專利名稱：甲胎蛋白抗原表位肽及核酸及制法、重組載體及宿主細胞、雜交瘤細胞及單抗和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗原表位肽，編碼所述抗原表位肽的核苷酸序列以及所述核苷酸序列的制備方法，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，針對所述抗原表位肽的單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的單克隆抗體，以及包括上述單克隆抗體的蛋白檢測的試劑盒。更具體地，本發明涉及一種甲胎蛋白的抗原表位肽，編碼所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列以及所述核苷酸序列的制備方法，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，針對所述甲胎蛋白的抗原表位肽的單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的單克隆抗體，以及包括上述單克隆抗體的甲胎蛋白檢測的試劑盒。
背景技術：
甲胎蛋白(a-fetoprotein，AFP)是肝細胞癌的特征性蛋白，在體內可運載不飽和脂肪酸至肝癌細胞供其吸收利用，并可抑制T淋巴細胞增殖而保護腫瘤細胞逃脫免疫監視，對維持肝腫瘤細胞生長增殖起著重要作用。甲胎蛋白在分泌釋放之前可停留在肝癌細胞表面，成為肝癌細胞的重要標志物，這一特性是利用抗甲胎蛋白抗體進行腫瘤診斷和導向治療的物質基礎。但是目前用于檢測肝癌的甲胎蛋白的抗原表位肽，免疫原性弱、特異性差，因此亟需一種免疫原性強、特異性好的甲胎蛋白的抗原表位肽。
發明內容
本發明的一個目的是克服現有的甲胎蛋白的抗原表位肽免疫原性弱、特異性差的缺點，提供一種免疫原性強、特異性好的甲胎蛋白的抗原表位肽。本發明的第二個目的是提供編碼所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列及其制備方法。本發明的第三個目的是提供包括所述核苷酸序列的重組載體。本發明的第四個目的是提供包括所述重組載體的重組宿主細胞。本發明的第五個目的是提供針對所述抗原表位肽的單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的單克隆抗體。本發明的第六個目的是提供包括所述甲胎蛋白的抗原表位肽和/或單克隆抗體的甲胎蛋白檢測的試劑盒。本發明的發明人付出了大量地創造性勞動，篩選得到本發明具有SEQ IDNO =USEQ ID NO :3或SEQ ID NO :5所示的氨基酸序列的甲胎蛋白的抗原表位肽。并且本發明的發明人意外地發現，所得甲胎蛋白的抗原表位肽具有很好的特異性并且免疫原性強。本發明提供了一種甲胎蛋白的抗原表位肽，其中，所述抗原表位肽的氨基酸序列為
(I)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2) SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或者(3)對(1)或( 所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其甲胎蛋白抗原表位肽的功能不變的氨基酸序列。本發明還提供了編碼本發明所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列。本發明還提供了包括本發明所述核苷酸序列的重組載體。本發明還提供了包括本發明所述重組載體的重組宿主細胞。本發明還提供了針對所述抗原表位肽的單克隆抗體雜交瘤細胞及其產生的單克隆抗體。本發明還提供了包括所述甲胎蛋白的抗原表位肽和/或單克隆抗體的甲胎蛋白檢測的試劑盒。本發明提供的甲胎蛋白的抗原表位肽具有免疫原性強、特異性好的的優點。包括針對所述抗原表位肽的單克隆抗體的試劑盒，對甲胎蛋白的檢測限低，靈敏度高，最低檢測限達 0. 5ng/ml。本發明獲得的針對所述抗原表位肽的單克隆抗體雜交瘤細胞分類命名為雜交瘤細胞3D5，于2011年8月31日保藏至位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5193。本發明獲得的針對所述抗原表位肽的單克隆抗體雜交瘤細胞分類命名雜交瘤細胞7B11，于2011年8月 31日保藏至位于北京市朝陽區北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5194。
圖1為大腸桿菌BL21所表達的抗原表位肽SDS-PAGE電泳圖片，1為AFP-I抗原表位，2為AFP-2抗原表位肽；圖2為單克隆抗體SDS-PAGE電泳圖片，1為純化AFP-I單抗，2為純化AFP-2單抗；圖3為AFP標準品曲線。
具體實施例方式本發明提供了一種甲胎蛋白的抗原表位肽，其中，所述抗原表位肽的氨基酸序列為(I)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或者Q)SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或者對 (1)、或( 所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其甲胎蛋白抗原表位肽的功能不變的氨基酸序列。本領域人員公知，組成蛋白質的20種氨基酸殘基，按照側鏈極性可以分成四類1、非極性的氨基酸丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、 甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和脯氨酸(Pro)；2、極性不帶電荷的氨基酸甘氨酸(Gly)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸 (Cys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)和酪氨酸(Tyr)；3、帶正電荷的氨基酸精氨酸(Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)；
4、帶負電荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(參見“生物化學”(第二版)上冊，沈同、王鏡巖，第82-83頁，高等教育出版社，1990年12月)。蛋白質中如果發生同屬一個類別的氨基酸殘基取代，例如由Arg取代Lys或由Leu取代lie，所述殘基在蛋白質結構域中所起的作用(比如提供正電荷或形成疏水囊袋結構的作用)沒有改變，因此對蛋白質的立體結構并不會產生影響，因此仍然可以實現蛋白的功能。例如，本領域技術人員公知，Ala 禾口 Ser、Val 禾口 He、Asp 禾口 Glu、Ser 禾口 Thr、Ala 禾口 Gly、Ala 禾口 Thr、Ser 禾口 Asn、 Ala 禾口 Val、Ser 禾口 Gly、Tyr 禾口 Phe、Ala 禾口 Pro、Lys 禾口 Arg、Asp 禾口 Asn、Leu 禾口 lie、Leu 禾口 Val、Ala和Glu以及Asp和Gly，兩兩之間相互取代，不會影響蛋白的立體結構和功能。所述同屬一個類別的氨基酸殘基取代可以發生在甲胎蛋白的抗原表位肽上的任意一個氨基酸殘基位置上。相反，不同類別的氨基酸殘基發生取代，或者氨基酸的取代不符合上述列舉的取代規律，很可能會使蛋白的結構發生變化，功能出現差異。本發明提供的甲胎蛋白的抗原表位肽還可以進行修飾或突變，得到衍生的蛋白質。本發明所述“衍生的蛋白質”指與具有上述氨基酸序列的甲胎蛋白的抗原表位肽存在氨基酸序列上的差異，或者有不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白包括天然或誘導的遺傳變異體。所述誘導變異體可以通過各種技術得到，如輻射或誘變劑等產生的隨機突變，也可以通過如定點突變法或其他己知分子生物學的技術獲得。所述“衍生的蛋白質”還包括具有天然L型氨基酸的殘基的類似物(如D型氨基酸)，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、Y-氨基酸等)的類似物。修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的蛋白的化學衍生形式，如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的蛋白。這種修飾可以通過將蛋白暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的蛋白。優選情況下，所述甲胎蛋白的抗原表位肽的氨基酸序列為SEQ ID NO :1或SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列。本發明還提供了編碼本發明所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列。本領域公知，組成蛋白質的20種不同的氨基酸中，除Met (ATG)或Trp (TGG)分別為單一密碼子編碼外，其他18種氨基酸分別由2-6個密碼子編碼(Sambrook等，分子克隆， 冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989，見950頁附錄D)。即由于遺傳密碼子的簡并性，決定一個氨基酸的密碼子大多不止一個，三聯體密碼子中第三個核苷酸的置換，往往不會改變氨基酸的組成，因此編碼相同蛋白的基因的核苷酸序列可以不同。本領域人員根據公知的密碼子表，從本發明公開的氨基酸序列，以及由所述氨基酸序列得到的甲胎蛋白的抗原表位肽活性不變的氨基酸序列，完全可以推導出能夠編碼它們的基因的核苷酸序列，通過生物學方法(如PCR方法、突變方法)或化學合成方法得到所述核苷酸序列，因此該部分核苷酸序列都應該包括在本發明范圍內。相反，利用本文公開的DNA序列，也可以通過本領域公知的方法，例如Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港實驗室出版社，紐約，美國，第二版，1989)進行，通過修改本發明提供的核酸序列，得到與本發明所述甲胎蛋白的抗原表位肽活性一致的氨基酸序列。
優選情況下，本發明所述核苷酸序列為(1) SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；或者(2) SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列，或者(3)對SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代、缺失或增加而得到的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼的甲胎蛋白抗原表位肽的功能不變。所述核苷酸序列更優選為SEQ ID NO :2和SEQID NO :4所示的核苷酸序列。本發明提供的核苷酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法、或人工合成的方法獲得。例如，本領域技術人員根據本發明所提供的核苷酸序列和重組工程菌，可以很容易獲得模板和引物，利用PCR進行擴增獲得有關序列。序列較長時，可以進行兩次或多次PCR擴增， 然后將所得片段按正確次序拼接。一旦獲得了有關核苷酸序列，就可以用重組法大批量的獲得有關氨基酸序列。通常將所得核苷酸序列克隆入載體，再轉入基因工程菌中，然后通過常規的方法從增殖后的宿主細胞分離得到有關核苷酸序列。此外，還可用公知的人工化學合成的方法來合成有關核苷酸序列。例如，制備所述的編碼甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列的方法包括擴增SEQ ID NO 2 (AFP-I)所示的核苷酸序列所用引物正向引物5，-CATGCCATGGGACATTCAGAC-3，反向引物5，-CCGCTCGAGGCATTCAACTGC-3，擴增SEQ ID NO :4(AFP_2)所示的核苷酸序列所用引物正向引物5，-CATGCCATGGAACGTGGTCAATG-3，反向引物5，-CCGCTCGAGCTCCTGGTATCC-3，使用以上引物對并以RT-PCR體外擴增甲胎蛋白基因片段為模板，合成編碼甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列。本發明還提供了包括本發明所述核苷酸序列的重組載體。本領域公知，所述重組載體一般包括空載體和插入該空載體的目的基因，所述目的基因為本發明所述的甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列。在本發明中，所述“空載體”(或稱“載體”)可選用本領域己知的各種載體，如市售的各種質粒、粘粒、噬菌體及反轉錄病毒等，本發明優選所述空載體為Iac啟動子的載體， 更優選自由pET48a(+)、ρΚΚ223-3、ρΕΧ1/2/3和pUC18所組成的組中。所述空載體可以包括多種常用的檢測標記(例如熒光標記、抗生素標記等報告基因)和酶切位點。重組載體構建可采用空載體本身多克隆位點的各種核酸內切酶(如對于PUC18，可用Ml I.BamH I、 EcoR I 等，對于 pET28a,可用 Ndel、Nhel、EcoRI、BamH、HindIII 等，對于 pET28b 可用 EcoRI、 Nde I、BamH、HindIII等)進行酶切獲得線性質粒，與采用相同核酸內切酶切割的基因片段連接，獲得重組質粒。本發明還提供了包括本發明所述重組載體的重組宿主細胞。可以通過本領域常規的方法將所述重組載體轉化、轉導或者轉染到宿主細胞中， 如氯化鈣法化學轉化、高壓電擊轉化，優選電擊轉化；所述宿主細胞可以為原核細胞或真核細胞，優選為大腸桿菌、枯草桿菌、酵母(如畢赤酵母)或各種動植物細胞，更優選所述宿主細胞為本領域常用的基因工程菌，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或畢赤酵母。最優選所述宿主細胞為大腸桿菌DH5ci和/或大腸桿菌BL21。
可以使用本領域常用的方法從重組宿主細胞中分離和純化甲胎蛋白的抗原表位肽。例如，離心分離培養基和重組宿主細胞，高壓勻漿破碎細胞、離心過濾去除細胞碎片，親和層析純化甲胎蛋白的抗原表位肽。對于分離純化所得的甲胎蛋白的抗原表位肽的產物， 可以使用本領域常用的方法進行純度鑒定。例如，考馬斯亮藍法、凱氏定氮法、雙縮脲法、 Iowry法、紫外吸收法、親和層析、抗原抗體法、電泳分析(例如十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)、沉降分析、擴散分析、恒溶度法、蛋白質譜等。本發明還提供了一種單克隆抗體雜交瘤細胞，其中，所述單克隆抗體雜交瘤細胞的保藏號為CGMCC No. 5193或CGMCC No. 5194 ；—種單克隆抗體，其中，所述單克隆抗體是針對權利要求1或2所述的甲胎蛋白的抗原表位肽的單克隆抗體，其由保藏號為CGMCC No. 5193或CGMCC No. 5194的雜交瘤產生；以及一種包括本發明所述的甲胎蛋白的抗原表位肽和/或單克隆抗體的試劑盒。可以用本領域常用的方法制備甲胎蛋白的抗原表位肽的干粉，只要該方法能夠得到甲胎蛋白的抗原表位肽的干粉，并且不破壞甲胎蛋白的抗原表位肽的干粉的活性即可。例如使用真空減壓濃縮器得到濃縮的甲胎蛋白抗原表位肽的溶液，然后使用冷凍干燥機干燥濃縮的甲胎蛋白抗原表位肽的溶液；或者使用真空減壓干燥器等設備。本發明的試劑盒還可以包括本領域常用于測定甲胎蛋白的試劑盒的成分。對應于本發明的試劑盒中的甲胎蛋白的抗原表位肽和/或單克隆抗體可以是液體形式或固體干粉形式，本發明的試劑盒中的其他成分也可以是液體形式和/或固體干粉形式。例如， 當本發明的試劑盒為液體形式時，一般可以含有本發明的試劑盒優選含有(1)包被緩沖液 (PH9. 60. 05M 碳酸鹽緩沖液)=NaHCO3L 59 克、NaHC032. 93 克，加蒸餾水至 IOOOml ； (2)洗滌緩沖液(PH7. 4 磷酸緩沖液):0. 15M 即 KH2PO4O. 2 克、Na2HPO4 · 12H20 2. 9 克、NaCl 8. 0 克、KCl 0. 2克、Tween-200. 05% 0. 5ml，加蒸餾水至IOOOml ； (3)封閉液牛血清白蛋白 (BSA) 0. 2 1. 0克，0. 5 1. 0克酪蛋白，加洗滌緩沖液至IOOml。(4)稀釋液牛血清白蛋白 (BSA)O. 1克，加洗滌緩沖液至IOOml或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5 10%使用。(5)終止液(2M H2SO4)蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7ml。(6)底物緩沖液(PH5. 0磷酸檸檬酸)0. 2M Na2HPO44克/L) 25. 7ml,0. IM檸檬酸(19. 2 克/L)M. 3ml, 加蒸餾水50ml。(7)TMB(四甲基聯苯胺)使用液=TMB(10mg/5ml無水乙醇)0. 5ml、底物緩沖液(PH5. 5) lOml.O. 75% Η20232 μ 1 ； (8)抗原、抗體和酶標記抗體。(9)正常人血清和陽性對照血清。本發明液體形式的試劑盒組分可以通過冷凍干燥技術，結合減壓蒸餾技術、反滲透技術及超濾技術等，制備成試劑干粉。所述干粉可以在檢測待測標本前用選自去離子水、 蒸餾水和雙蒸水的溶劑復溶至所述試劑的原有體積。本發明的試劑盒可以包括記載有上述各種組分使用方法和用量的說明書。因此，所述溶液也可以由使用者在使用前按照試劑盒說明書的記載根據現有技術配制即可。適于使用本發明所述試劑盒的待測標本可以是動物體(包括人體)健康狀態下以及病理狀態下的血液自然凝固后析出的血清、加入肝素的血漿。適于使用本發明所述試劑盒的待測標本還可以是腫瘤組織活檢樣品。下面結合實施例進一步說明本發明，除非特別說明本發明所用到的試劑、培養基均為市售商品。
制備實施例1A) ■馬臓碰_側麻”白術導A-1) RT-PCR體外擴增cDNA基因組取液氮保存的人肝癌細胞h印G2(購自美國標準生物品收藏中心ATCC) IOOmg, 提取總 RNA ；RT-PCR 反應條件50°C 逆轉錄 30min，94°C 變性 2min，94°C 45s, 58 °C 30s, 72 °C 45s,循環33次，72°C延伸7min。PCR大量擴增目的基因cDNA片段，反應條件 940C 2min，94°C 30s，61°C 30s, 72°C 30s 循環 33 次，72°C延伸 7min。A-2)編碼抗原表位肽的核苷酸序列的獲得由上海生工生物技術有限公司合成以下序列AFP-I 正向引物5，-CATGCCATGGGACATTCAGAC-3，反向引物5，-CCGCTCGAGGCATTCAACTGC-3，AFP-2 正向引物5，-CATGCCATGGAACGTGGTCAATG-3，反向引物5，-CCGCTCGAGCTCCTGGTATCC-3，以步驟A-1) RT-PCR體外擴增cDNA基因組為模板，用AFP-1和AFP-2的兩對序列為引物，PCR合成目的DNA片段即編碼抗原表位肽的核苷酸序列。PCR的反應條件為 940C 2min，94°C 30s，61°C 30s, 72°C 30s 循環 33 次，72°C延伸 7min。A-3)編碼甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列的質粒的獲得和擴增取步驟2)得到的2段編碼甲胎蛋白的抗原表位肽DNA用Nco I、XhoI雙酶切37°C酶切Ih，同時以相同條件酶切去磷酸化的載體pET48a(+)，65°C水浴放置IOmin滅活內切酶后將兩者用紐英倫生物技術有限公司(NEB)的T4連接酶連接12h，轉化大腸桿菌DH5ci。涂布于含氨芐青霉素的 LB平板，獲取重組子測序并分析出編碼甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列(SEQ IDNos 2和4)。具體操作如下挑取在LB固體培養基上37°C培養16h的大腸桿菌DH5 α的單菌落，于液體LB培養基中在37°C、150rpm的搖床再培養16h。取Iml所得液體培養物轉接于IOOml新鮮液體 LB培養基中，在37°C搖床上以200-250rpm的轉速劇烈振蕩培養2.證。吸取1. 5ml培養好的菌液至1. 5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘后，在4°C、3000g下離心5分鐘。棄去上清， 加入100 μ 1在冰上預冷的0. lmol/L的CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，重懸細胞， 在冰放置20分鐘。然后在4°C、3000g下離心5分鐘，棄去上清，加入100 μ 1在冰上預冷的 0. lmol/L的CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，重懸細胞，得到感受態的宿主細胞大腸桿菌DH5 α。取200 μ 1上述感受態的大腸桿菌DH5 α置于1. 5ml離心管中，加入體積為10 μ 1 的連接產物溶液輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。然后在42°C水浴中熱擊120秒，迅速置于冰上冷卻5分鐘。向離心管中加入Iml LB液體培養基(不含氨芐青霉素)，混勻后37°C振蕩培養lh，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的氨芐青霉素抗生素抗性基因(Amp1O。 將上述菌液搖勻后取100 μ 1涂布于含氨芐青霉素的LB篩選平板上，正面向上放置半小時， 待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37°C培養20h。在篩選平板上出現了大腸桿菌的菌落，即pET48a(+)重組質粒已經轉化至大腸桿菌DH5 α感受態細胞中。挑取克隆在LB中370C 200rpm培養20h，提取重組質粒，取少部分用Nco I.XhoI雙酶切，經電泳初步鑒定后， 將重組質粒送至寶生物公司(TaKaRa)進行測序。分析出得到兩段分別編碼兩個甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列(SEQ ID Nos:2和4)。即得到兩種重組質粒，其攜帶的目的基因分別為編碼甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列SEQ ID Nos 2和4。Β)猶目in本·汰針麵mmt pi Μ mnnm針麵白她養提取步驟A)獲得的重組質粒，轉化大腸桿菌BL21(DE!3)感受態細胞。將上述菌株挑單菌落在LB培養基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和NaCl :10g/L溶劑為蒸餾水在 121°C 20min滅菌)中37°C下培養至生長對數生長期(IO6細胞/毫升)，然后以所得種子液(LB培養基和增殖的大腸桿菌)和新鮮LB培養基體積比為1 100的比例，接種于新鮮 LB培養基中，37°C培養至600nm波長下吸光度(OD) 1. 0，加入終濃度ImM的IPTG進行誘導， 4小時后收獲菌液。C)多肽產物的分離提純將步驟B)得到的發酵液在IOOOOrpm下離心lOmin，收集重組宿主細胞沉淀。棄去上清，將所得重組宿主細胞重懸于等體積的20mmol/L的pH為8. O的Bis-Tris緩沖液中。 用高壓勻漿機破碎重懸的細胞，在lOOOOrpm下離心15min，收集上清粗酶液，棄取細胞碎片沉淀。將上述所得粗酶液用孔徑為0. 22 μ m濾膜過濾后，所得濾液在美國通用電子公司 (GE公司)的組氨酸標記親和層析柱上進行親和層析。其中，上樣緩沖液為20mmol/L的pH 為8. O的Bis-Tris緩沖液。在流過兩個柱體積的上樣緩沖液后，使用洗脫緩沖液，其為含有lmol/L NaCl的20mmol/L的pH為6. O的Bis-Tris緩沖液。當8%的洗脫緩沖液洗柱后以25%的濃度洗脫得到目標多肽開始收集多肽，收集實時監測到的多肽單峰結束(其中在洗脫過程中所述的8%和25%是指所述洗脫緩沖液占洗脫緩沖液和上樣緩沖液之和的體積百分數)。向收集到的多肽溶液中加入40% (W/V)硫酸銨沉淀，然后在IOOOOrpm的轉速下離心10分鐘。收集多肽沉淀，并用0. lmol/L的PH為7. 5的Tris-HCl緩沖液復溶。所得溶液用孔徑為0. 22 μ m的濾膜過濾后，所得濾液再用葡聚糖凝膠G-25層析柱(S^hadex G-25) 脫鹽。所述脫鹽緩沖液是0. lmol/L的pH為7. 0的磷酸鉀緩沖液。在用脫鹽緩沖液平衡好的層析柱上上樣，其中樣品溶液(即上述用0. lmol/L的pH為6. 0的Bis-Tris緩沖液復溶的多肽溶液)的流速為5ml/min，然后用脫鹽緩沖液以15ml/min的流速洗脫2個柱體積。 收集洗脫下的液體共500毫升。所收集的液體在普通冰箱中-10°C下冷凍2小時，然后再_40°C深冷冰箱預凍8小時，在德國科瑞斯特(CHRIST)的ALPHA 1-4LSC型冷凍干燥機中，以真空度0. 04mbar、安全壓力0. IOOmbar且冷阱溫度_60°C的條件凍干10小時。然后等物料溫度與凍干機隔板溫度差為零，并且觀察在15秒內壓力指示不變時，結束凍干。凍干所得多肽的量為10克。凍干多肽在冷凍條件下密封保存。采用《蛋白質電泳試驗技術》(郭堯君，132-145頁，科學出版社，1999年)記載的 SDS-PAGE電泳的方法測定出本實施例的兩種多肽的分子量分別為10. 6KD、8. 2KD，并且根據《生物化學》(王鏡巖等，高等教育出版社，2002，見168頁)記載的多肽一級結構的測定方法(分肽段測定)，測得本實施例的多肽有93、71個氨基酸殘基(參見SEQ ID N0!和35所示的氨基酸序列)，與由SEQ ID NO 2和4所示的核苷酸序列編碼的多肽結果一致。綜上，本發明的發明人得到了一種新的兩種甲胎蛋白的抗原表位肽，其來源于甲胎蛋白，分子量分別為10. 6KD、8. 2KD，分別具有SEQ ID NO 1和3所示的氨基酸序列以及 SEQ ID NO :2和4所示的核苷酸序列。其中，本領域技術人員通過閱讀本實施例，可以知曉本發明的核苷酸序列例如SEQ ID NO :2和4，并可以通過化學合成方法得到所述核苷酸序列，因此可以在得到具有該核苷酸序列的核酸后，無需實施本實施例步驟A-1)和A-2)，而是在得到人工合成的SEQ ID NO :2和4所示的核苷酸序列后，直接實施本實施例步驟A-3) 以后的步驟重復本實施例；或者可以在得到步驟B)的表達甲胎蛋白的抗原表位肽的重組宿主細胞重復本實施例；或者直接按照SEQ ID NO :1和3合成甲胎蛋白的抗原表位肽的氨基酸序列。P)貼劍月_月純__胃碰免麻M勿選用6周齡、雌性BALB/c小鼠。首次免疫，50 μ g/只的抗原(兩種分別)加等體積完全福氏佐劑，采用皮下注射；4周后，第二次免疫，用25 μ g/只的抗原加等體積不完全福氏佐劑，皮下注射；2周后，第三次免疫，用25yg/只的抗原加等體積不完全福氏佐劑，皮下注射，7-10天后，ELISA檢測免疫鼠血清效價，效價達到1 IOW時即可準備做細胞融合。 如果效價比較低，則2周后繼續進行第四次免疫，免疫劑量及方式同第三次免疫一致，直至尾血效價檢測達到1 10W。細胞融合前3天，再用25 μ g抗原腹腔注射以加強免疫。E)雜交瘤細胞的制備取分離的步驟D)兩種免疫小鼠的脾臟細胞(IXlO8個細胞)分別與購自骨髓瘤細胞株Sp2/0(1X107個細胞)，在50%聚乙二醇1450(PEG1450)作用下進行常規融合。融合細胞用HAT培養基作選擇性培養，7d后改用HT培養基，14d后改用DMEM培養基培養(20% 小牛血清)。采用間接ELISA方法，用抗原(包被濃度為200ng/ml)對融合細胞進行陽性篩選，陽性細胞再進行亞克隆，經過3 5次亞克隆直到達到100%的陽性率。分別得到兩種分泌單克隆抗體雜交瘤細胞。分泌抗AFP單克隆抗體的雜交瘤細胞株得到建立。2個抗原表位肽分別免疫2只 BALB/c小鼠，各自進行細胞融合。每個次細胞融合用7塊96孔板，平均每孔有1 2株融合細胞生長，融合率為100%。經過對陽性雜交瘤細胞株進行4 5次有限稀釋克隆，2種抗原分別篩選到1株單克隆抗體雜交瘤細胞株(3D5和7B11)，這2株抗體除了能和相應的免疫抗原酶聯反應呈陽性、還可以與商購AFP抗原酶聯反應呈陽性。F)單克隆抗體的純化在預先1周注射石蠟油(0. 5ml/只)致敏的BALB/c小鼠腹腔接種已建株的雜交瘤細胞數為106，7 10天后采集腹水并離心得上清。腹水上清按1 10稀釋于pH為7. 4 的磷酸緩沖液(PBQ中，并以0. 5ml/min上樣于經PBS平衡的HisTrap Protein G親和層析柱中。用PBS洗脫雜蛋白，再用甘氨酸緩沖液(pH 2.9)洗脫，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定兩種單克隆抗體純度達99.9%，分子量分別為150KD。單一的獨立的帶無拖尾。得到純化抗體后，用外購AFP抗原(上海江萊生物科技有限公司)作為包被抗原，ELISA檢測抗體效價，兩種雜交細胞瘤的抗體的效價分別為1 IOffU 16W。G)單克隆抗體的標酶利用改良過碘酸鈉氧化法進行抗體標酶。具體地，首先稱取5mg辣根過氧化物酶(HRP酶)，溶于0. 5ml三蒸水中，加入新近配制的0. 06M過碘酸鈉溶液0. 5ml，混勻后置4°C， 30min ；加入乙二醇-NaCl溶液(稱取22gNaCl，加2. 3ml乙二醇，再加水至100ml，室溫， 30min ；加入步驟F)得到的純化的單克隆抗體，混勻，調pH值至9. 0，放4°C，過夜；加入硼氫化鈉，混勻，置4°C，2h ；將酶標抗體混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4°C，30min ；離心后，用PH7. 4的磷酸鹽緩沖液透析過夜。包被AFP抗原標準品，直接ELISA法測定酶標抗體效價。H) ELISA法標酶抗體配對及優化雙抗夾心ELISA檢測方案用0. 01mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液將單克隆抗體稀釋至5μ g/ml包被酶標板，4 °C過夜；用PBS/T20洗板3次，每次^iin ；用含5%小牛血清的 PBS/T20封閉，37 0C孵育lh，洗板；加入倍比稀釋的AFP溶液，37 °C孵育45min，洗板；加入 HRP-單克隆抗體，37°C，30min，洗板；加入TMB顯色液，37°C避光反應15min后，加人終止液；讀取波長為450nm時的OD值。酶標抗體酶標后，兩種酶標抗體的效價為1 1.6K、1 3K。通過ELISA法標酶抗體配對成功后的抗體對為AFP_1抗原表位肽的3D5單株所制備的單抗作為包被抗體、AFP-2抗原表位肽的7B11單株所制備的單抗作為檢測抗體，本發明篩選到的2株單克隆抗體雜交瘤細胞，其產生的單抗利用雙抗夾心ELISA檢測病人血樣，可以達到測量范圍為0. 5-500ng/mL·制備實施例2本發明的試劑盒包括以下成分(1)包被緩沖液(ρΗ9· 60. 05Μ 碳酸鹽緩沖液)=NaHCO3L 59 克、NaHC032. 93 克，加蒸餾水至IOOOml ；(2)洗滌緩沖液(PH7. 4 磷酸緩沖液)0. 15M 即 KH2PO4O. 2 克、Na2HPO4 · 12H20 2. 9 克、NaCl 8.0 克、KCl 0. 2 克、Tween-200. 05% 0. 5ml，加蒸溜水至 1000ml;(3)封閉液牛血清白蛋白(BSA)O. 2 1. 0克，0. 5 1. 0克酪蛋白，加洗滌緩沖液至100ml。(4)稀釋液牛血清白蛋白(BSA)O. 1克，加洗滌緩沖液至IOOml或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5 10%使用。(5)終止液(2M H2SO4)蒸餾水178. 3ml，逐滴加入濃硫酸(98% )21. 7ml。(6)底物緩沖液(PH5.0磷酸檸檬酸)0.2麗￡12朋(^28.4克/1)25.71111、0· IM檸檬酸(19. 2 克/L) 24. 3ml，加蒸餾水 50ml。(7)TMB(四甲基聯苯胺)使用液TMB(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml、底物緩沖液 (PH5. 5) lOml.O. 75% Η20232 μ 1 ；(8)抗原、抗體和酶標記抗體。(9)正常人血清和陽性對照血清。本實施例試劑盒使用步驟1)包被用0. 01mol/L pH9. 6碳酸鹽緩沖液將單克隆抗體(3D5單株純化的抗體) 稀釋至5μ g/ml包被酶標板，每孔包被100μ 1，4°C過夜；2)用PBS/T20洗板3次，每次!Min ；用含5%小牛血清的PBS/T20封閉150 μ 1， 37°C孵育Ih，用PBS/T20洗板1次；
3)加入倍比稀釋的AFP溶液(AFP標準品外購自上海江萊生物科技有限公司，濃度分別為 500ng/ml、200ng/ml、80ng/ml、32ng/ml、12ng/ml、5ng/ml、Ong/ml，檢測陽性樣本時直接加入樣品或者稀釋的樣品即可)ΙΟΟμ 1，37°C孵育45min，洗板3次，每次!Min ；4)加入已稀釋好的HRP-單克隆抗體(7B11單株純化的抗體經過HRP酶標)10(^1，37°〇，3011^11，用卩85/丁20 洗板 5 次，每次!Bmin ；5)加入TMB顯色液100μ1，37 避光反應15min后，加人終止液50μ1 ；讀取波長為450nm時的OD值。標準品曲線結果如圖3和下表1所示表權利要求
1.一種甲胎蛋白的抗原表位肽，其特征在于，所述抗原表位肽的氨基酸序列為(1)SEQID NO :1所示的氨基酸序列，或者(2)SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列，或者對(1)或( 所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其甲胎蛋白抗原表位肽的功能不變的氨基酸序列。
2.根據權利要求1所述的抗原表位肽，其中，所述抗原表位肽的氨基酸序列為SEQID NO :1或SEQ ID NO 3所示的氨基酸序列。
3.一種編碼甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列為編碼權利要求1或2所述的甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列。
4.根據權利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為(1)SEQID NO :2所示的核苷酸序列；或者(2)SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列，或者(3)對SEQID NO :2或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列進行一個或幾個核苷酸取代、 缺失或增加而得到的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼的甲胎蛋白抗原表位肽的功能不變。
5.根據權利要求3所述的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列為SEQIDNO :2或SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。
6.一種制備權利要求3-5中任意一項所述的編碼甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列的方法，所述方法包括擴增SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列所用引物正向引物 5，-CATGCCATGGGACATTCAGAC-3，反向引物 5，-CCGCTCGAGGCATTCAACTGC-3’擴增SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列所用引物正向引物 5，-CATGCCATGGAACGTGGTCAATG-3’反向引物 5，-CCGCTCGAGCTCCTGGTATCC-3，使用以上引物對并以RT-PCR體外擴增甲胎蛋白基因片段為模板，合成編碼甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列。
7.—種重組載體，其特征在于，所述重組載體由空載體和插入該空載體的目的基因組成，所述目的基因為權利要求3-5中任意一項所述的編碼甲胎蛋白抗原表位肽的核苷酸序列。
8.根據權利要求7所述的重組載體，其特征在于，所述空載體選自由pET18a(+)、 PKK223-3、pEXl/2/3 和 pUC18 所組成的組中。
9.一種重組宿主細胞，其特征在于，所述重組宿主細胞含有權利要求7-8任意一項所述的重組載體。
10.根據權利要求9所述的重組宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌 DH5a和/或大腸桿菌BL21。
11.一種單克隆抗體雜交瘤細胞，其特征在于，所述單克隆抗體雜交瘤細胞的保藏號為 CGMCC No. 5193 或 CGMCC No. 5194。
12.一種單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體是針對權利要求1或2所述的甲胎蛋白的抗原表位肽的單克隆抗體，其由保藏號為CGMCC No. 5193或CGMCC No. 5194的雜交瘤產生。
13. —種檢測甲胎蛋白的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括 權利要求1或2所述的甲胎蛋白的抗原表位肽和/或權利要求12所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發明公開了一種甲胎蛋白的抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列為(1)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列，或者(2)SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，或者對(1)或(2)所述的氨基酸序列進行一個或幾個氨基酸的缺失、添加和/或取代，但其甲胎蛋白抗原表位肽的功能不變的氨基酸序列；還公開了編碼所述甲胎蛋白的抗原表位肽的核苷酸序列及其制法，包括所述核苷酸序列的重組載體，包括所述重組載體的重組宿主細胞，單抗雜交瘤細胞及單抗，以及包括前述抗原表位肽和/或單抗的甲胎蛋白檢測的試劑盒。本發明的甲胎蛋白的抗原表位肽特異性好，由其得到的單抗制成甲胎蛋白檢測的試劑盒靈敏度高。
文檔編號C12N15/12GK102321167SQ20111025870
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月2日 優先權日2011年9月2日
發明者不公告發明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司