專利名稱：一種生產阿維菌素的基因工程方法及其專用菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種生產阿維菌素的基因工程方法及其專用菌株。
背景技術：
阿維菌素(avermectin，AVM)是一種由阿維鏈霉菌(Sti^ptomyces avermitilis) 發酵產生的大環內酯類抗生素，它有八個組分(Ala, Alb, A2a, A2b，Bla, Bib, B2a, B2b), 其中Bla組分的殺蟲活性最強，對線蟲、螨蟲和節肢動物具有良好的殺滅作用，殺蟲活性比一般化學農藥高出幾十倍。阿維菌素的作用機理與常規化學殺蟲劑不同，它的作用靶點是線蟲及節肢動物類寄生蟲的神經傳導介質Y-氨基丁酸(GABA)，對哺乳動物的毒性很小， 選擇性極高。該抗生素在植物中殘留時間很短，并且在土壤中很快被微生物分解為無毒物質。由于阿維菌素的這些突出的優點，其被公認為是一種最為安全有效的微生物來源的殺蟲劑，因此它在農業、林業、醫藥和獸用上具有非常廣闊的市場前景和應用價值。同時以阿維菌素為母體，還可以開發出一系列活性更高、選擇性更強、使用更加安全的衍生新品種， 已商品化的品種包括伊維菌素、埃瑪菌素、多拉菌素、埃珀利諾菌素和塞拉菌素等。此外，近年來又有研究者發現阿維菌素有抗腫瘤的功效，并且對腫瘤細胞的抗藥性也有一定的抑制作用。目前，阿維菌素已在國內實現了產業化，取得了巨大的經濟和社會效益。但我國阿維菌素的生產菌株還存在著發酵單位低，生產成本高等問題，如何提高阿維菌素的產量，降低生產成本，將為我國的農業生產發展起到促進作用。此外，不僅是阿維菌素，如何篩選和優化菌株、使產率和原料利用率實現最大化是我國微生物發酵工程面臨的普遍問題。目前用于提高鏈霉菌的抗生素產量的方法主要包括兩大類，一類是傳統的誘變育種方法，通過物理化學方法對菌株進行誘變，然后在誘變后代中篩選高產菌株；另一類是通過遺傳學的方法，對菌株進行直接的遺傳改變，提高抗生素的產量。通過物理化學方法對菌株進行誘變雖然已經取得了一定的成績，得到了大量的高產菌株，但它們的不足之處也很明顯，主要包括耗費大量人力、物力和時間，篩選工作比較復雜，存在一定盲目性，在引入有利變異的同時可能也會產生很多有害的變異，而有害的菌種變異往往會影響發酵過程的優化和放大； 這些傳統的菌種選育方式由于對引起功能變化的生物學基礎不了解，因此較難推廣應用于其他菌種。隨著細菌基因組研究的不斷深入，對細菌基因功能的認識不斷深刻，人們越來越傾向于用遺傳學手段對菌株進行改造。用遺傳學的方法可以將功能已知的基因進行改造， 增強了操作的針對性，而且使工作量大大降低，篩選時間也得到縮短。因此，通過基因工程手段改造阿維鏈霉菌以提高阿維菌素的產量，具有重要的意義。2001年Kitasato研究所完成了阿維鏈霉菌的基因組測序，對其中負責阿維菌素生物合成基因簇進行序列和功能分析，該基因簇全長821Λ，共有18個開放閱讀框架。基因簇內部有4個大的閱讀框架(AveAl-AveA2和AveA3-AveA4)，編碼多功能的聚酮體合成酶； aveC和aveE基因位于aveAl_aveA2和aveA3_aveA4基因之間，與聚酮體的修飾有關；在基因簇的右側鄰近aveA4的上游，是一套涉及齊墩果二糖的合成和轉移的8個基因(aveBI-aveBV III)；緊鄰aveAl的上游(左方)是編碼C5_0_甲基轉移酶的aveD，負責將甲基轉給阿維菌素B的C5的OH上而形成阿維菌素A。aveF緊鄰aveD的下游，二者轉錄方向一致，可能屬于同一轉錄單位。aveF編碼C5酮基還原酶，催化阿維菌素B的生成。aveR位于 aveF的下游(但轉錄方向相反)，屬于途徑特異性調控基因，是阿維菌素生物合成全基因簇的正調控基因。在抗生素產生過程中基因水平的分子調控起著至關重要的作用，通過遺傳學方法對鏈霉菌進行改造，提高抗生素產量。主要是通過改造抗生素產生的調節基因來進行的，有既與抗生素生物合成相關又與形態分化相關的調控基因，如bldA，relC, relA等；也有參與抗生素生物合成的全局性調控基因，如absA，absB, afsR等；還有參與抗生素生物合成的特異性調控基因，如ActII-0RF4，aveR, dnrl，redD，sanG，ccaR等。對抗生素生物合成起正調節作用的基因，可以通過提高它在菌株中的拷貝數或者改變啟動子提高其表達量來提高抗生素的產量，對起負調節作用的基因，則可以通過敲除該基因來提高抗生素的產量。但是， 通過提高拷貝數的方法得來的菌株往往穩定性較差，因為高拷貝的遺傳載體往往不穩定， 容易丟失，若考慮到后期的工業生產，可能更多嘗試通過同源重組整合到染色體上，更加穩定的維持高產相關基因在工程菌株的穩定存在。對能同時調控多種抗生素產量的調節基因進行改造比改造只調控單一抗生素產量的調節基因更加有效。在阿維鏈霉菌中，對aveC隨機突變后能夠得到多拉菌素“1”組分含量提高的突變株；對途徑特異性調控基因aveR，增加拷貝數并未提高阿維菌素產量，反而使得宿主菌株不再產生阿維菌素。在aveR基因的上游存在負調控基因aveRl和aveR2，這兩個基因中的任何一個基因或同時兩個基因失活都會使阿維菌素產量有大幅度的提高。(美國專利 US619759UtutZman-EngWall)。位于阿維菌素生物合成基因簇中的調控基因外，研究人員也致力于尋找其它調控基因，特別是全局性調控基因(global regulatorygene)，如afsR2 和orfX，從而更有效地提高阿維菌素的產量。
發明內容
本發明的目的在于提供一種與阿維鏈霉菌生產阿維菌素相關的蛋白。本發明提供的蛋白，是突變后的HrdB蛋白，具體是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與阿維鏈霉菌生產阿維菌素相關的由1)衍生的蛋白質。為了使1)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1.標簽的序列
權利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與阿維鏈霉菌生產阿維菌素相關的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述的蛋白的編碼基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)1)編碼序列如序列表中序列3所示；2)在嚴格條件下與1)的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；3)與1)的基因具有90%以上的同源性且編碼權利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權利要求2或3所述的基因的重組載體、表達盒或轉基因細胞系。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是將含有啟動子和權利要求2或3所述的基因的DNA片段插入質粒PSET152的多克隆位點中，得到的重組表達載體；所述含有啟動子和權利要求2或3所述的基因的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
6.含有權利要求2或3所述的基因的重組菌。
7.如權利要求6所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是將權利要求4或5所述的重組載體導入目的阿維鏈霉菌中得到的重組菌。
8.如權利要求7所述的重組菌，其特征在于所述目的阿維鏈霉菌為阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis)ZLX6003 CGMCC Ns .3229。
9.如權利要求6-8中任一所述的重組菌，其特征在于所述重組菌是阿維鏈霉菌 (Streptomyces avermitilis)ZLX6056 CGMCC Ns .3796。
10.權利要求1所述蛋白、權利要求2或3所述的基因或者權利要求6-9中任一所述的重組菌在生產阿維菌素中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種生產阿維菌素的基因工程方法及其專用菌株。本發明提供的蛋白，是突變后的HrdB蛋白，具體是如下1)或2)的蛋白質1)由序列表中序列4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與阿維鏈霉菌生產阿維菌素相關的由1)衍生的蛋白質。本發明提供的突變后的hrdB基因導入ZLX6003菌株中后得到的重組菌，在搖瓶培養240小時后的阿維菌素產量可達5732.05±91.26μg/ml。本發明工程菌ZLX6056，在180噸罐上的生長曲線表明該基因工程菌保持了原高產菌株的優良形狀，產量達到6382ug/ml。
文檔編號C12N1/21GK102241750SQ20101017318
公開日2011年11月16日 申請日期2010年5月14日 優先權日2010年5月14日
發明者劉梅, 卓英, 周賢龍, 張立新, 高弘 申請人:中國科學院微生物研究所