專利名稱：基于二硫鍵強化折疊的熱穩定性脂肪酶突變體及其構建方法
技術領域：
本發明涉及熱穩定性提高的脂肪酶突變體，具體地說涉及利用分子生物學技術獲得熱穩定性提高的脂肪酶突變體，屬于酶工程技術領域。
背景技術：
脂肪酶(EC 3. I. I. 3)不僅能催化油脂水解，也能在非水相中催化酯合成、轉酯化、酸解等反應，被廣泛地應用于化學，食品，制藥和洗滌劑或生物能源工業中。微生物是脂肪酶的一個重要來源，而根霉又是微生物脂肪酶的重要生產菌。如今，已有超過30種根霉脂肪酶實現了商品化生產。根霉脂肪酶大都具有高度1，3-位置選擇性，因此常用于油脂加工中。但是油脂加工通常需要在較高溫度下進行，而根霉脂肪酶屬于中溫脂肪酶，熱穩定性差·不僅限制了其應用范圍，而且易于失活，增加了生產成本。脂肪酶具有特征性的界面活性，即在油水界面，脂肪酶的蓋子區域發生構象變化，由“閉蓋”構象轉變為“開蓋”構象，蓋子打開后，暴露出脂肪酶催化的活性位點以及底物結合區域，從而行使催化功能。酶的熱穩定性與酶結構的“剛性”與“柔性”有關，“剛性”越強則酶的結構更加趨于穩定，反之，“柔性”越強則酶的穩定性越差。針對脂肪酶，其蓋子區域的“柔性”最強，但同時也是脂肪酶發揮活性的重要功能區域，如何通過增強脂肪酶蓋子區域的“剛性”來提高脂肪酶的熱穩定性，而同時又不影響其催化活性，成為研究的難點。蛋白質中的_■硫鍵能夠提聞蛋白的穩定性。蛋白質_■硫鍵的原型是雙氣基酸妝的胱氨酸，它是以二硫鍵將兩個半胱氨酸結合組成。二硫鍵結構是以它在C0-Sy-Sy-C0原子之間的X。。兩面角來描述，而一般都是接近±90°。二硫鍵是通過以下方式穩定折疊后的蛋白質1.它將蛋白質的兩部份緊握，使蛋白質形成折疊的形狀。2.它會成為折疊后蛋白質的疏水核心，亦即局部的疏水殘基會凝聚在雙硫鍵的周邊，透過疏水性的相互作用而緊扣在一起。與I及2有關的，它會與蛋白質鏈的兩段連結，增加蛋白質殘基的局部有效濃度，并降低水分子的局部有效濃度。因為水分子會攻擊氨基之間的氫鍵及打破二級結構，二硫鍵就可以穩定在附近的二級結構。例如，有研究顯示肢的不同部份在分隔后沒有結構，但在建立二硫鍵后就有著穩定的二級結構及三級結構。發明人在前期研究中成功從釀造濃香型大曲酒的酒曲中篩選到一株高產脂肪酶的華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021菌株，并從該菌株中首次克隆得到脂肪酶基因序列，并實現該脂肪酶在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的高水平分泌表達(YuXiao-Wei et al. J Mol Catal B:Enzym, 2009，57:304-311)。但上述菌株產生的脂肪酶，存在熱穩定性較低的問題。
發明內容
本發明的目的在于提供一種具有較高熱穩定性的脂肪酶突變體。所述脂肪酶突變體是在脂肪酶結構的蓋子及其鉸鏈區域引入二硫鍵。
所述突變位于華根霉CCTCC M NO :201021第95位及第214位氨基酸，第95位氨基酸由苯丙氨酸突變成半胱氨酸，第214位氨基酸由苯丙氨酸突變成半胱氨酸，所述突變體氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。所述突變體的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本發明還提供了一種上述脂肪酶突變體的構建方法。以華根霉脂肪酶基因為模板，在生物信息學軟件分析的基礎上，通過在脂肪酶的蓋子鉸鏈區域引入一對二硫鍵來提高該酶的熱穩定性，而同時避免影響脂肪酶的催化活性。本發明還提供了一種應用上述脂肪酶突變體構建的重組畢赤酵母基因工程菌。以質粒pPIC9K_proRCL為模板，通過重疊延伸PCR在95位和214位引入兩個半胱 氨酸，得到重組質粒pPIC9K-ProRCLCYS，將重組質粒導入畢赤酵母得到表達脂肪酶突變體的重組畢赤酵母基因工程菌。酶分子的熱穩定性用Tm來表征。即在一半酶的構象發生變化的溫度。Tm值越高，則酶穩定性高。反之，則穩定性差。本發明通過在脂肪酶蓋子鉸鏈區域引入一對二硫鍵，增加了脂肪酶的剛性構象，而且對脂肪酶的催化活性并未產生影響，相對于親本脂肪酶，其Tm提高了 7V。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。材料和試劑所用限制性內切酶，T4DNA連接酶,pMD19_T simple載體,PCR試劑,DNA Marker等均購于TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌感受態細胞DH5a購自天根生物公司；引物，質粒提取試劑盒，PCR產物純化試劑盒均購于上海生工生物工程公司；電轉儀購自Bio-Rad公司；YPD、BMGY, BMMY以及YPD-G418均按照Invitrogen公司操作手冊配制；其他試劑均為國內或國外購買的分析純試劑。實施例I、二硫鍵突變位點的設計首先通過軟件SWISS-MODEL (http://swissmodel. expasy. ors/)建立華根霉脂肪酶的結構模型，以該模型為對象，利用軟件disulfide by design預測該脂肪酶結構中可能生成的二硫鍵。預測結果表明在脂肪酶蓋子鉸鏈區域可能形成二對二硫鍵，分別為Phe95Cys/Phe214Cys和Asn84Cys/Gly266Cys。注華根霉脂肪酶的蓋子及其鉸鏈區域為82Gtnsfrsaitdmvft96,蓋子區域由6個氨基酸組成，下劃線標示。結合分析該脂肪酶的結構模型，發現ASn84CyS/Gly266CyS距離蓋子區域太近，分析有可能影響蓋子的打開，從而對脂肪酶活力造成巨大影響。因此選擇同樣位于蓋子鉸鏈區域，但是相對距離較遠的一對二硫鍵Phe95Cys/Phe214Cys進行進一步研究。實施例2、脂肪酶突變體表達質粒的構建本發明所采用的質粒模板pPIC9K-pix)RCL為前期研究構建[王樂樂，喻曉蔚，徐巖，華根霉(Rhizopus chinensis)前導肽脂肪酶基因的克隆及其在Pichia pastoris中的表達，高技術通訊，(2009)，19 (10) : 105]，含有華根霉 Rhizopus chinensis CCTCCM201021脂肪酶基因(proRCL)。通過重疊延伸PCR的方法引入兩個半胱氨酸突變Phe95Cys和Phe214Cys，所使用的引物如下
權利要求
1.基于二硫鍵強化折疊的熱穩定性脂肪酶突變體，其特征在于，在華根霉CCTCCM NO:201021脂肪酶結構的蓋子鉸鏈區域進行突變引入二硫鍵。
2.根據權利要求I所述突變體，其特征在于所述突變位于華根霉CCTCCM NO =201021脂肪酶第95位及第214位氨基酸，第95位氨基酸由苯丙氨酸突變成半胱氨酸，第214位氨基酸由苯丙氨酸突變成半胱氨酸，所述突變體氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
3.根據權利要求I或2所述突變體，其特 征在于所述突變體的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。
4.權利要求I所述脂肪酶突變體的構建方法，其特征在于通過建立脂肪酶的結構模型，模擬分析后，在脂肪酶的蓋子鉸鏈區域通過氨基酸突變引入二硫鍵。
5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于以質粒pPIC9K-proRCL為模板，通過重疊延伸PCR在95位和214位引入兩個半胱氨酸，得到重組質粒pPIC9K-ProRCLCYS，將重組質粒導入畢赤酵母得到表達脂肪酶突變體的重組畢赤酵母基因工程菌。
6.含權利要求I所述脂肪酶突變體的基因工程菌或轉基因細胞系。
全文摘要
本發明公開了一種基于二硫鍵強化折疊的熱穩定性脂肪酶突變體及其構建方法和應用，屬于酶工程技術領域，以華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M 201021脂肪酶作為模板，在脂肪酶的蓋子鉸鏈區域引入二硫鍵而獲得的熱穩定性提高的脂肪酶突變體，相對于親本脂肪酶，其Tm提高了7℃，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/845GK102839164SQ20121032736
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月6日 優先權日2012年9月6日
發明者喻曉蔚, 徐巖 申請人:江南大學