專利名稱：一種擬南芥根特異性表達基因arsk1啟動子的克隆方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程領域，特別涉及一種擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法。
背景技術：
啟動子是基因表達調控因子中最重要的因子，基本決定一個基因是否表達、何時表達和何處表達。按作用方式和功能，啟動子大體可以分為組成型啟動子、特異性啟動子和誘導型啟動子三大類。目前，組織特異性啟動子的調控機制己進入深入研究階段，該類啟動子除具有基本結構外，通常還有一些調控特異表達的序列，這些序列為轉錄因子提供了結合位點，通過與蛋白質的相互作用來調節基因表達。在組織特異性啟動子的驅動下，基因的表達通常只發生在特定的組織或器官，并往往表現出發育調節的特性。根是植物吸收水分和營養物質的重要器官，根特異表達系統可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復和根際分泌等。擬南芥的磷酸轉移酶基因啟動子與Gtt？融合， 在農桿菌介導下轉化擬南芥和擬南芥，組織化學分析顯示蛋白只在擬南芥和擬南芥的根毛及根表皮表達，說明該啟動子是根特異的。Borisjuk等用根特異啟動子mas2、GFP和煙草鈣網蛋白基因(calreticulin)構建融合表達載體，轉基因煙草水培研究結果表明，根細胞不僅能高效產生某些目的蛋白質，而且可將目的蛋白質分泌到液體培養基中。植物的根系在植物抗旱中起著重要的作用，根系吸水力的提升和根系形態的建成，無疑對提高植物的吸水力，增強其抗旱性具有重要的意義。多數的植物功能基因如激素合成、代謝相關基因，植物生長、發育調控基因在植物的地上部分和地下部分均有表達，通過簡單的轉基因或者基因沉默的方式只能從整體上調節基因在植物體的表達，不能特異性的實現對植物根系功能和發育的調控。為了解決上述問題，需要利用植物根系特異性表達的啟動子驅動相關功能基因的表達，以達到既能提高植物吸水性、增加植物根系長度和數量，又不影響植物地上部生長、 不損害植物營養生長的目的，由此通過轉基因的手段能夠獲得相應的抗旱植株。目前的研究中需要克隆得到根特異性表達基因啟動子。
發明內容
本發明提供一種擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法。本發明的目的是通過以下技術方案實現的
一種擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法，該方法包括以下步驟 I、獲取擬南芥根特異性基因ARSKl
A、分別從擬南芥植株中提取擬南芥根總RNA和擬南芥葉總RNA，再分別進行反轉錄PCR 反應，分別擴增得到擬南芥根cNDA序列和擬南芥葉cNDA序列；
B、分別以所述的擬南芥根cNDA序列和擬南芥葉cNDA序列為模板，分別根據擬南芥根特異性基因設計引物，再分別進行半定量PCR反應，篩選得到擬南芥根特異性基因ARSKl ；II、獲取擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子
A、在線分析得到擬南芥根特異性表達基因ARSKl的啟動子，再在擬南芥根DNA中進行克隆得到所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子。步驟I -B中所述的擬南芥根特異性基因在擬南芥信息資源網站的編號分別為 AT1G79580. 1、AT1G62980. 1、AT1G66470. 1、AT1G27740. 1、AT1G54970. 1、AT3G10710. 1、 AT1G12560. U AT2G26420. UAT1G12040. UAT1G62440. U AT3G62680. UAT2G26290. 1。所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的序列為SEQ ID No :1。在步驟II之后，進行所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子功能驗證，包括以下步驟
A、在線分析得到所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的轉錄起始位點、含有的順勢作用元件；
B.將所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子進行5’端缺失處理，經過PCR反應得到ARSKl啟動子缺失體片段；
C.將所述的ARSKl啟動子缺失體片段分別構建ARSKl啟動子缺失體GUS表達載體；
D、將所述的ARSKl啟動子缺失體GUS表達載體轉化擬南芥植株，得到轉化體植株，再進行檢測。所述的ARSKl啟動子缺失體片段的大小分別為1981bp，1460bp, 879bp，762bp, 409bp，358 bp ；
本發明的有益效果為
因為本發明克隆到擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子，該啟動子為植物根系特異性表達的啟動子，可以驅動相關功能基因的表達，所以該啟動子具有特定地改變植物的根部形態、獲得相應的抗旱植株潛力轉入該啟動子的植株，在同等干旱條件下，存活率比相比對照組的野生型植株高60-70%。
圖1 實施例1中，12個擬南芥根特異性基因的擴增產物電泳結果。圖2 實施例1中，擬南芥基因ARSKl的基因圖譜。圖3 實施例1中，擬南芥基因啟動子ARSKl的基因圖譜。圖4 實施例1中，擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的擴增產物電泳結果。圖5 實施例1中，擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子序列中含有的順式作用元件的分析結果。圖6 實施例1中，6種ARSKl啟動子缺失體的結構簡圖。圖7 實施例1中，6種ARSKl啟動子缺失體⑶S表達載體的結構簡圖。圖8 實施例1中，6種ARSKl啟動子缺失體⑶S表達載體在擬南芥轉化體植株的表達量的Gus染色圖。
具體實施例方式實施例1
一種擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法，該方法包括以下步驟I、獲取擬南芥根特異性基因ARSKl
A、分別從擬南芥植株中提取擬南芥根總RNA和擬南芥葉總RNA，再分別進行反轉錄PCR 反應，分別擴增得到擬南芥根cNDA序列和擬南芥葉cNDA序列； 具體的操作為
分別取生長20d的擬南芥植株的根與葉為材料，用Trizol法分別提取擬南芥根與葉的總RNA，分別進行反轉錄PCR反應，分別得到擬南芥根cDNA和擬南芥葉cDNA ； 所述的反轉錄PCR反應的體系為RNA :1. 2 μ g, Oligo (dT) 15 2 μ 1， M-MLV buffer :5μ 1，dNTP Mix :1.25 μ 1，M-MLV :1μ 1，RNase inhibitor :0.6 μ 1， DEPC處理后的ddH20 補足25 μ 1 ； 所述的反轉錄PCR反應的程序為
加入上述oligo (dT) 15后70°C反應5分鐘，然后加入反轉錄PCR上述體系中的其他試劑，37°C反應1小時，得到所述的擬南芥根cNDA序列和擬南芥葉cNDA序列。
B、分別以所述的擬南芥根cNDA序列和擬南芥葉cNDA序列為模板，分別根據12 個擬南芥根特異性基因設計引物，再進行半定量PCR反應，篩選得到擬南芥根特異性基因 ARSKl ；
所述的12個擬南芥根特異性基因在擬南芥信息資源網站(ΤΑ^)，(網址為http:// www. arabidopsis. org/)的編號和記載該基因的文獻來源如下
SMB (AT1G79580. 1) :Tom Bennett, Albert van den Toorn, Gabino F, (2010). SOMBRERO, BEARSKIN1, and BEARSKIN2 Regulate Root Cap Maturation in Arabidopsis .Plant Cell. 22: 640 - 654 ；
EXP18 (AT1G62980. 1) =Hyung-Taeg Cho, Daniel J. Cosgrove, (2002). Regulation of Root Hair Initiation and Expansin Gene Expression in Arabidopsis. Plant cell. 14:3237 - 3253 ；
RHD6 (AT1G66470. 1) Jill S. Parker, Alison C. Cavell, Liam Dolan, (2000). Genetic Interactions during Root Hair Morphogenesis in Arabidopsis. Plant Cell. 12:1961 - 1974 ；
RSL4 (AT1G27740. 1) =Keke Yi, Beno t Menand, Elizabeth Bell, Liam Dolan, (2009). A basic helix-loop-helix transcription factor controls cell growth and size in root hairs, nature genetics. 10:1038 ；
PRPl (AT1G54970. 1) =Su-Kyung Won, Yong-Ju Lee, Ha-Yeon Lee, Yoon-Kyung Heo, Misuk Cho, and Hyung-Taeg Cho, (2009). cis-Element- and Transcriptome-Based Screening of Root Hair_Speci c Genes and Their Functional Characterization in Arabidopsis. Plant Physiology. 150:1459—1473 ；
RHS12 (AT3G10710.l):Su-Kyung Won, Yong-Ju Lee, Ha-Yeon Lee, Yoon-Kyung Heo, Misuk Cho, and Hyung-Taeg Cho, (2009). cis-Element- and Transcriptome-Based Screening of Root Hair_Speci c Genes and Their Functional Characterization in Arabidopsis. Plant Physiology. 150:1459—1473 ；
EXP7 (AT1G12560. 1) =Hyung-Taeg Chol1Daniel J. Cosgrove, ( 2002). Regulation of Root Hair Initiation and Expansin Gene. Plant Cell. 14:3237 - 3253 ；PIP5K3 (AT2G26420.1):Irene Stenzel,Till Ischebeck, Sabine Konig, (2008). The Type B Phosphatidylinositol-4-Phosphate 5—Kinase 3 Is Essential for Root Hair Formation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 20: 124 - 141 ；
LRXl (AT1G12040. 1) =Nicolas Baumberger, Christoph Ringli ， Beat Keller, (2001). The chimeric leucine-rich repeat/extensin cell wall protein LRXl is required for root hair morphogenesis in Arabidopsis thaliana. Genes Dev. 15: 1128-1139 ；
LRX2 (AT1G62440. 1) :N.Baumberger, M. Steiner, U. Ryser, (2003). Synergistic interaction of the two paralogous Arabidopsis genes LRXland LRX2 in cell wall information duiing root hair development. Plant Journal, 35:71-81 ；
PRP3 (AT3G62680. 1) Christine Bernhardt ,Mary L. Tierney, (2000).
Expression of AtPRP3, a Proline-Rich Structural Cell Wall Protein from Arabidopsis, Is Regulated by Cell-Type-Specific Developmental Pathways Involved in Root Hair Formation1. Plant Physiology. 122: 705 - 714 ；
ARSKl (AT2G26290.1) Jnhwan Hwang, Howard M. Goodman, (1995). An Arabidopsis thaliana root-specific kinase homolog is induced by dehydration, ABA, and NaC1. Plant Journal. 8(1):37-43 ；
利用01igo6.0軟件設計所述的12個擬南芥根特異性基因的半定量PCR反應引物；由于檢測基因較多，為提高實驗效率，在引物設計時應盡量使退火溫度保持集中、一致，即退火溫度為51°C ；具體引物序列如下 SMB
Upper :GGAGGAGGAGCTTCTTTAC ， Lower :CCAGAAACGACCAGTCTC CA ； EXP18
Upper :CG CAAGTGCCTGGTTATTTTA, Lower :CGG AGCAGCATTATAAGCGT ； RHD6
Upper :GGCACTCGTTAATGACCATC, Lower :G GTGATCAGATTCGAATTCC ； RSL4
Upper :GGACGTTTTTGTTGATGGTG, Lower :CG TACATCCATA GATCATCC ； PRPl
Upper :GCTGATTATTACGCTCCCTC ， Lower :GTT GGATCACTGTAGATGAC ； RHS12
Upper :CGC TGAGCTTCTTGACCTAAC, Lower =CGGT AGAATTGGCGTTGTGC ； EXP7 Upper :GTT CGTCGCTGGATACTATC, Lower =GCAA CGTTCCAAGCATAGAT ； PIP5K3
Upper :GCTGCCG AGATTAGAATAGT, Lower :GCACCACCA CTCTCCAAAA G ； LRXl
Upper :GGTTCAGATGTTTGCTCCT, Lower CTTCTAGGCTCTTCATGTTA C ； LRX2
Upper :GGC TCTGATGTTTGTTCCTAC, Lower :GG TTAGAGAGCTGACAAATGC ； PRP3
Upper :CCACCCGTTT ACAAGCCTAC, Lower :GAGCTCCAAGTTCTTGTCCG ； ARSKl
Upper :CG CAAGCAAATACGAAGGAG, Lower :CGTATGTTCGCCTTCAG GTC ； 所述的半定量PCR反應的體系為
Ex Taq buffer 2 μ l,dNTP Mix (2.5 mM each) :1.6 μ 1，Primer Mix (5 μ M each) :2. 4 μ 1，cDNA :2. 4 μ 1，Ex Taq :0. 2 μ 1，ddH20 :11. 4 μ 1 ；
所述的半定量PCR反應的程序為94°C預變性5 min ；94°C變性45 s, 55°C退火45 s，72°C延伸1 min，共30個循環；72°C延伸7 min ；4°C保存。通過所述的半定量PCR反應分別得到12個擬南芥根特異性基因的擴增產物；再將上述12個擬南芥根特異性基因的擴增產物進行檢測，篩選得到擬南芥根特異性基因 ARSKl ；
具體的操作為
將上述12個擬南芥根特異性基因的擴增產物進行瓊脂糖凝膠上電泳；電泳結果如圖1所示，泳道M為DNA marker II，泳道1為內參actin，泳道2_13分別為上述12個擬南芥根特異性基因的擴增產物；泳道4表明，所述的擬南芥根特異性基因ARSKl在擬南芥的根中的表達量大，在擬南芥的葉中幾乎不表達。II、獲取擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子
A、在線分析得到所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子，再在擬南芥根DNA中進行克隆得到所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子。具體的操作為
a.在NCBI網站上分析獲得擬南芥根特異性表達基因ARSKl的啟動子 在NCBI網站上找到擬南芥ARSKl基因序列，網址為 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NM_128186. 2 ； 在NCBI網站上分析ARSKl基因的map view,網址為
http://www.ncbi. nlm. nih. gov/mapview/maps. cgi taxid=3702&chr=2&MAPS=rna_r&cmd=focus&fill=40&query=uid(7448160)&QSTR=NM%5F128186%2E2 ；
圖2為擬南芥基因ARSKl的基因圖譜，由此可看出該基因含5個外顯子，4個內含子； 在NCBI網站上分析ARSKl基因啟動子的map view，網址為
http://www. ncbi. nlm. nih. gov/projects/mapview/maps. cgi TAXID=3702&CHR=2&MA PS=rna-r&QSTR=NM_128186. 2&QUERY=uid%287448160%29&BEG=ll%2C194%2C200&END=ll%2C 196700&oview=default ；
圖3為ARSKl基因啟動子的圖譜，第1個外顯子前2500左右的片段即為啟動子區； 在NCBI網站上找到已公布的擬南芥ARSKl基因上游的序列，網址為 http//www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/NC_003071. 7 from=l1194200&to=l1196700 &report=fasta ；
以上網址鏈接的頁面顯示了擬南芥ARSKl基因第1個外顯子前2500左右的序列，本實施例截取其中的1981bp，詳見序列表SEQ ID No 1，作為最終需要克隆的出來的所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子；
b.在擬南芥根DNA克隆得到所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子； 取生長20-28d，優選為25d的擬南芥植株，采用CTAB法提取擬南芥根DNA ；以上述擬南芥根DNA為模板進行PCR反應，得到擬南芥ARSKl基因的啟動子；該擬南芥為鼠耳芥屬，拉 ^f JC^ Arabidopsis thaliana ； 所述的PCR反應體系為
5 X buffer :5μ 1，dNTP Mix (2. 5 mM each) 2 μ 1, Primer Mix (5 μ M each) :2 μ 1, cDNA 1 μ 1, PrimeSTAR :0.25 μ 1，ddH20 :14.75 μ 1 ； 所述的PCR反應的引物為序列 Upper (帶酶切位點Hind III) 5-AAGCTT CCATGATTAACCTACGCTTC-—3，
Lower (帶酶切位點 Nco I ) :5_CCATGG GC CAT TTT CAA CTT CTT CTT TTG——3 ； 所述的PCR反應程序為
94°C預變性 5 min ;98°C變性 10s，50°C退火 15 s，72°C 延伸 2 min，共 30 個循環；72°C 延伸IOmin ；4°C保存；
將上述PCR反應的擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠上電泳；電泳結果如圖4所示，泳道M 為DNA marker III，泳道1-2中亮度較強的條帶大小為1981bp ； III、擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子功能驗證
A、在線分析得到所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的轉錄起始位點、含有的順勢作用元件；
在Softberry網站在線分析預測所述的稻根特異性表達基因ARSKl啟動子的轉錄起始位點，上述Softberry在線分析網址為
http//linuxl. softberry. com/berry. phtml topic=fgenesh&group=programs&subg roup=gfind ；
分析結果表明所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的轉錄起始位點可能位于自序列表SEQ ID No :1中的5'端第1866位的堿基T ；
在Place網站在線分析預測所述的稻根特異性表達基因ARSKl啟動子含有的的順式作用元件，上述 Place 在線分析網址為 http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE/signalscan. html ；
圖5為所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子含有的順式作用元件的分析結果所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子(序列表中SEQ ID No 1)的自5'端第 1834-1840 位核苷酸為 ΤΑΤΑΒ0Χ，自 5'端第 1567-1570 位，1621-16 位，1696-1699 位核苷酸為CAATB0X ；自5'端第1102-1106位核苷酸為根特異表達元件N0DC0N2GM ；第285-289 位，521-525 位，1219-1223 位，1572-1576 位，1581-1585 位，1623-1627 位核苷酸為根特異表達相關元件 R00TM0TIFTAP0X1。 B.將所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子進行5’端缺失處理，經過PCR 反應得到6種ARSKl啟動子缺失體卩1、？2、？3、？4、？5、？6片段； 具體的操作為
以擬南芥根cNDA序列為模板，分別根據上述6種ARSKl啟動子缺失體PI、P2、P3、P4、 P5、P6設計引物，再進行PCR反應，分別得到以上6種ARSKl啟動子缺失體的擴增產物，再進行回收處理，得到6種ARSKl啟動子缺失體片段；下表中為以上6種ARSKl啟動子缺失體的詳細信息；圖6為以上6種EXP18D啟動子缺失體的結構簡圖。
權利要求
1. 一種擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法，其特征在于該方法包括以下步驟1.獲取擬南芥根特異性基因ARSKlA、分別從擬南芥植株中提取擬南芥根總RNA和擬南芥葉總RNA，再分別進行反轉錄PCR 反應，分別擴增得到擬南芥根cNDA序列和擬南芥葉cNDA序列；B、分別以所述的擬南芥根cNDA序列和擬南芥葉cNDA序列為模板，分別根據擬南芥根特異性基因設計引物，再分別進行半定量PCR反應，篩選得到擬南芥根特異性基因ARSKl ；II、獲取擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子A、在線分析得到擬南芥根特異性表達基因ARSKl的啟動子，再在擬南芥根DNA中進行克隆得到所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子。
2.根據權利要求1所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法，其特征在于步驟I -B中所述的擬南芥根特異性基因在擬南芥信息資源網站的編號分別為 AT1G79580.1、AT1G62980. 1、AT1G66470. 1、AT1G27740. 1、AT1G54970. 1、AT3G10710. 1、 AT1G12560. UAT2G26420. UAT1G12040. UAT1G62440. UAT3G62680. U AT2G26290. 1。
3.根據權利要求1所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法，其特征在于所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的序列為SEQ ID No :1。
4.根據權利要求1所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法，其特征在于在步驟II之后，進行所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子功能驗證，包括以下步驟A、在線分析得到所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的轉錄起始位點、含有的順勢作用元件；B.將所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子進行5’端缺失處理，經過PCR反應得到ARSKl啟動子缺失體片段；C.將所述的ARSKl啟動子缺失體片段分別構建ARSKl啟動子缺失體GUS表達載體；D、將所述的ARSKl啟動子缺失體GUS表達載體轉化擬南芥植株，得到轉化體植株，再進行檢測。
5.根據權利要求4所述的擬南芥根特異性表達基因ARSKl啟動子的克隆方法，其特征在于所述的ARSKl啟動子缺失體片段的大小分別為1981bp, 1460bp, 879bp, 762bp, 409bp，358 bp。
全文摘要
本發明涉及植物基因工程領域，特別涉及一種擬南芥根特異性表達基因ARSK1啟動子的克隆方法，該方法包括以下步驟獲取擬南芥根特異性基因ARSK1、獲取擬南芥根特異性表達基因ARSK1啟動子。因為本發明克隆到擬南芥根特異性表達基因ARSK1啟動子，該啟動子為植物根系特異性表達的啟動子，可以驅動相關功能基因的表達，所以該啟動子具有特定地改變植物的根部形態、獲得相應的抗旱植株潛力轉入該啟動子的植株，在同等干旱條件下，存活率比相比對照組的野生型植株高60-70％。
文檔編號C12N15/10GK102417904SQ20111035940
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月11日 優先權日2011年11月11日
發明者吳忠義, 張秀海, 程曦, 羅昌, 黃叢林 申請人:北京農業生物技術研究中心