棉花纖維特異表達啟動子tb17p1及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉一種棉花纖維特異表達啟動子TB17P1及 其應用。
【背景技術】
[0002] 我國是棉花生產和消費大國，棉花生產在我國國民經濟中占有重要的地位。利用 傳統的育種方法曾在棉花品種改良上取得了較大的成功，但近20年來，世界棉花品種的產 量已經達到平臺期。因此，利用現有的遺傳資源和傳統育種手段難以再大幅度提高棉花產 量。基因工程方法具有后代易于穩定，育種周期短等優點，可以打破物種間的遺傳障礙，實 現優良目的基因的定向轉移。利用基因工程改良棉花產量和纖維品質是解決這一難題的有 效途徑。但基因工程在作物改良中的作用發揮取決于三個方面的進展程度：目標基因的功 能、調控目標性狀的分子機理和控制目標基因在特定部位表達的特異啟動子。在棉花纖維 品質和產量的基因工程改良中，常常需要在纖維細胞中超量或抑制一些基因的表達，來達 到提高產量或改良品質的目的。同時棉花纖維產量的重要指標是棉花育性，而花粉育性是 棉花育性的重要指標，直接關系到棉花成鈴率、座果率和產量，因此需要有纖維花粉特異的 啟動子來控制目標基因的表達。在棉花纖維發育的分子機理研宄中，也需要纖維細胞特異 表達啟動子來上調或下調目標基因的表達，進而分析其在纖維細胞中的功能。最大限度地 減少目標基因對其他組織和器官的不良影響。但是，目前已報道的具有棉花纖維特異性的 啟動子非常有限。因此，棉花纖維特異啟動子的克隆，對棉花纖維發育相關基因功能研宄和 棉花纖維的基因工程改良，具有十分重要的意義。
[0003] 近年來，植物組織器官和發育特異性表達的研宄成為植物分子生物學的一個重要 研宄領域，特別是在植物基因工程的實用化階段中，為了使目的基因在特定的組織器官和 特定的發育階段優先表達，對組織特異性表達的研宄更是成為熱點。由于棉花纖維的發育 直接影響纖維的品質和產量。因此，研宄和篩選纖維特異表達的啟動子不僅有助于解析基 因表達調控的分子機制，并可為植物基因工程提供有用的調控元件，有著重要的理論意義 和應用價值。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是為改良棉花的纖維品質提供一種新選擇。
[0005] 本發明的技術方案是棉花纖維特異性表達的啟動子TB17P1，具有如SEQIDNO. 1 所示的核苷酸序列。
[0006] 本發明還提供了還有所述啟動子的表達載體。
[0007] 優選的，所述的表達載體是植物表達載體。
[0008] 本發明還提供了含有所述表達載體的宿主。
[0009] 具體的，所述的宿主為根癌農桿菌。
[0010] 本發明還提供了所述的TB17P1啟動子在制備轉基因植物中的應用。
[0011] 本發明還提供了上述表達載體在制備轉基因植物中的應用。
[0012] 具體的，所述的植物為棉花。
[0013] 本發明的又一個目的是提供一種利用TB17P1啟動子制備轉基因植物的方法，包 括以下步驟：
[0014] (1)將所述啟動子可操作地插入到表達載體中，構建植物表達載體；
[0015] (2)將獲得植物表達載體轉化宿主，獲得轉化體；
[0016] (3)將所述轉化體轉化植物，經培養獲得轉基因植物。
[0017] 進一步地，本發明提供了一種利用TB17P1啟動子制備轉基因棉花的方法，包括以 下步驟：
[0018] (1)將所述啟動子可操作地插入到表達載體中，構建植物表達載體；
[0019] (2)將植物表達載體轉化到棉花的愈傷再生組織中；
[0020] (3)培養所述棉花愈傷再生組織，經篩選和誘導獲得含棉花纖維特異性的啟動子 的棉花植株。
[0021] 本發明中，由于棉花纖維是胚珠外珠被表皮細胞經極性伸長而成，因此纖維細胞 是胚珠表皮細胞的一部分。為了篩選棉花纖維特異或優勢表達的啟動子，發明人檢測了棉 花基因組中12個a-微管蛋白基因和0-19個微管蛋白基因在棉花植株不同組織器官和 纖維發育不同時期的表達特性。表達分析的結果顯示一個微管蛋白基因（GhTUB17)在 棉花纖維中特異表達。為了明確GhTUB17基因的啟動子在棉花中的表達特性，克隆了該基 因5'-上游調控序列962bp，命名為TB17P1。通過克隆和序列分析、構建啟動子分析植物表 達和棉花遺傳轉化，以及利用轉基因棉花分析GUS活性。明確了TB17P1在棉花中的表達特 性：在纖維細胞中特異表達，是一個纖維特異表達啟動子。
[0022] 本發明的有益效果：
[0023] 本發明提供了微管蛋白基因GhTUB17的啟動子（TB17P1)及應用，該啟動子是一個 棉花纖維細胞特異表達啟動子；本發明利用基因工程技術成功地分離了棉花纖維特異表達 的GhTUB17基因的啟動子，所述TB17P1啟動子含962bp片段；本發明還驗證了所述TB17P1 啟動子序列在棉花中具有纖維表達特異性，能夠指導報告基因在棉花纖維中特異性表達， 為利用基因工程改良棉花纖維的品質和產量提供了纖維特異性表達的啟動子。本發明為進 一步研宄植物基因功能提供了新選擇，同時為改良棉花品種和纖維品質提供了有效途徑。
【附圖說明】
[0024] 圖1、A為GhTUB17基因在棉花不同器官和組織中以及纖維和胚珠不同發育時期的 表達特性；B為纖維和胚珠不同發育時期的表達特性；
[0025] 其中，誤差棒表示3次生物學重復的標準差。
[0026] F0-0DPA?F0-4DPA:開花后0天的胚珠纖維至開花后4天的胚珠纖維；F-6DPA? F-20DPA:開花后6天的纖維至開花后20天的纖維；0-6DPA?0-20DPA:開花后6天的胚珠 至開花后20天的胚珠。
[0027] 圖2顯示了TB17P1啟動子序列上具有的順式調控元件；
[0028] 其中，序列分析在PlantCare數據庫進行（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/)〇
[0029] 圖3是pBI121-TB17Pl::⑶S植物表達載體圖譜；
[0030] 其中，LB:T-DNA區段左邊界；RB:T-DNA區段右邊界；Kan%卡拉霉素抗性基因； ⑶S: 0 -葡萄糖酸苷酶基因；Nos-T:冠癭堿合成酶基因終止子。
[0031] 圖4是啟動子分析植物表達載體的酶切驗證；
[0032] 其中，M15:DNAMarker15(MBI) ;1和2:沒有接入TB17P1片段的空載質粒；3:表 示已經接入TB17P1片段的pBI121-TB17Pl::⑶S質粒。
[0033] 圖5是擴增驗證轉基因棉花中的⑶S基因；
[0034] 其中，M15:DNAMarker15(MBI) ;+:陽性對照（煮沸過的pBI121-TB17Pl::⑶S 農桿菌液）；W:水為模板的擴增產物；陰性對照（未轉基因棉花）；1-5:轉基因后再生的 Kan抗性苗，表示T-DNA區段已經整合到轉基因棉花基因組中。
[0035] 圖6是TB17P1啟動子在轉基因棉花幼苗中的表達情況；
[0036] 其中，A:整株轉基因棉花幼苗；B :下胚軸橫切；C:種子根和下胚軸縱切。本圖顯 示TB17P1啟動子在種子根、下胚軸和生長點不表達。
[0037] 圖7是TB17P1啟動子在轉基因棉花根中的表達情況；
[0038] 其中，WT:野生型棉花根；TB17Pl:pBI121-TB17Pl::⑶S載體轉基因棉花的根； 35S:pBI121載體轉基因棉花的根；ROOT:根中部；ROOTTIP:根尖。本圖顯示TB17P1啟動 子在棉花根中不表達。
[0039] 圖8是TB17P1啟動子在轉基因棉花莖中的表達情況；
[0040] 其中，WT:野生型棉花莖；TB17Pl:pBI121-TB17Pl::⑶S載體轉基因棉花的莖； 35S:pBI121載體轉基因棉花的莖；幼莖的左中右分別是幼莖的縱切、橫切和莖節的縱切； 老莖的左中右分別是老莖的縱切、橫切和莖節的縱切。本圖顯示TB17P1啟動子在棉花莖中 不表達