專利名稱：木糖葡萄球菌a2的高密度培養的培養基及培養方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物的培養方法，特別涉及木糖葡萄球菌的高密度培養方法。 屬于微生物培養技術領域。
背景技術：
木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)是發酵肉制品中十分重要的一種菌種， Schleifer Kloos于1976年首次描述該菌是一種凝固酶陰性葡萄球菌(CNS) (Advances in Microbial Physiology，1976，13 :245-292.)。此菌廣泛存在于多種傳統肉制品中(臨床檢驗雜志.2001,19 ) :226.)，絕大部分能產生蛋白酶(Applied microbiology, 2002, 92(1) :158-164.)和脂酶(Food Microbiology，2002，19 :441-449.)，具有溫和的蛋白質和脂肪分解能力，通過代謝產生一些短鏈脂肪酸、短肽和氨基酸(Meat Science, 2006, 74 281-288.)，賦予肉制品特殊風味(食品工業科技，2008，11 (29) :153-155.)，且不產生如生物胺、酪胺、苯乙胺、精胺等對人體有害的物質(Meat Science, 2006, 73 :559-564.)。該菌還因其高硝酸鹽還原酶活性(Meat Science, 2007, 75 :696-708.)和過氧化氫酶活性(食品科學，2010，31 (17) :388-391.)，具有抑制異味產生，穩定顏色及清除過氧化物的作用，同時該菌能產生細菌素，對李斯特菌及假單胞桿菌等致病菌具有一定的抑制作用(Meat science, 2001,59(3) J67-276.)，可延長發酵肉制品貨架期。目前國內外報道多集中在木糖葡萄球菌在發酵肉制品中發揮的作用方面，對其作為直投式發酵劑的高密度培養條件的報道還不
^^ ο發酵肉制品是指在自然或人工控制條件下，利用微生物或酶產生的發酵作用使原料肉發生一系列生物化學變化及物理變化，生成具有特殊風味、色澤和質地，且具有較長保存期的肉制品。近年來，隨著人們對高品質肉制品的需求逐漸加大，解決傳統發酵肉制品加工周期長、產率低、生產成本高等制約其規模化生產的問題具有十分重要的意義。直投式發酵劑具有活菌含量高、接種量少、發酵活力強、保藏期長、使用方便等特點，可使發酵制品生產更方便、產品質量更穩定(食品科學，2006,27(8) :191-197.),并避免了傳統發酵劑因中間繼代培養(包括菌種活化、種子發酵劑、中間發酵劑、生產發酵劑的擴大增殖等過程)而產生菌種發酵活力退化和雜菌污染等情況(Food Science and Technology, 2004,15 :67-78.)。直投式發酵劑可直接向專業生產廠家生產購買，減少了菌種車間的投資，簡化了工藝，提高了勞動生產率。本發明優化了木糖葡萄球菌的培養基配方，并對其培養條件和高密度培養物富集條件進行了研究，旨在提高培養物中木糖葡萄球菌活菌密度，為進一步利用其制備直投式肉制品發酵劑奠定基礎。
發明內容
本發明的目的在于提供木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)的優化增
殖培養基配方。
本發明的另一目的在于提供木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)的優化培養方法。本發明的另一目的在于提供木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)的高密度培養度的富集方法。所述的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus Α》為本發明人從發酵風干腸中提取并分離鑒定的菌種。菌種(株)A2保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為CGMCC No. 5049，保藏日期為2011年7月8日，菌種的分類命名為木糖葡糖球菌 (Staphylococcus xylosus)；本發明的目的是通過如下技術方案實現的首先，本發明提供了一種用于木糖葡萄球菌A2的高密度培養的培養基，其特征在于所述培養基的配制包含以下步驟(1)分別稱取下述原料0. 5重量份乳糖、2重量份示蛋白胨、0. 2重量份酵母膏、5 重量份香菇汁、7. 5重量份NaCl ；(2)將上述原料溶于1000重量份蒸餾水中，攪拌均勻，再使用中和劑將其pH值調節為7. 2-7. 8，裝于三角瓶中，再在溫度121°C下滅菌20分鐘，即得到所述的培養基。根據本發明的一種優選實施方式，所述的香菇汁可按照以下方法制備取新鮮香菇500g洗凈后切碎，加適量蒸餾水煮沸30min，冷卻后于組織搗碎機中搗碎、過濾，濾液經離心后加蒸餾水補足至500mL，得到香菇汁。根據本發明的一種優選實施方式，使用中和劑將培養基的PH值調節為7. 5。其次，本發明涉及一種木糖葡萄球菌A2的高密度培養方法，其特征在于該方法步驟如下a.菌種活化將冷凍保存的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)接種于MSA培養基斜面，在溫度32°C下培養至出現菌落，然后再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現菌落后，重復上面操作，連續轉接三次，使得活菌數達到IO7-IO8CfuAiL即得活化菌種；所述的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus Α》保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 5049 ；b.培養基的配制首先，分別稱取下述原料0. 5重量份乳糖、2重量份示蛋白胨、0. 2重量份酵母膏、 5重量份香菇汁、7. 5重量份NaCl ； 然后，將上述原料溶于1000重量份蒸餾水中，攪拌均勻，再使用中和劑將其PH值調節為7. 2-7. 8，裝于三角瓶中，再在溫度121°C下滅菌20分鐘，這樣得到所述的培養基；c.菌種發酵液的制備以使用所述的培養基重量計，將步驟a得到的活化木糖葡萄球菌A2菌種按照培養基重量的2% -4%接種于在步驟b得到的培養基中，在溫度30-34°C，搖床速度 120-150rpm/min條件下，培養15-20小時得到木糖葡萄球菌A2菌種發酵液；d.發酵以使用的培養基重量計，按照培養基重量的2% -4%將步驟c得到的木糖葡萄球菌A2菌種發酵液接種于在步驟b得到的培養基中，在溫度32-35°C下進行震蕩搖床發酵17 小時；e.終止發酵達到所述發酵時間后，將三角瓶置于4°C冷藏保存，終止發酵，得到木糖葡萄球菌 A2活菌數達到3 X IO9CfuAiL以上的木糖葡萄球菌高密度發酵液。根據本發明的一種優選實施方式，所述的中和劑是lmol/L NaOH溶液。根據本發明的一種優選實施方式，所述步驟b中通過添加中和劑調節發酵介質的 PH值為7. 5。根據本發明的一種優選實施方式，所述的三角瓶中發酵搖瓶裝液量的體積占三角瓶體積的 90% (450mL/500mL) 根據本發明的一種優選實施方式，步驟c得到的木糖葡萄球菌A2菌種發酵液接種在步驟b得到的所述培養基中，在溫度32°C，搖瓶速度是130rpm/min條件下，進行發酵17 小時。根據本發明的一種優選實施方式，所述的香菇汁可按照以下方法制備取新鮮香菇500g洗凈后切碎，加適量蒸餾水煮沸30min，冷卻后于組織搗碎機中搗碎、過濾，濾液經離心后加蒸餾水補足至500mL，得到香菇汁。進一步的，本發明還涉及一種木糖葡萄球菌Staphylococcus xylosus A2)高密度濃縮菌泥的制備方法，其特征在于將前面所述方法制備的木糖葡萄球菌A2高密度發酵液在0 4°C下，6000rpm/min條件下離心30分鐘，得到活菌數達到2. 06 X 10ncfu/mL以上的木糖葡萄球菌A2的高密度濃縮菌泥。由以上方法制備得到的木糖葡萄球菌A2高密度培養物可用于制備肉制品發酵劑，尤其可用于直投式木糖葡萄球菌發酵劑的制備。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。本發明具體實施例中所涉及的材料新鮮香菇購買自市場；乳糖、示蛋白胨、酵母膏、氯化鈉等均購買自北京奧博新生物技術有限公司。本發明具體實施例中所涉及的菌種木糖葡萄球菌A2，為本發明人從發酵風干腸中提取并分離鑒定的菌種，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為CGMCC No. 5049。實施例1一種木糖葡萄球菌A2的高密度培養方法，包括以下步驟a.菌種活化將冷凍保存的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)接種于MSA培養基斜面，在溫度32°C下培養至出現菌落，然后再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現菌落后，重復上面操作，連續轉接三次，使得活菌數達到IO7-IO8CfuAiL即得活化菌種；所述的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 5049 ；
b.培養基的配制首先，分別稱取下述原料0. 5g份乳糖、2g示蛋白胨、0. 2g酵母膏、5g香菇汁、7. 5g NaCl ；然后，將上述原料溶于IOOOg蒸餾水中，攪拌均勻，再使用lmol/L NaOH溶液將其 PH值調節為7. 2，裝于三角瓶中，三角瓶中的發酵搖瓶裝液量是90 %，再在溫度121 °C下滅菌20分鐘，這樣得到所述的培養基；c.菌種發酵液的制備以使用所述的培養基重量計，將步驟a得到的活化木糖葡萄球菌A2菌種按照培養基重量的2%接種于在步驟b得到的培養基中，在溫度30°C，搖床速度120rpm/min條件下， 培養20小時得到木糖葡萄球菌A2菌種發酵液；d.發酵以使用所述的培養基重量計，將步驟c得到的所述木糖葡萄球菌A2菌種發酵液按照培養基重量的4%接種于在步驟b得到的培養基中，在溫度35°C下進行震蕩搖床發酵17 小時；e.終止發酵達到所述發酵時間后，將三角瓶置于4°C冷藏保存，終止發酵，得到木糖葡萄球菌 A2活菌數達到3 X IO9CfuAiL以上的木糖葡萄球菌高密度發酵液。實施例2一種木糖葡萄球菌A2的高密度培養方法，其特征在于，包括以下步驟a.菌種活化將冷凍保存的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)接種于MSA培養基斜面，在溫度32°C下培養至出現菌落，然后再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現菌落后，重復上面操作，連續轉接三次，使得活菌數達到IO7-IO8CfuAiL即得活化菌種；所述的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus A2)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 5049 ；b.培養基的配制首先，分別稱取下述原料0. 5g乳糖、2g示蛋白胨、0. 2g酵母膏、5g香菇汁、7. 5g NaCl ；然后，將上述原料溶于IOOOg蒸餾水中，攪拌均勻，再使用lmol/L NaOH溶液將其 PH值調節為7. 5，裝于三角瓶中，再在溫度121°C下滅菌20分鐘，這樣得到所述的培養基；c.菌種發酵液的制備以使用的培養基重量計，將步驟a得到的活化木糖葡萄球菌A2菌種按照培養基重量的4%接種于在步驟b得到的培養基中，在溫度32°C，搖床速度130rpm/min條件下，培養 17小時得到木糖葡萄球菌A2菌種發酵液；d.發酵以使用的培養基重量計，將步驟c得到的木糖葡萄球菌A2菌種發酵液按照培養基 2%接種于在步驟b得到的培養基中，在溫度34°C下進行震蕩搖床發酵17小時；e.終止發酵達到所述發酵時間后，將三角瓶置于4°C冷藏保存，終止發酵，得到木糖葡萄球菌A2活菌數達到3 X IO9CfuAiL以上的木糖葡萄球菌高密度發酵液。將得到的木糖葡萄球菌A2高密度發酵液在4°C，6000rpm/min條件下離心30分鐘，得到活菌數達到2. 06X10ncfu/mL以上的木糖葡萄球菌A2高密度濃縮菌泥。實驗例1木糖葡萄球菌A2的高密度培養方法的條件優化本發明涉及一種木糖葡萄球菌A2的高密度培養方法。所述木糖葡萄球菌A2的高密度培養方法步驟如下1碳源的選擇研究了添加九種不同碳源制成的液體培養基，分別接種活化好的木糖葡萄球菌 A2，32°C恒溫培養17小時，檢測菌懸液活菌數，測定pH值，觀察每種碳源對其的增菌效果。根據附表1結果表明，木糖葡萄球菌A2在添加9種碳源的培養基中均可正常生長并進行代謝產酸。添加淀粉的培養基中增菌效果顯著高于添加其他單因子碳源增菌效果(P < 0. 05)；添加糊精、乳糖、半乳糖和海藻糖的培養基較添加其他單因子培養基的增菌效果也較好，且彼此之間差異不顯著(P > 0. 05)，木糖葡萄球菌A2在生長過程中利用碳源代謝產生乳酸，使溶液PH值降低，當溶液pH值過低時就會發生菌體“自溶”現象而抑制增長，由表1可看出增菌效果好的組在生長代謝Hh后，培養液中pH值下降并不顯著(P > 0. 05)。 因淀粉和糊精在高溫滅菌后成糊狀而使培養基呈分層狀態，綜合考慮經濟成本、工業化生產發酵罐的使用維護及菌體的富集分離等因素，故選取乳糖為木糖葡萄球菌A2的最佳碳源。表1不同碳源對木糖葡萄球菌A2菌體生長的影響
pH值
活菌數(cfu/mL)
權利要求
1.一種用于木糖葡萄球菌A2的高密度培養的培養基，其特征在于所述培養基的配制包含以下步驟首先，分別稱取下述原料0. 5重量份乳糖、2重量份示蛋白胨、0. 2重量份酵母膏、5重量份香菇汁、7. 5重量份NaCl ；然后，將上述原料溶于1000重量份蒸餾水中，攪拌均勻，再使用中和劑將其pH值調節為7. 2-7. 8，裝于三角瓶中，再在溫度121°C下滅菌20分鐘，即得到所述的培養基。
2.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于所述的香菇汁按以下方法制備取新鮮香菇500g洗凈后切碎，加適量蒸餾水煮沸30min，冷卻后于組織搗碎機中搗碎、過濾，濾液經離心后加蒸餾水補足至500mL，得到香菇汁。
3.根據權利要求1所述的培養基，其特征在于使用中和劑將其PH值調節為7.5。
4.一種木糖葡萄球菌A2的高密度培養方法，其特征在于，包括以下步驟a.菌種活化將冷凍保存的木糖葡萄球菌A2(Staphylococcus xylosus A2)接種于 MSA培養基斜面，在溫度32°C下培養至出現菌落，然后再從斜面上挑取菌苔接入另一個斜面，出現菌落后，重復上面操作，連續轉接三次，使得活菌數達到107-108cfu/mL，即得活化菌種；所述的木糖葡萄球菌A2 (Staphylococcus xylosus Α》保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為=CGMCC No. 5049 ；b.培養基的配制首先，分別稱取下述原料0. 5重量份乳糖、2重量份示蛋白胨、0. 2重量份酵母膏、5重量份香菇汁、7. 5重量份NaCl ；然后，將上述原料溶于1000重量份蒸餾水中，攪拌均勻，再使用中和劑將其pH值調節為7. 2-7. 8，裝于三角瓶中，再在溫度121°C下滅菌20分鐘，這樣得到所述的培養基；c.菌種發酵液的制備以使用所述的培養基重量計，將步驟a得到的活化木糖葡萄球菌A2菌種按照培養基重量的2% -4%接種于在步驟b得到的培養基中，在溫度30-34°C，搖床速度120-150rpm/min 條件下，培養15-20小時得到木糖葡萄球菌A2菌種發酵液；d.發酵以使用的培養基重量計，按照培養基重量的2% -4%將步驟c得到的木糖葡萄球菌A2 菌種發酵液接種于在步驟b得到的培養基中，在溫度32-35°C下進行震蕩搖床發酵17小時；e.終止發酵達到所述發酵時間后，將三角瓶置于4°C冷藏保存，終止發酵，得到木糖葡萄球菌A2活菌數達到3X IO9CfuAiL以上的木糖葡萄球菌高密度發酵液。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于步驟b中所述的香菇汁按以下方法制備 取新鮮香菇500g洗凈后切碎，加適量蒸餾水煮沸30min，冷卻后于組織搗碎機中搗碎、過濾，濾液經離心后加蒸餾水補足至500mL，得到香菇汁。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟b中通過添加中和劑調節發酵介質的PH值為7. 5 ；所述步驟b中中和劑是Imol/LNaOH溶液。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述步驟b中的三角瓶中的發酵搖瓶裝液量的體積占三角瓶體積的90%。
8.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述木糖葡萄球菌A2菌種發酵液接種在步驟b得到的培養基中，在溫度32°C，搖瓶速度是130rpm/min條件下，進行發酵17小時。
9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于進一步包括將得到的木糖葡萄球菌 A2高密度發酵液在0 4°C下，6000rpm/min條件下離心30分鐘，即得到活菌數達到 2. 06 X IO11CfuAiL以上的木糖葡萄球菌A2高密度濃縮菌泥。
10.由權利要求4-9任一項所述的方法制備得到的木糖葡萄球菌A2高密度培養物在制備肉制品發酵劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種木糖葡萄球菌A2的高密度培養方法及培養過程中所涉及的培養基。本發明的菌株是從發酵風干腸中提取并分離得到的，經鑒定確定為是一株木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)，命名為木糖葡萄球菌A2(Staphylococcus xylosus A2)可用于發酵肉制品，本發明進一步提供了該菌種的高密度培養方法，包括增殖培養基和發酵工藝條件優化控制，以及該菌株的高密度濃縮菌泥的制備方法。通過本發明的培養方法可以得到2.07×1011cfu/g以上活菌數的木糖葡萄球菌的高密度培養物，為進一步利用該菌株制備直投式木糖葡萄球菌發酵劑奠定了基礎。
文檔編號C12N1/20GK102329747SQ201110258768
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月2日 優先權日2011年9月2日
發明者刁新平, 孔保華, 馬宏慧 申請人:東北農業大學