ ID NO. 31)
0131]siVPU164 :GAGTGAAGGAGAAGTATCA(SEQ ID NO. 32)
0132]2.表達載體，優選慢病毒載體，可用于改造HIV受體細胞或造血干細胞.
0133]A. 一個可表達MGMT (PI40K)基因和單個或多個siRNAs、和/或miRNAs、和/或靶向HIV的核酶的重組慢病毒載體。
0134]B. 一個改造后的用于生產慢病毒載體的包裝載體(如包裝質粒)，其含有突變后的來源于HIV的用于表達包裝蛋白的基因序列。
0135]改造序列的例子為
0136]包裝載體--------GTAGACAGGATGAGGATTA--------
0137]突變為--------GTAGACAGGACGAAGATTA--------
0138]包裝載體--------GGATTTACCACACCAGACA--------
0139]突變為--------GGATTTACCACCCCCGACA--------
0140]包裝載體--------GCTGGACTGTCAATGACAT--------
0141]突變為--------GCTGGACTGTGAACGACAT--------
0142]包裝載體--------GCACTAACAGAAGTAGTAC--------
0143]突變為--------GCACTAACAGAAGTGGTGC--------
0144]包裝載體--------TAGTAGCCAGCTGTGATAA--------
0145]突變為--------TAGTAGCCAGCTGCGACAA--------
0146]該慢病毒在HIV受體細胞和/或造血干細胞上的應用.
0147]A.可用于穩定表達抗HIV的分子，如可在HIV受體細胞和/或造血干細胞中特異阻斷HIV復制的siRNA。B.可用于防止造血干細胞被BG/BCNU殺死。
12
3.改造的細胞，如HIV受體細胞和造血干細胞，其包含有本發明涉及的RNA干擾靶點的編碼核酸序列，可表達所述的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義寡核苷酸；或被導入了由本發明提供的RNA干擾靶點獲得的siRNA和/或miRNA和/或核酶和/或反義
寡核苷酸。RNA 干擾靶點的序列(SEQ ID NO: 1-32)實施例實施例1. siRNA表達質粒的設計與構建靶向HIV的RNA干擾靶點序列的設計以HIV參考序列為靶序列，選擇保守性好的區域進行步移設計siRNA序列；將初選獲得的siRNA序列在GenBank中進行BLAST檢索，選擇與非靶向序列具有3個或3個以上堿基相異的序列作為候選序列。siRNA表達質粒的構建siRNA的表達載體為pSUPER載體(oligoengine公司Cat. No VEC-PBS-0001/0002)，具體的構建過程可參見該公司的pSUPER載體實驗指南(www. oligoengine. com)，構建簡要流程可見示意圖1。分別合成帶有RNA干擾序列的引物，將互補弓I物經退火處理后連接到經Bgl 11和Hind 111雙酶切的pSUPER載體，經酶切和測序鑒定獲得正確的siRNA表達質粒。對照siRNA表達質粒的構建以特異靶向Iuciferase基因的siRNA序列 siRNA-luc (具體序列是5’-GTGCGCTGCTGGTGCCAAC-3’)以及不與HIV和人類基因相匹配的無關siRNA序列siRNA-Nk (具體序列是5’ -TGCATCGGAAAATAGATGT-3’)作為對照。通過上述方法合成引物構建至PSUPER載體上，經酶切和測序鑒定后獲得相應的siRNA表達質粒。實施例2.共轉染實驗篩選獲得可高效抑制HIV的RNA干擾靶點pNL4-3質粒(來自于巴斯德研究所；也可以使用其它的I型HIV感染性克隆質粒)是I型HIV的感染性克隆質粒，在轉染合適的哺乳細胞后(如細胞)具有可表達HIV病毒蛋白及病毒粒子的能力。pM是HIV病毒的殼蛋白，通過檢測細胞培養上清中的PM蛋白的含量可以反映病毒蛋白和病毒粒子的表達水平，也與病毒效價呈正相關。因此可將siRNA表達質粒分別和HIV感染性克隆質粒(pNL4-3質粒)在細胞中進行共轉染實驗，通過檢測共轉染后細胞的PM蛋白的表達水平來對不同siRNA抑制HIV-I復制的效率進行檢驗。293FT細胞(Invitrogen, Catalog# R700-07)培養于24孔細胞培養板中，匯合率約為70%。1 后每孔細胞轉染0. Iyg pNL4-3質粒和Iyg的siRNA表達質粒，轉染試劑為 Lipofectamine 2000 (Invitrogen Cat. No 11668-027)，轉染方法參見該試劑的操作指南。在共轉染4 后分別收集細胞培養上清，經梯度稀釋后用Murex HIV Antigen Mab (Cat. No. 8E77-02)檢測細胞培養上清中pM蛋白的活性。以共轉染了對照siRNA表達質粒和HIV 感染性克隆質粒的細胞的培養上清中的p24蛋白含量為對照，計算各siRNA對HIV 的抑制效率。通過比較，獲得了 32個具有高效抑制能力的RNA干擾靶點。附圖2顯示了分別以這32個RNA干擾靶點序列構建獲得的siRNA表達質粒在轉染入細胞后對HIV病毒基因表達的抑制效率。下面是我們獲得的可用于有效抑制HIV的RNA干擾靶點序列siGAG0942 :AAATTGGATGACAGAAACC(SEQ ID NO. 1)siGAG1091 CTGAAGCAATGAGCCAAGT(SEQ ID NO. 2)
達。
siGAG1273 :GATTGTACTGAGAGACAGGCT(SEQ ID NO. 3) siP0L0922 :TGGAAAGGATCACCAGCAA(SEQ ID NO. 4) siP0L0927 :AGGATCACCAGCAATATTC(SEQ ID NO. 5) siP0L0937 :GCAATATTCCAGTGTAGCA(SEQ ID NO. 6) siP0L1026 :GTATGTAGGATCTGACTTA(SEQ ID NO. 7) siP0L1102 :GGATTTACCACACCAGACA(SEQ ID NO. 8) siP0L1131 :GAAAGAACCTCCATTCCTT(SEQ ID NO. 9) siP0L1217 :GCTGGACTGTCAATGACAT(SEQ ID NO. 10) siP0L1223 :CTGTCAATGACATACAGAA(SEQ ID NO. 11) siP0L1402 :CCGGTACATGGAGTGTATT(SEQ ID NO. 12) siP0L1411 :GGAGTGTATTATGACCCAT(SEQ ID NO. 13) siP0L1468 :GGCCAATGGACATATCAAA(SEQ ID NO. 14) siP0L1470 :CCAATGGACATATCAAATT(SEQ ID NO. 15) siP0L1544 :CCCACACTAATGATGTGAA(SEQ ID NO. 16) siP0L1548 :CACTAATGATGTGAAACAA(SEQ ID NO. 17) siP0L1550 :ACACTAATGATGTGAAACAATT(SEQ ID NO. 18) siP0L1734 :GAAGTTATGGTACCAGTTA(SEQ ID NO. 19) siP0L1762 :CCCATAATAGGAGCAGAAA(SEQ ID NO. 20) siP0L2008 :TCAGAGTTAGTCAGTCAAA(SEQ ID NO. 21) siP0L2252 :TAGTAGCCAGCTGTGATAA(SEQ ID NO. 22) siVIF009 :CAGATGGCAGGTGATGATT(SEQ ID NO. 23) siVIF037 :GTAGACAGGATGAGGATTA(SEQ ID NO. 24) siVIF038 :TAGACAGGATGAGGATTAA(SEQ ID NO. 25) siGAG0432 :TCAGGCCATATCACCTAGA(SEQ ID NO. 26) siGAG0738 :AATAGGATGGATGACACAT(SEQ ID NO. 27) siGAG1438 :GGAGCCGATAGACAAGGAA(SEQ ID NO. 28) siP0L1327 :GCACTAACAGAAGTAGTAC(SEQ ID NO. 29) siVIF090 :TATTTCAAGGAAAGCTAAG(SEQ ID NO. 30) siVIF344 :TTTCAGAATCTGCTATAAG(SEQ ID NO. 31) siVPU164 :GAGTGAAGGAGAAGTATCA(SEQ ID NO. 32)
通過上面的實驗，我們證明了本發明的32個RNA干擾靶點可用于高效抑制HIV表
在以下的實驗中，我們從上述RNA干擾靶點選取了 siVIF037、siP0L1102、 siP0L1217、siP0L1327、siP0L2252 為例，進一步分別構建可表達靶向 siVIF037、 siPOLl 102、siP0L1217、siP0L1327、siP0L2252的siRNA的重組慢病毒，構建方法見實施例 3和實施例4。實施例3.表達siRNA的表達載體和慢病毒包裝載體的構建表達載體在該實施例中，我們使用的慢病毒系統的表達載體pDEST_MR(專利申請號:200510112917. 1 ；
發明者夏寧邵, 張軍, 張濤, 張雅麗, 程通, 苗季 申請人:養生堂有限公司, 廈門大學