專利名稱：用于間充質干細胞培養的試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于間充質干細胞培養的試劑盒及其應用。
背景技術：
間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髄中發現，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調控和自我復制等特點而日益受到人們的關注。如間充質干細胞在體內或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復。間充質干細胞包括臍帶間充質干細胞和骨髄間充質干細胞。 臍帶間充質干細胞是ー類具有自我更新、増殖和多向分化潛能的干細胞，具有來源廣泛、易于采集、保存和運輸、無異體排斥、避免倫理爭議等諸多優點。流式細胞儀分析發現臍帶間充質干細胞高表達間質細胞標志(⑶44、⑶105)、整合素受體(⑶29、⑶49b、⑶49c、⑶51)、不表達造血系標志(⑶34、⑶45)白細胞抗原HLA-DR和內皮細胞標志⑶31。臍帶間充質干細胞在體內外可以分化為骨細胞、軟骨細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞以及神經元細胞等。目前人臍帶間充質干細胞在組織工程骨、人工血管以及基因治療等臨床應用研究中已逐漸深入，并已顯示出廣闊的應用前景。目前，對臍帶間充質干細胞的分離培養、擴增還沒有統ー的標準，存在純度低、原代培養時間長等缺點。各種類型的成纖維成體干細胞擴增一般在2 3天開始進入指數式生長，相差不大，而原代細胞由于組織來源不同，出現細胞克隆時間差異較大，所以，原代細胞傳代時間是分離得到目的細胞的關鍵。
發明內容
本發明提供了一種用于間充質干細胞培養的試劑盒及其應用。本發明的用于間充質干細胞培養的試劑盒包括細胞培養液A和細胞培養液B ;所述細胞培養液A為含80-120ng/ml細胞因子LIF (優選為100ng/ml)與80_120ng/ml細胞因子bFGF(優選為100ng/ml)的Knockout-DMEM培養基(液體)；所述細胞培養液B為胎
牛血清。所述所述細胞培養液A和所述細胞培養液B均為無菌的。所述細胞培養液A和所述細胞培養液B均獨立包裝。本發明的試劑盒還可包括細胞洗滌液和細胞消化液；所述細胞洗滌液為生理鹽水；所述細胞消化液為Collagenase II (膠原酶II)水溶液。所述細胞消化液具體可為0. 2g/100ml Collagenase II水溶液。所述生理鹽水由氯化鈉和水組成，氯化鈉的濃度具體可為0. 9g/100ml。所述細胞洗滌液、所述細胞培養液A、所述細胞培養液B和所述細胞消化液均為無菌的。
所述試劑盒中，所述細胞洗滌液、所述細胞培養液A、所述細胞培養液B和所述細胞消化液均獨立包裝。所述間充質干細胞具體可為臍帶間充質干細胞。所述臍帶間充質干細胞優選為離體的臍帶間充質干細胞。所述間充質干細胞具體可為獲自離體的哺乳動物組織的間充質干細胞，如獲自離體的人臍帶組織的臍帶間充質干細胞。所述試劑盒可用于間充質干細胞培養。應用所述試劑盒時，所述細胞培養液A和所述細胞培養液B優選按照5 I的體積比混合。所述間充質干細胞具體可為臍帶間充質干細胞。所述臍帶間充質干細胞優選為離體的臍帶間充質干細胞。所述間充質干細胞具體可為獲自離體的哺乳動物組織的間充質干細胞，如獲自離體的人臍帶組織的臍帶間充質干細胞。 本發明的試劑盒的應用原理為采用Collagenase II酶有效處理臍帶蛋白膠質，利用細胞因子(LIF、bFGF)組合對臍帶間充質干細胞的促進作用，從而確保了原代細胞分離數量和減少原代培養時間。本發明提供的試劑盒能從離體臍帶中分離臍帶間充質干細胞，并培養所述臍帶間充質干細胞，具有細胞擴增速度快、擴增效率高的優點，且多次傳代后依然保持有細胞全能性。本發明解決了臍帶間充質干細胞分離的純度、數量和原代培養時間問題，可以獲得大量臍帶間充質干細胞，為利用臍帶間充質干細胞進行進一步實驗研究提供了豐富的來源。
圖I為原代細胞培養7天后的細胞照片。圖2為傳代20次后細胞的表面抗原⑶29表達情況。圖3為傳代20次后細胞的表面抗原⑶34表達情況。圖4為傳代20次后細胞的多能性驗證結果；A和B為茜素紅染色；C和D為堿性磷酸酶染色；E和F為油紅-O脂滴染色；A和C為進行成骨誘導后的細胞；E為進行脂肪細胞的誘導后的細胞；B、D和F為誘導前的細胞。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。細胞因子LIF :購自SIGMA，產品目錄號為L5158。細胞因子bFGF:購自SIGMA，產品目錄號為R)291。Knockout-DMEM 培養基購自 GIBC0，產品目錄號為 10829018。胎牛血清購自GIBC0，產品目錄號為10091-155。Collagenase II (膠原酶 II):購自 SIGMA，產品目錄號為 C6885。用于檢測CD29的抗體購自eBioscience公司，產品目錄號為85-12-0291-81。用于檢測CD34的抗體購自eBioscience公司，產品目錄號為11_0011_81。
L-抗壞血酸西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，產品目錄號為47863。地塞米松西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，產品目錄號為46165。^ -甘油磷酸鈉Sigma，產品目錄號為G9422。甲基-異丁基黃嘌呤Sigma，產品目錄號為17018。胰島素北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，產品目錄號為DH174。吲哚美辛Sigma，產品目錄號為17378。
實施例I、用于分離臍帶間充質干細胞的試劑盒的制備一、組分的制備細胞洗滌液的制備將9g NaCl溶于去離子水并用去離子水定容至1000ml，高壓滅菌后置于4°C冰箱內備用。細胞培養液A的制備將細胞因子LIF與細胞因子bFGF溶于無菌Knockout-DMEM培養基(液體)，細胞因子LIF的濃度為100ng/ml，細胞因子bFGF的濃度為100ng/ml，置于4 °C冰箱內備用。細胞培養液B為無菌胎牛血清，置于-20°C冰箱內備用。細胞消化液將Collagenase II溶于去離子水使Collagenase II的濃度為0.2%(g/100ml),置于4°C冰箱內備用。ニ、組分的分裝以及試劑盒的制備用于分離臍帶間充質干細胞的試劑盒(I次/盒)由獨立包裝的如下組分組成1瓶細胞洗滌液(IOOml/瓶)、I瓶細胞培養液A (80ml/瓶)，I瓶細胞培養液B (20ml/瓶)和I瓶細胞消化液(IOOml/瓶)。實施例2、臍帶間充質干細胞的分離與快速擴增培養用實施例I制備的試劑盒進行臍帶間充質干細胞的分離與快速擴增培養。細胞培養液的制備將細胞培養液A和細胞培養液B按照5 I的體積比混合。I、無菌收集離體臍帶(來源為人)，浸沒于含雙抗的細胞培養液(含雙抗的細胞培養液由細胞培養液、青霉素和鏈霉素組成，青霉素的濃度為lg/100ml、鏈霉素的濃度為lg/100ml)中，玻璃容器密封運輸至實驗室。2、在生物安全柜中剪取約IOcm長的臍帶，用細胞洗滌液清洗血污；用解剖刀去除外被羊膜、2條臍靜脈和I條臍動脈，得到華爾通氏膠(動靜脈之間的胚胎粘液樣結締組織)。3、將華爾通氏膠剪碎成肉糜狀，轉移到離心管中，加入20ml細胞消化液，混勻37°C過夜消化(約6小時);吸取液相、離心(2500rpm，5分鐘)，收集沉淀(原代細胞)。4、用細胞培養液重懸原代細胞，接種于0. 2%明膠包被的培養瓶中(每IO6個細胞接種到I個25m2培養瓶)，置于37°C、5% CO2培養箱中培養；持續觀察細胞貼壁生長情況，細胞多數貼壁后(約24小時)更換為新的細胞培養液，除去未貼壁細胞和雜質，以后每3天半量更換細胞培養液(半量即原細胞培養液體積的一半；也可每4天半量更換細胞培養液)，原代細胞培養7天后細胞密度達到90%，細胞照片見圖I。5、原代細胞培養至細胞密度達到90% (培養7天)后進行第一次傳代，之后均在細胞密度達到90% (培養2-3天)時進行傳代；傳代20次后(及第一次傳代后，又連續傳代了 19次)，取細胞樣本進行流式細胞儀檢測，以驗證細胞樣本的純度和全能性相關參數。
通過流式細胞儀分別檢測第20次傳代后的細胞樣本的表面抗原CD29的圖譜，細胞樣本的陽性率為98.2%，見圖2。結果表明采用本發明提供的細胞培養液將原代細胞傳代20次后，細胞的純度和全能性還是非常高的。通過流式細胞儀分別檢測第20次傳代后的細胞樣本的表面抗原CD34的圖譜，見圖3。實施例3、臍帶間充質干細胞多能性驗證為證實臍帶間充質干細胞的多向分化潛能，本實施例對實施例2中第15次傳代后的細胞樣本向成骨細胞和脂肪細胞分化的潛能進行鑒定。
一、向成骨細胞分化將細胞樣本以3000cells/cm2接種，然后加入成骨誘導培養基(向Knockout-DMEM培養基中添加地塞米松至ΙΟΟηΜ、抗壞血酸至50 μ Μ、β -甘油磷酸鈉至IOmM)，于37°C、5%CO2培養箱中培養，大約5 7天后可觀察到如下現象細胞匯合成單層，細胞突起互相連接，并可重疊生長而不發生接觸抑制；重疊生長的細胞逐漸形成結節狀，隨后膠原堆積及鈣鹽沉積，細胞間出現致密的圓形不透光團塊物質。表明細胞樣本可以向成骨細胞分化。二、向脂肪細胞分化將細胞樣本以30000cells/cm2接種，然后加入成脂肪誘導培養基(向Knockout-DMEM培養基中添加地塞米松至I μ M、甲基-異丁基黃嘌呤至O. 5mM、胰島素至10yg/ml、吲哚美辛至100 μ M)，持續培養，可觀察到如下現象第2天細胞匯合成單層；2周后部分細胞形態變圓，胞漿內出現亮圓形脂滴；隨著時間延長，圓形細胞逐漸增多。表明細胞樣本可以向脂肪細胞分化。三、堿性磷酸酶(ALP)染色應用堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號DOOI)對步驟一中培養6天的細胞樣本和進行步驟一前的細胞樣本分別進行堿性磷酸酶染色，具體步驟如下用PBS緩沖液洗滌細胞三次，然后加入70%冰冷乙醇4°C固定30min，用去離子水洗3次(每次2分鐘)以除去殘留的乙醇；然后吸出去離子水，加入2ml α-磷酸萘酯底物，37°C作用15min后用去離子水洗2次(每次2分鐘)；用Iml蘇木素復染15min,用去離子水洗3次；晾干后，顯微鏡觀察。步驟一中培養6天的細胞樣本見圖4C。進行步驟一前的細胞樣本見圖4D。可見進行步驟一的培養后，細胞已經開始分化。四、茜素紅染色將步驟一中培養6天的細胞樣本和進行步驟一前的細胞樣本分別進行茜素紅染色，具體步驟如下用PBS緩沖液洗滌細胞三次，然后加入70%冰冷乙醇4°C固定30min，用去離子水洗3次(每次2分鐘)以除去殘留的乙醇；加入Iml 40mM茜素紅溶液(上海笛柏化學品技術有限公司，A202068 ；pH4. 2)晃動鋪勻，室溫下染色15min ;吸去未結合的茜素紅，去離子水洗5次(每次3分鐘)；晾干后，顯微鏡觀察。步驟一中培養6天的細胞樣本見圖4A。進行步驟一前的細胞樣本見圖4B。可見進行步驟一的培養后，細胞分化為成骨細胞。五、油紅-O脂滴染色將步驟二中培養15天的細胞樣本和進行步驟二前的細胞樣本分別進行油紅-O脂滴染色，具體步驟如下細胞用PBS緩沖液洗三次，用10%中性福爾馬林于4°C固定lh，用去離子水洗3次除去殘留的中性福爾馬林；加入Iml 3mg/mL的油紅-O溶液(研域化學試劑有限公司，00625)，吸去未結合的油紅-0，分別用60%異丙醇、30%異丙醇、去離子水洗3次，以減少非特異性染色；晾干后，顯微鏡觀察。步驟ニ中培養15天的細胞樣本見圖4E。進行步驟一前的細胞樣本見圖4F。可見進行步驟ニ的培養后，細胞分化為脂肪細胞。 以上結果表明，采用本發明提供的細胞培養液將臍帶間充質干細胞傳代15次后，細胞仍然維持很高的純度和良好的全能性。采用本發明提供的細胞培養液培養骨髓間充質干細胞，也取得了同樣好的效果。
權利要求
1.用于間充質干細胞培養的試劑盒，包括細胞培養液A和細胞培養液B; 所述細胞培養液A為含80-120ng/ml細胞因子LIF與80_120ng/ml細胞因子bFGF的Knockout-DMEM 培養基； 所述細胞培養液B為胎牛血清。
2.如權利要求I所述的試劑盒，其特征在于所述培養液A中，含100ng/ml細胞因子LIF 與 100ng/ml 細胞因子 bFGF。
3.如權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括細胞洗滌液和細胞消化液；所述細胞洗滌液為生理鹽水；所述細胞消化液為Collagenase II水溶液。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述細胞消化液為.O. 2g/100mlCollagenase II水溶液；所述生理鹽水由氯化鈉和水組成，氯化鈉的濃度為.O.9g/100ml。
5.如權利要求3或4所述的試劑盒，其特征在于所述細胞洗滌液、所述細胞培養液A、所述細胞培養液B和所述細胞消化液均為無菌的；所述試劑盒中，所述細胞洗滌液、所述細胞培養液A、所述細胞培養液B和所述細胞消化液均獨立包裝。
6.如權利要求I或2所述的試劑盒，其特征在于所述細胞培養液A和所述細胞培養液B均為無菌的；所述試劑盒中，所述細胞培養液A和所述細胞培養液B均獨立包裝。
7.如權利要求I至6中任一所述的試劑盒，其特征在于所述間充質干細胞為臍帶間充質干細胞；所述臍帶間充質干細胞優選為離體的臍帶間充質干細胞。
8.權利要求I至7中任一所述試劑盒在間充質干細胞培養中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于所述細胞培養液A和所述細胞培養液B按照5 I的體積比混合。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特征在于所述間充質干細胞為臍帶間充質干細胞；所述臍帶間充質干細胞優選為離體的臍帶間充質干細胞。
全文摘要
本發明公開了一種用于間充質干細胞培養的試劑盒及其應用。本發明提供的試劑盒，包括細胞培養液A和細胞培養液B；所述細胞培養液A為含80-120ng/ml細胞因子LIF與80-120ng/ml細胞因子bFGF的Knockout-DMEM培養基；所述細胞培養液B為胎牛血清。本發明提供的試劑盒能從離體臍帶中分離臍帶間充質干細胞，并培養所述臍帶間充質干細胞，具有細胞擴增速度快、擴增效率高的優點，且多次傳代后依然保持有細胞全能性。本發明解決了臍帶間充質干細胞分離的純度、數量和原代培養時間問題，可以獲得大量臍帶間充質干細胞，為利用臍帶間充質干細胞進行進一步實驗研究提供了豐富的來源。
文檔編號C12N5/0775GK102965335SQ20111025741
公開日2013年3月13日 申請日期2011年9月1日 優先權日2011年9月1日
發明者田杰 申請人:北京清美聯創干細胞科技有限公司