專利名稱：一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法
技術領域：
本發明屬于生物技術制藥工業中基因工程生產蛋白藥物領域，尤其涉及一種利用基因工程重組法方法生產抗菌肽Gallinacin-6的生產方法。
背景技術：
目前養殖業中，由于抗生素泛濫使用，破壞動物腸道微生物菌群平衡，致使潛伏在體內的有害菌群大量繁殖會引起內源感染，并且還導致耐藥微生物產生，致使藥物劑量加大、治療周期延長、死亡率增高等問題，而且細菌的耐藥性還會向人類的轉移，給人類的健 康造成巨大影響。特別在肉雞養殖中，由于抗生素破壞腸道菌群平衡，產氣莢膜梭菌過量繁殖，導致壞死性腸炎病情越發嚴重。產氣莢膜梭菌還是引起人類的食物中毒的主要病原菌之一，目前禽肉加工過程中檢出率都較高，高達84%，造成巨大的食品安全問題。抗菌肽被認為是新一代抗生素的理想替代者。抗菌肽是生物體內經誘導產生的一類具有生物學活性的小分子多肽，存在于多種生物體中，是宿主免疫防御系統的一個重要組成部分，具有廣譜抗菌、無耐藥性及毒副作用等優點。隨著研究的不斷深入，越來越顯示出了其在醫學、獸醫學等相關領域的獨特應用價值。防御素(Defensin)是一類富含半胱氨酸的內源性陽離子多肽，具有較強的殺菌功能，能有效地殺滅細菌、真菌、螺旋體和囊膜病毒，是機體抵御外界病原微生物入侵的最初防御屏障[4-6]。抗菌肽Gallinacin-6,—種雞β-防御素,前體肽由67個氨基酸殘基組成，其cDNA全長為20 Ibp，其成熟肽由40個氨基酸構成，分子量
4.3KD。Gallinacin-6具有抗革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌的能力，能夠有效抑制空腸彎桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌等主要食物源性病原體，特別對產氣莢膜梭菌抑制效果尤為顯著(MIC = 8μ g/mL)，同時具有良好熱穩定性和耐酸堿能力，這些特點使得Gallinacin-6在動物疾病防治和飼料添加劑等方面顯露出很好的應用前景。然目前從肉雞提取抗菌肽Gallinacin-6工藝復雜，獲取量少，同時還收提取材料限制，無法滿足市場需求，提高抗菌肽Gallinacin-6產量是一個急需解決的問題。
發明內容
鑒于上述狀況，有必要提供一種工藝簡單、產量高的抗菌肽Gallinacin-6的生產方法。一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法,包括下列步驟，抗菌妝Gallinacin-6基因合成根據GENBANK，Gallinacin-6 的氨基酸序列(NCBI 序列號ΝΡ_001001193· I)，選用酵母偏愛密碼子設計Gallinacin-6基因，人工合成優化的Gallinacin-6抗菌肽基因；Gallinacin-6基因5’和3’端分別引入Eco RI.Not I內切酶位點，設計合成一對引物F1，R1，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定；抗菌肽Gallinacin-6重組酵母表達載體的構建PCR產物和pPIC9K均用Eco RI、Not I雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產物轉化E. coli DH5 α，重組表達質粒進行PCR、缺失酶切位點鑒定；PCR以及酶切鑒定為陽性的質粒測序，構建正確的重組表達質粒命名為PPIC9K-G6 ；pPIC9K-G6表達載體的轉化感受態Pichia pastorisGS115與SacI線性化pPIC9K_G6相混合，轉移至預冷的O. 2cm電轉杯中，電擊，立即加ImL預冷的lmol/L山梨醇，涂布于MD和麗平板，30°C孵化4 5d至平板出現乳白色的酵母轉化菌落，篩選都能生長良好的Mut+的菌落，然后依次轉移含G418的不同濃度YH)平板上篩選轉化子，目的基因高拷貝的重組菌株；采用PCR方法分析Pichia pastoris轉化子，以Fl, Rl為引物，以能擴增出149bp的克隆定為陽性轉化子；重組Pichia pastoris的誘導表達將篩選到的陽性酵母菌接種到5mL BMGY中，30°C、230r/min振蕩培養約22h至0D600達到3 6 ;室溫3000r/min離心2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養基，進行誘導表達；28°C、250r/min培養100h，期間每24h補加終濃度為1% (V/V)的甲醇；120h后5000r/min離心IOmin ;收集培養液上清，即獲得抗菌肽Gallinacin-6蛋白，分子量4. 3kD,
具有明顯抑菌活性。本發明抗菌肽Gallinacin-6是一種性能優良抗菌肽，具有抗革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、真菌的能力，對產氣莢膜梭菌抑制效果尤為顯著，同時具有良好熱穩定性和耐酸堿能力，這些特點使得Gallinacin-6在動物疾病防治和飼料添加劑等方面顯露出很好的應用前景。通過采用pPIC9K/Pichia pastoris GS115系統，構建高效表達抗菌肽Gallinacin-6基因工程菌株，大量獲得抗菌肽Gallinacin-6，可以減少抗生素使用，健康養殖、食品安全提供強有力的保障。
圖I是以重組質粒pPIC9K-G6為模板，用F1、R1引物進行PCR擴增目的基因片段，所得電泳圖譜；圖2是重組質粒pPIC9K-G6的酶切分析圖；圖3是重組菌株的PCR分析圖；圖4是表達蛋白SDS-PAGE電泳圖譜；圖5是抑菌試驗對照圖。
具體實施例方式本發明公開一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法，其詳細過程如下。抗菌肽基因序列的優化和獲得抗菌肽基因序列的優化外源基因的內在特性如密碼子偏好性是影響外源蛋白的有效表達重要因素。本發明根據畢赤酵母密碼子偏好性，將抗菌肽基因的酵母低頻密碼子優化成高頻密碼子，以提高目的蛋白的翻譯速度和表達量。抗菌肽基因優化情況如下GAATTCAAA AGAGACACAT TAGCCTGTAG ACAATCTCAT GGATCCTGTA GTTTTGTTGCATGCAGAGCT CCTTCTGTTG
ATATAGGAAC TTGTAGAGGT GGAAAATTGA AGTGCTGCAA ATGGGCTCCA TCAAGTCAATGAGCGGCCGC通過軟件分析，在基因序列的5’端和3’端分別加上EcoR I、Not I兩個酶切位點。抗菌肽基因序列的合成抗菌肽基因序列由人工完成。合成的抗菌肽基因全序列為GAATTCAAA AGAGACACAT TAGCCTGTAG ACAATCTCAT GGATCCTGTA GTTTTGTTGCATGCAGAGCT CCTTCTGTTGATATAGGAAC TTGTAGAGGT GGAAAATTGA AGTGCTGCAA ATGGGCTCCA TCAAGTCAAT·GAGCGGCCGC畢赤酵母表達載體的構建設計引物根據新合成的序列設計上下游引物F1、R1，及合成通用引物A0X1，新合成的引物序列如下F1 GAATTCAAA AGAGACACAT ；R1 GCGGCCGCTCATTGACTT ；5 ' AOXl GACTGGTTCCAATTGACAAGC ；3/ AOX I :GCAAATGGCATTCTGACATCC。G6基因的克隆首先以合成G6基因為模板，用F1、R1引物進行PCR擴增。PCR反應體系如下
ddH209. 05 μ L
~10XPCR buffer I. 5μ LMg2+0. 9 μ L
dNTP0. 6μ L
~ ΙO. 375 μ L
O. 375 μ L Taq DNA 聚合酶 O. 2 μ L PUC18-T-G62. 0μ L
總體積15 μ L反應條件PCR反應條件94 °C 5min ；94°C 45s，50°C 45s, 72 °C 45s, 25 個循環；72 °C 5min。PCR產物跑0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，然后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收。
PCR產物的純化與回收將經過初步鑒定后剩余的PCR產物全部跑O. 8%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進行純化回收，操作方法如下(I)用瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA片段與其它DNA盡可能分開，然后用干凈的手術刀割下含所要回收DNA的瓊脂塊，放入I. 5mL離心管中。判定DNA片段的位置時，要盡可能使用長波長紫外光，在紫外光下照射的時間應盡可能短。(2)每IOOmg瓊脂糖凝膠中或100 μ L的DNA溶液中加入400 μ LBinding Buffer,置于50-60°C水浴中lOmin，每2min混勻一次，以保證凝膠全部融化。(3)將融化的膠溶液轉移到套放于2mL收集管的UNIQ-IO柱中，室溫放置2min。8000rpm室溫離心lmin。適當降低離心轉速有助于提高DNA結合率。(4)取下UNIQ-IO柱，倒掉收集管中廢液，將UNIQ-IO柱放回收集管中，加入500 μ LWash Solution, IOOOOrpm 室溫離心 30s。(5)重復步驟⑷一次。(6)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中廢液，將UNIQ-10柱放回收集管中，IOOOOrpm室溫尚;L·、15s οG6基因與pPIC9K載體連接將G6基因與pPIC9K載體連接，連接體系如下
權利要求
1.一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法,包括下列步驟， 51:抗菌肽Gallinacin-6基因合成； 52:抗菌肽Gallinacin-6重組酵母表達載體的構建，且構建正確的重組表達質粒命名為 pPIC9K-G6 ； 53pPIC9K-G6表達載體的轉化； 54:重組Pichia pastoris的誘導表達。
2.根據權利要求I所述的一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法，其中所述SI過程中包括根據GENBANK，Gallinacin-6的氨基酸序列，其NCBI序列號為NP_001001193. I，選用酵母偏愛密碼子設計Gallinacin_6基因，人工合成優化的Gallinacin-6抗菌妝基因；Gallinacin_6基因5’和3’端分別引入Eco RI> Not I內切酶位點，設計合成一對引物Fl，R1，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定。
3.根據權利要求2所述的一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法，其中所述S2過程中包括PCR產物和pPIC9K均用Eco RI、Not I雙酶切，T4DNA連接酶連接，連接產物轉化E. coli DH5 α，重組表達質粒進行PCR、缺失酶切位點鑒定；PCR以及酶切鑒定為陽性的質粒測序，構建正確的重組表達質粒命名為PPIC9K-G6。
4.根據權利要求3所述的一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法，其中所述S3過程中包括感受態Pichia pastorisGSl 15與SacI線性化pPIC9K_G6相混合,轉移至預冷的O. 2cm電轉杯中，電擊，立即加ImL預冷的lmol/L山梨醇，涂布于MD和麗平板，30°C孵化4 5d至平板出現乳白色的酵母轉化菌落，篩選都能生長良好的Mut+的菌落，然后依次轉移含G418的不同濃度YPD平板上篩選轉化子，目的基因高拷貝的重組菌株；采用PCR方法分析Pichia pastoris轉化子，以Fl，Rl為引物，以能擴增出149bp的克隆定為陽性轉化子。
5.根據權利要求4所述的一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法，其中所述S4過程中包括將篩選到的陽性酵母菌接種到5mL BMGY中，30°C、230r/min振蕩培養約22h至0D600達到3 6 ;室溫3000r/min離心2min，收集菌體重懸于25mL BMMY培養基，進行誘導表達；28°C、250r/min培養100h，期間每24h補加終濃度為1% (V/V)的甲醇；120h后5000r/min離心IOmin ;收集培養液上清，即獲得抗菌肽Gallinacin-6蛋白，分子量4. 3kD,具有明顯抑菌活性。
全文摘要
本發明公開一種Gallinacin-6基因工程抗菌肽生產方法，包括下列步驟，S1抗菌肽Gallinacin-6基因合成；S2抗菌肽Gallinacin-6重組酵母表達載體的構建，且構建正確的重組表達質粒命名為pPIC9K-G6；S3pPIC9K-G6表達載體的轉化；S4重組Pichia pastoris的誘導表達。本抗菌肽Gallinacin-6的生產方法工藝簡單、產量高。
文檔編號C12N15/12GK102952804SQ20111025213
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月30日 優先權日2011年8月30日
發明者孫同毅, 張大偉, 王希輝 申請人:青島根源生物技術集團有限公司