專利名稱：黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定方法及其專用引物。
背景技術：
斑皮蠹屬害蟲是重要的倉儲害蟲。目前對斑皮蠹的鑒定，主要根據形態學特征進行判別。但由于斑皮蠹類成蟲個體一般都比較小，且種間的形態差異不明顯，經常造成鑒定中的種間混淆。皮蠹個體小，成蟲體長2. 0-3. 5mm，且形態酷似不易區分。對成蟲的鑒定，主要根據觸角棒節數、觸角窩深淺、鞘翅顏色及斑紋特點等來鑒別；幼蟲體長4. 0-6. Omm, 一般是根據著生的剛毛數量和類型、第8腹節背板前脊溝是否完整和上內唇感覺乳突的個數等來鑒別。皮蠹的形態鑒別需要解剖后在顯微鏡下觀察，例如兩者幼蟲最重要的鑒別特征為觸角和上內唇，只有0. 1-0. 2mm大小，而其上的特征，如剛毛和乳突就更加細小，因此稍有不慎就可能將其破壞或丟失。這就不但需要鑒定工作者有豐富的技術經驗并且還得保證皮蠹害蟲的完整性，從而使得皮蠹近緣種害蟲的形態鑒定成為了日益費時費事的難題。COI基因是動物線粒體DNA中非常保守的編碼蛋白基因，它具有相對的保守性同時又有足夠的變異，即使是親緣關系很近的類群也存在幾個百分比的差異，所以COI常被用來反映種群遺傳變異信息，分析親緣關系較近的種、種下分類單元等。COI的序列差異性分析在雙翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、纓翅目等昆蟲的鑒別中都被用來作為重要的鑒別依據。而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，使序列比對更容易操作。目前，COI序列差異性分析已經成為物種間分類最普遍的分子標記之一。分子生物學技術手段已被用于昆蟲的鑒定分類中，目前對皮蠹屬近緣種的鑒定， 主要采用傳統的形態分類學，盡管也有采用PCR擴增片段，通過測序來鑒定的方法，但耗時且費用高，還沒有相關的快速分子生物學檢測方法。因此如何能夠快速準確的對斑皮蠹進行鑒定，已成為亟待解決的問題。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測皮蠹的引物對。本發明提供的引物對，由引物1和引物2組成；上述引物對中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。上述引物對中，所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本發明的另一個目的是提供一種檢測皮蠹的試劑。本發明提供的試劑，由上述引物對和AflII組成。在上述試劑中，所述引物對和所述AflII為獨立包裝；在上述試劑中，所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
本發明的第三個目的是提供一種檢測皮蠹的PCR試劑。本發明提供的PCR試劑，由上述的引物對、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；在上述PCR試劑中，所述引物對中的各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5μΜ。在上述PCR試劑中，所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本發明的第四個目的是提供一種檢測皮蠹的試劑盒。本發明提供的試劑盒，包括上述的試劑或上述的PCR試劑；在上述試劑盒中，所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。上述引物對或上述試劑或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測皮蠹中的應用也是本發明保護的范圍；上述應用中，所述皮蠹具體為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本發明的第五個目的是提供一種檢測或輔助檢測皮蠹的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟1)用上述引物對或上述試劑或上述PCR試劑或上述試劑盒中的引物對對待測皮蠹進行PCR擴增，得到擴增產物；2)分別用AflII酶切步驟1)得到的擴增產物，得到酶切產物，若所述酶切產物為535bp和347bp大小，則待測皮蠹為或候選為黑斑皮蠹；若所述酶切產物仍為880bp大小，則待測皮蠹為或候選為花斑皮蠹。在上述方法的PCR擴增中，以待測皮蠹的基因組DNA為模板；在上述方法的PCR擴增中，退火溫度為50°C-55°C，在本發明的實施例中采用的退火溫度為55°C。在上述方法中，檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。本發明的實驗證明，本發明根據斑皮蠹屬種之間線粒體基因序列差異性，尋找斑皮蠹不同種的物種特異性變異位點，建立對這些斑皮蠹種的分子鑒定體系，最終實現檢疫性斑皮蠹及其近緣種的快速、準確、高效鑒定。本發明的優點在于1、縮短檢測所需時間，從收集樣品到檢測完畢僅需1天。2、所需樣品量大大減少，同時檢測精準度大大提高。甚至蟲體不完全時也可以進行檢測鑒定，且結果可信度高。3、成本大大降低。此外，本方法還彌補了傳統分類鑒定中需要提供完整蟲體的要求，因為在實際檢疫工作中，斑皮蠹屬害蟲在生活過程中不斷在糧粒或其他儲藏物內穿行，身上的毛極易脫落，尤其幼蟲體表組織柔軟，使得有些蟲體不能保持完整，而本實驗方法即使在蟲體不完全時也可以進行檢測鑒定。
圖1為皮蠹的PCR擴增結果圖2為限制酶AflII酶切皮蠹PCR產物的電泳圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、引物的設計根據已有的谷斑皮蠹的序列(基因序列號FJ58973)，設計引物Tgla-F 5-CAACATTTATTTTGATTT-3 (序列 1)Tgla-R 5-TCCAATGCACTAATCTGCCA-3 (序列 2)實施例2、黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定1、皮蠹樣品DNA的提取分別取編號為1和2的兩頭皮蠹分別由黃埔出入境檢驗檢疫局(采集于廣州黃埔)和山東農業大學提供(采集于山東泰安)，采用Tiangen組織基因組DNA提取試劑盒 (TIANamp Genomic DNA Kit)，按照說明提取被測樣品總DNA。具體為將活蟲在200 μ 1 GA緩沖液中研磨碎，混勻后加入20ul蛋白酶K，37°C放置4hr。隨后加入200 μ 1 GB緩沖液，混勻后，在70°C放置lOmin。加入200ul無水乙醇，充分混勻15s。將所得溶液轉入CB3 吸附柱中，離心，12，OOOrpm，30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入 0. 5ml⑶緩沖液，離心，12，OOOrpm，30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3 中加入0. 7ml漂洗液PW，離心，12，OOOrpm，30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入0. 5ml漂洗液PW，離心，12，OOOrpm，30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。 離心，12，OOOrpm，2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫幾分鐘，以徹底晾干殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉入干凈的離心管中，向吸附膜中央滴加50ul洗脫緩沖液TE，室溫放置 5min, 12，OOOrpm離心2min,分別得到1和2的總DNA。2、PCR 擴增分別以上述1得到的1和2的總DNA為模板，以Tgla-F和Tgla-R為正反向引物，加入PCR試劑盒提供試劑(Tiangen)，進行片斷擴增，反應體系為20ul，其中2 μ 1 IOXTaqReaction Buffer 緩沖液，1. 25U Taq polymerase, 1 μ 1 dNTP (終濃度 125 μ Μ)， 0. 5μΜ/弓丨物(終濃度0· 5μΜ/引物)，20ng DNA。反應條件為95°C，5min，1個循環；94°C, 30s，55°C，45s，72°C，lmin，35 個循環；最后 72°C延伸 10min，l 個循環。擴增后產物在2%瓊脂糖膠中進行電泳，結果如圖1所示，可以看出，其中1為1 號皮蠹PCR產物，2為2號皮蠹PCR產物，3. 200bp DNAladder (Tiangen)從上到下依次為 第一條帶4000bp ；其它從2200bp開始，每條遞減200bp，直至最低條帶200bp ；可以看出， 均得到大小約為880bp的PCR產物。2、酶切及結果檢測將上述1號皮蠹PCR產物和2號皮蠹PCR產物分別采用特異性酶AflII進行酶切，酶切體系20yL反應體系如下10U Afl ΙΙ,2μ L 10 X NEBuffer, 0. 2 μ LlOO X BSA, DNA 的 PCR 產物 17. 3 μ L (終濃度約 370ng/ul)。將混合體系在 PCR 儀 37°C 條件下孵育ι小時后，各取 ο μ L酶切產物，經1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物并拍照。酶切后產物在2%瓊脂糖膠中進行電泳，電泳后EB染色，以檢測酶切結果，具體為取lOulDNA擴增產物，與樣品緩沖液混合均勻，點入2%瓊脂糖膠中，進行電泳，90V， 35min。電泳后EB染色lOmin，在UV燈下檢測結果。若得到的PCR產物經過AflII酶切后得到535bp和347bp的片段，則待測樣品為
黑斑皮蠹；
若得到的PCR產物經過AflII酶切后仍為880bp左右的片段，則待測樣品為花斑皮蠹。結果如圖2所示，其中1. IOObpDNAladder(Tiangen)，從上到下依次為第一條帶1500bp ；其它從IOOObp開始，每條遞減lOObp，直至最低條帶100bp，2. 1號皮蠹PCR產物酶切后，3. 2號皮蠹PCR產物酶切后，4. 200bp DNAladder(Tiangen)從上到下依次為第一條帶4000bp ；其它從2200bp開始，每條遞減200bp，直至最低條帶200bp。可以看出，1 號皮蠹PCR產物酶切后得到535bp和347bp的產物，2號皮蠹PCR產物酶切后，仍為880bp 左右的片段，說明1號皮蠹為黑斑皮蠹，2號皮蠹為花斑皮蠹。將上述1號皮蠹PCR產物和2號皮蠹PCR產物分別送去測序，結果分別為序列表中的序列4和序列表中的序列3，與genbank比對，序列4即為黑斑皮蠹的COI部分序列，而序列3即為花斑皮蠹的COI部分序列，這個檢測結果與本發明的檢測結果一致，證明本發明的方法正確。
權利要求
1.一種檢測皮蠹的引物對，由引物1和引物2組成所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。
2.根據權利要求1所述的引物對，其特征在于 所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
3.—種檢測皮蠹的試劑，由權利要求1或2所述的引物對和AflII組成。
4.根據權利要求3所述的試劑，其特征在于 所述引物對和所述AflII為獨立包裝；所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
5.一種檢測皮蠹的PCR試劑，由權利要求1或2所述的引物對、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述引物對中的各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5μΜ ；所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
6.一種檢測皮蠹的試劑盒，包括權利要求3或4所述的試劑或權利要求5所述的PCR 試劑；所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
7.權利要求1或2所述引物對或權利要求3或4所述試劑或權利要求5所述PCR試劑或權利要求6所述試劑盒在檢測或輔助檢測皮蠹中的應用；所述皮蠹具體為黑斑皮蠹和 /或花斑皮蠹。
8.—種檢測或輔助檢測皮蠹的方法，包括如下步驟1)用權利要求1或2所述引物對或權利要求3或4所述試劑或權利要求5所述PCR試劑或權利要求6所述試劑盒中的引物對對待測皮蠹進行PCR擴增，得到擴增產物；2)分別用AflII酶切步驟1)得到的擴增產物，得到酶切產物，若所述酶切產物為535bp和347bp大小，則待測皮蠹為或候選為黑斑皮蠹； 若所述酶切產物僅為880bp大小，則待測皮蠹為或候選為花斑皮蠹。
9.根據權利要求8的方法，其特征在于所述PCR擴增中，以待測皮蠹的基因組DNA為模板； 所述PCR擴增的退火溫度為50°C -55°C。
10.根據權利要求8或9的方法，其特征在于所述檢測PCR擴增產物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
全文摘要
本發明公開了一種黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定方法及其專用引物。本發明提供的引物對，由引物組1和引物2組成；上述引物對中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。本發明的實驗證明，本發明根據斑皮蠹屬種之間線粒體基因序列差異性，尋找斑皮蠹不同種的物種特異性變異位點，建立對這些斑皮蠹種的分子鑒定體系，最終實現檢疫性斑皮蠹及其近緣種的快速、準確、高效鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102399878SQ20111036189
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者劉二龍, 劉聰, 呂英姿, 林惠嬌, 樊武疆, 王新國, 班麗萍, 蔣湘 申請人:中國農業大學