專利名稱：胰島素與胰酶聯產新工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種胰島素(insulin, INS)與胰酶聯產新 工藝，具體而言就是豬胰提取INS后，將胰渣激活，用PEG(聚乙二 醇)沉淀制備胰酶的方法。
背景技術：
INS是由胰臟(3細胞分泌的一種多肽激素，應用于臨床已 有70多年的歷史，至今仍是治療糖尿病(diabetes mellitus, DM)的首 選藥物。INS作為DM的特效藥，用藥量大，用藥時間長(INS依賴 型DM患者一般都終生使用INS)。目前，世界上臨床使用的INS制 劑有人INS和結晶豬、牛INS。在我國以及其他發展中國家，由于受 經濟水平、新藥研發水平以及用藥水平的限制，臨床上使用的多為結 晶豬、牛INS制劑。隨著單組分INS的研制成功，豬胰島素的臨床 應用在發展中國家仍將具有廣闊的前景。胰酶系各國藥典收載的助消化藥，是從動物胰臟中提取的多種酶 的混合物，主要成分為胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，它可以用來治療 消化不良、食欲不振及肝、胰疾患引起的消化障礙。此外，由于胰酶 中含有多種活性物質，可以作為基礎原料從中提取多種生化藥品，如 胰激肽酶原，彈性蛋白酶，門冬酰胺酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，羧肽 酶等等。目前，(豬)INS和胰酶的生產均是由豬胰臟提取的。據了解， 目前國內外以胰臟為原料研制的生化藥物有大約40多種，其中激素 約6種，酶約13種，是傳統生化藥物非常重要的一個大家族。但是，
對于傳統的生化制藥工藝來講，由于其對原料的高度依賴性，再加上 現代基因工程技術的巨大沖擊，使得其必須走綜合利用的道路。在綜 合利用胰臟的工藝上，多年來國內外都進行了許多的研究工作，有的 已取得可喜的成效。國內有INS-胰激肽釋放酶聯產、胰酶-彈性蛋白 酶聯產、INS-胰高血糖素聯產等研究報道，但除彈性蛋白酶-激肽釋 放酶-(胰酶)聯產獲得了效益以外，其它工藝均未投入規模生產。INS和胰酶均是胰臟來源的兩種大眾藥物，它們的聯產必將給企業帶來巨大的商機和經濟效益。目前生產藥用胰酶的傳統工藝普遍采用的是有機溶劑沉淀的方法。例如，在《重慶醫科大學學報》1995 (4)， 305中報道的從豬胰 臟中提取胰酶的優化工藝，工藝流程中使用的沉淀劑是乙醇。《中國 生化藥物雜志》1994 (3)， 190報道的高活力胰酶生產工藝中使用的 沉淀劑是高濃度的冷乙醇。常州千紅生化制藥有限公司在《中國生化 藥物雜志》1993 (2)， 40上報道的胰酶工藝使用的沉淀劑是乙醇。 長沙生化制藥廠在《青海醫藥雜志》2000 (4)， 56上報道的胰酶制 備新工藝使用的沉淀劑是丙酮。綜上所述，這些工藝中都使用了大量 的有機溶劑，由于有機試劑的易燃性和對工人的慢性毒性，使生產中 存在重大的安全隱患；而且由于乙醇和丙酮可能使蛋白質發生變性， 生產過程中酶活力損失較多，尤其是脂肪酶和淀粉酶的活力損失嚴 重，致使三酶比例不合理，收率也不盡人意。中國專利(申請號 200410081389.3)提出了用酶沉淀保護劑PEG沉淀激活的豬胰漿來制 備胰酶胰酶的方法，但該方法為胰酶單產，工藝中尚需加入促沉淀劑，
而且酶的比活也不盡人意。發明內容針對上述情況，我們建立了完整的INS與胰酶聯產工藝， 工藝中選用氯化鋅為INS沉淀濃縮劑，PEG為胰酶沉淀劑。該方法具有安全性好、操作簡便、生產周期短、收率和酶活力高等特點，具 有推廣應用價值。本發明的INS與胰酶聯產新工藝是將豬胰用中性醇提取，上清液 用于提取INS，胰渣用于制備胰酶。上清液用鹽酸調pH為4.0，過濾 去沉淀后調pH為5.4-6.2，加入一定體積的2 mol/L氯化鋅溶液使其 終濃度為0.05-0.2 mol/L， 2-8 。C放置10-60 min，離心收集沉淀得INS 粗品。胰渣加入氯化鈣溶液至0.2-0.5 %， 25-35 。C水浴活化4-8h， 隨后加入PEG使其終濃度為10-30%，攪拌15-60 min后分漿，去掉 纖維組織，然后離心收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品。本發明的上述方法將INS與胰酶聯產，實驗結果顯示，聯產工藝 中INS與胰酶的回收率均能達到單產的水平。INS回收率為1300 mg INS粗品/kg胰臟左右，而胰酶重量回收率可達到15%左右，其三酶 效價分別可達5.3 Ph.Eur.U蛋白酶/mg胰酶粉，57.6 Ph.Eur.U淀粉酶 /mg胰酶粉，59.7 Ph.Eur.U脂肪酶/mg胰酶粉(Ph.Eur.U為歐洲藥典 效價單位)，達到歐洲藥典的標準，并接近胰臟中的天然比例。本發明的上述方法用氯化鋅沉淀濃縮INS，不僅沉淀效果好，而 且利于INS粗品的鋅結晶。此外，由于氯化鋅用量少，產品中鹽濃度 低，便于用離子交換層析的方法純化以制備單組分INS。本發明的上述方法直接用PEG沉淀氯化鈣激活的胰渣，沉淀后再
分漿， 一方面，由于單獨使用PEC無須加入促沉淀劑，避開了有機 溶劑的大量使用，增加了生產安全性，同時又減少了促沉淀劑的使用所帶來的操作步驟和成本；另一方面，通過激活、沉淀和分漿的有效和有序組合，既提高了胰酶的回收率，又提高了胰酶的質量。下面通過若干實例的具體實施方式
，再對本發明的上述內容作進 一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅局限于 下述的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范 圍。
具體實施方式
實例1: (1)冰凍豬胰50 g，加入85 %乙醇130 ml， 用氨水調pH為7. 0，攪拌4 h后離心，分別收集上清液和胰渣沉淀， 上清液用于提取INS，胰渣用于制備胰酶。(2) INS的提取上清液 用鹽酸調pH為4.0，沉淀析出，過濾去沉淀收集清液，調pH為6.0， 加入一定體積的2 mol/L氯化鋅溶液使其終濃度為0. lmol/L， 4 °C 放置30 min，離心收集沉淀即得INS粗品。回收率為1300 mg INS 粗品/kg胰臟。(3)胰酶的制備胰渣加入0.5Q/。氯化鈣溶液50ml， 攪勻，30 。C水浴活化6 h，隨后加入30 % PEG-6000溶液130 ml， 攪拌30 min后分漿，去掉纖維組織，然后離心收集沉淀，脫脂干燥 后得胰酶成品，重量回收率為15.3%，產品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀 粉酶的含量分別為5.30 Ph.Eur.U/mg， 39.72 Ph.Eur.U/mg， 57.60 Ph.Eur.U/mg。實例2: (1)冰凍豬胰50 g，加入85 %乙醇130 ml，用氨水調 pH為7.0，攪拌4h后離心，分別收集上清液和胰渣沉淀，上清液用
于提取INS，胰渣用于制備胰酶。(2)工NS的提取上清液用鹽酸調pH為4.0，沉淀析出，過濾去沉淀收集清液，調pH為6. 1，加入一 定體積的2 mol/L氯化鋅溶液使其終濃度為0. 15 mol/L， 2 。C放置 40min，離心收集沉淀即得INS粗品。回收率為1320 mg INS粗品/kg 胰臟。(3)胰酶的制備胰渣加入0.5。/。氯化鈣溶液60ml，攪勻，28 。C水浴活化7h，隨后加入30。/。PEG-6000溶液120ml，攪拌40min后 分漿，去掉纖維組織，然后離心收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品， 重量回收率為14.3%，產品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分別 為5.20Ph.Eur.U/mg， 38.76 Ph.Eur.U/mg， 55.60 Ph.Eur.U/mg。實例3: (1)冰凍豬胰50 g，加入85 。/。乙醇130ml，用氨水調pH 為7.0，攪拌4h后離心，分別收集上清液和胰渣沉淀，上清液用于 提取INS，胰渣用于制備胰酶。(2) INS的提取上清液用鹽酸調pH 為4.0，沉淀析出，過濾去沉淀收集清液，調pH為5.9，加入一定體 積的2 mol/L氯化鋅溶液使其終濃度為0. 08 mol/L， 5。C放置50 min， 離心收集沉淀即得INS粗品。回收率為1280 mg INS粗品/kg胰臟。 (3)胰酶的制備胰渣加入0.5%氯化鈣溶液45ml，攪勻，33 °〇水 浴活化5 h，隨后加入30 %PEG-6000溶液140 ml，攪拌50 min后分 漿，去掉纖維組織，然后離心收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品，重 量回收率為15.7%，產品中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的含量分別為 4.90 Ph.Eur.U/mg， 56.92 Ph.Eur.U/mg， 61.60 Ph.Eur.U/mg。胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活力測定參照第五版歐洲藥典。
權利要求
1.胰島素與胰酶聯產新工藝，豬胰提取胰島素后，將胰渣激活，用PEG(聚乙二醇)沉淀的方法制備胰酶，其特征在于將豬胰用中性醇提取，上清液用于提取胰島素，胰渣用于制備胰酶。上清液用鹽酸調pH為4.0，過濾去沉淀后調pH為5.4-6.2，加入一定體積的2 mol/L氯化鋅溶液使其終濃度為0.05-0.2mol/L，2-8℃放置10-60min，離心收集沉淀得胰島素粗品。胰渣加入氯化鈣溶液至0.2-0.5％，25-35℃水浴活化4-8 h，隨后加入PEG使其終濃度為10-30％，攪拌15-60min后分漿，去掉纖維組織，然后離心收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品。
2. 如權利要求1所述的胰島素與胰酶聯產新工藝，其特征在于使用的胰島素沉 淀濃縮劑是氯化鋅。
3. 如權利要求1所述的胰島素與胰酶聯產新工藝，其特征在于氯化鋅的終濃度 為0. 05-0. 2 mol/L，沉淀時的pH為5. 4-6. 2。
4. 如權利要求1所述的胰島素與胰酶聯產新工藝，其特征在于氯化鋅沉淀時的 溫度為2-8 °C，時間為10-60 min。
5. 如權利要求1所述的胰島素與胰酶聯產新工藝，其特征在于胰酶的制備方法 是直接用PEG沉淀氯化鈣激活的胰渣，沉淀后再分漿。
6. 如權利要求1所述的胰島素與胰酶聯產新工藝，其特征在于胰酶活化使用的 氯化鈣濃度為0. 2-0. 5 %，溫度為25-35 。C ，時間為4-8h。
全文摘要
本發明涉及胰島素與胰酶聯產新工藝，將豬胰用中性醇提取，上清液用于提取胰島素，胰渣用于制備胰酶。上清液用鹽酸調pH為4.0，過濾去沉淀后調pH為5.4-6.2，加入一定體積的2mol/L氯化鋅溶液使其終濃度為0.05-0.2mol/L，2-8℃放置10-60min，離心收集沉淀得胰島素粗品。胰渣加入氯化鈣溶液至0.2-0.5％，25-35℃水浴活化4-8h，隨后加入聚乙二醇使其終濃度為10-30％，攪拌15-60min后分漿，去掉纖維組織，然后離心收集沉淀，脫脂干燥后得胰酶成品。該方法具有安全性好、操作簡便、生產周期短、收率和酶活力高等特點，具有推廣應用價值。
文檔編號C12N9/94GK101125885SQ20071004860
公開日2008年2月20日 申請日期2007年3月13日 優先權日2007年3月13日
發明者蓉 余, 李曉紅, 楊繼虞 申請人:四川大學