專利名稱：拮抗結核分枝桿菌表面脂糖的核酸適配子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬微生物免疫和臨床治療領域，具體涉及一種能用于治療和診斷由人結核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis, H37Rv) [ATCC 93009(4)]導致的結核病的單鏈 DNA適配子，本發明還涉及該適配子的在診斷或治療結核感染中的應用。
背景技術：
目前，結核病仍然是威脅人類生命健康的主要傳染病之一，也是導致人類死亡的主要因素之一。據WHO統計，目前全球約20億人感染結核，2008年全球約1110萬人患有活動性肺結核，且約有180萬人死于結核病。隨著結核耐藥菌株的不斷出現，結核病的治療面臨巨大的挑戰，全球范圍急需開發新型的結核病治療藥物。結核病治療方面，目前最常用的結核治療藥物利福平、異煙胼、鏈霉素、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇，雖然是目前有效的結核治療藥物，但利福平、異煙胼及吡嗪酰胺對患者都具有肝臟毒性，二者聯合應用肝臟毒性更大(Capelle P，Dhumeaux D，Mora Μ, Feldmann G, Berthelot P.Effect of rifampicin on liver function in man.Gut. 1972,13 (5) 366-371)；鏈霉素雖然可以通過抑制蛋白質合成來有效的殺滅結核分支桿菌，但是該藥物可造成不可逆的第八對腦神經損害，包括共濟失調、眩暈、耳鳴、耳聾等，同時與其他氨基糖苷類相似，可引起腎臟毒性反應(Furst G, Maurer J, Schlegel J. Monitoring ototoxic side effects in streptomycin therapy of tuberculosis patients with transitory evoked otoacoustic emissions ΤΕ0ΑΕ. Pneumologie. 1995,49(11) :590-595)；而乙胺丁醇主要與異煙胼、利福平、吡嗪酰胺聯合應用于治療的強化期，但其毒副作用與其劑量成正比，可弓I起嚴重的視神經炎(Lim SA. “ Ethambutol-associated optic neuropathy“. Ann. Acad. Med. Singap. 2006，35 (4) :274-278)。同時，由于不規范用藥等多種因素導致以上幾種結核治療藥物耐藥率越來越高。盡管不斷有人進行新藥物諸如mOXiflOXacin、R207910 的開發研制，然而目前新的抗結核病藥物發展趨勢總體較慢，急需研制新型抗結核藥物。脂糖是結核分枝桿菌胞壁的主要成分，大約30%結核分枝桿菌基因參與了脂類的合成和代謝。甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(Mannosylated lipoarabinomannan, ManLAM)是主要存在于致病的人結核分枝桿菌胞壁中的脂糖。研究表明，脂糖ManLAM可以通過抑制樹突狀細胞(DC)的成熟、增加免疫抑制性細胞因子如白細胞介素IO(IL-IO) 的表達、抑制白細胞介素12(IL-12)的表達以及調節性T細胞的產生等一系列機制來抑制機體的免疫功會邑(Barnes PF, Roy S，et al. Mannose-capped lipoarabinomannan-and prostaglandin E2~dependent expansion of regulatory T cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. Eur J Immunol. 2008，38(2) :459-469)。SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)蹄選技術是90年代發展起來的一種新的體外篩選技術，它運用大容量的單鏈隨機寡核苷酸文庫， 并結合體外PCR擴增技術，以指數富集與靶分子特異結合的寡核苷酸配基，經過多輪篩選后獲得高親和力、特異性強的寡核苷酸適配子(aptamers) (Stoltenburg R，Reinemann C，Strehlitz B.SELEX—a(r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol Eng. 2007,24(4) :381-403)，具有庫容量大、親和力高、靶分子范圍廣等優點，已成功運用于許多靶分子的篩選中，已經被廣泛的應用于包括感染性疾病、腫瘤等的診斷制劑開發研究中，是極具診斷潛力的新型小分子制劑。本研究采用SELEX技術篩選獲得了能與毒性結核分枝桿菌H37Rv表面脂糖ManLAM特異性結合的單鏈DNA適配子，通過封閉具有免疫抑制作用的ManLAM，逆轉其免疫抑制效應，達到良好的治療效果。
發明內容
本發明的第一個目的在于提供一種能與毒性結核分支桿菌H37Rv表面脂糖 ManLAM特異性結合的單鏈DNA適配子ZXLl。本發明的第二個目的在于提供上述DNA適配子在制備診斷結核病試劑中的應用；本發明的第三個目的在于提供上述DNA適配子在制備抗結核藥物中的應用；本發明的目的還在于提供制備上述DNA適配子的方法。為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案一種能特異性結合毒性結核分支桿菌H37Rv的DNA適配子，其具有ZXLl所示的核苷酸序列。本發明通過隨機單鏈DNA文庫以及引物的構建、SELEX篩選、PCR擴增、親和力測定、體外不同細菌結合實驗等得到具有與毒性結核分支桿菌H37Rv高特異性、高親和力的 DNA適配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。通過免疫學實驗證實該適配子可以逆轉 ManLAM導致的免疫抑制作用，動物實驗證實該適配子具有很好的抗結核感染能力。此外，本領域技術人員可以在本發明SEQ ID No. 1的基礎上，通過替換、缺失和/或者插入一個或幾個核苷酸，也能得到與本發明具有同等功能的適配子序列，例如SEQ ID No.5所示的序列。 另外，以SEQ ID No. 1為核心序列，按SEQ ID No. 2 (n30為SEQ ID No. 1所示的核心序列) 中SEQ ID No. 2由所述核心序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列。由此，本發明適配子包括DSEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經替換、缺失和/或者插入一個或幾個核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1同等功能的序列；或，3)含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列為核心序列并兩邊延長的序列，如SEQ ID No. 2由1)所述序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列，其中SEQ ID No. 2中的n30為1) 所述的核心序列。具體地，本發明采用下述方法獲得特異性結合毒性結核分枝桿菌H37Rv 的DNA適配子1、構建隨機單鏈DNA(ssDNA)文庫及引物構建長度88 個堿基的單鏈 DNA 文庫5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAG TCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表A，T, C, G四個隨機堿基。上游引物為 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，畫線部分為 EcoRI 的 DNA 限制性酶切位點；下游引物為5，-GCGGGATCCTATGACGCATT GACCC-3’，畫線部分為BamHI的DNA限制性酶切位點。隨機單鏈DNA文庫以及引物均可由公司合成。2、dsDNA及ssDNA文庫的PCR擴增及保存
每一輪篩選前先將ssDNA文庫擴增為dsDNA文庫后保存，取少量dsDNA文庫作為模板擴增出下一輪篩選的ssDNA文庫。反應程序均為95°C 5min，95°C 36s,60°C 36s， 72°C 8 ，20-30個循環，72°C 5min。循環次數根據具體的擴增效果進行調整。PCR產物通過3%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，膠純化試劑盒進行回收(按照試劑盒產品說明書操作)。3、SELEX 篩選每輪篩選所用的ssDNA量均為40pmol，使用前置于85°C水浴10分鐘后迅速冰浴 5min ；將提純的毒性結核分支桿菌表面的脂糖ManLAM(按照參考文獻的方法進行提取純化)溶于包被緩沖液中包被96孔ELISA板，4°C過夜；使用篩選洗脫液反復洗滌6次后加入 40pmol的ssDNA文庫，37°C孵育Ih后用篩選洗脫液洗滌6次；在篩選孔中加入100μ 1高壓滅菌的雙蒸水(ddH20)，95°C加熱10分鐘；將孔內ddH20吸至新的EP管中，然后加入2倍體積的無水乙醇及1/10體積的NaAc (3M)置于_70°C沉淀過夜，最后通過凝膠回收。上述篩選緩沖液為20mM pH 7. 4Tris · HCl, 137mM NaCl,5mM KCl,2mM CaCl2, ImM MgCl204、ManLAM梯度壓力篩選為了獲得高特異性結合的DNA適配子，選用ManLAM梯度篩選來增加篩選壓力。前三輪用8 μ g的ManLAM，后續篩選逐漸降低ManLAM的用量，第4輪到第9輪用0. 8 μ g，第10 到第12輪ManLAM量降為0. 08 μ g。并從第5輪開始通過外周血單個核細胞(PBMC)進行反篩，第5至第7輪用IX IO6的PBMC反篩，第8至第10輪用5X IO6的PBMC反篩，第11、12 輪用1 X IO7的PBMC反篩。收集第4輪獲得的ssDNA適配子40pmol，使用前置于85°C水浴 IOmin后冰浴5min ；將分離的正常人PBMC包被ELISA板，加入ssDNA適配子，37°C孵育Ih 后吸取上清液；然后將上清液重復步驟2與ManLAM進行作用。5、ssDNA適配子庫與毒性結核分枝桿菌ManLAM的親和力比較采用Elisa的方法測定每一輪的ssDNA和ManLAM的親和力。具體方法如下用每一輪的dsDNA和生物素標記的引物2通過不對稱PCR擴增大量的ssDNA適配子，然后瓊脂糖凝膠電泳回收，測濃度后備用；用0. 8μ g的ManLAM包被ELISA板，4°C過夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS(PBST)洗6次；每孔加入含鮭魚精DNA(100g/mL)的PBS 100 μ L進行封閉，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分別加入100 μ L含生物素標記的每一輪的生物素標記的ssDNA (40pmol),37°C, Ih ；用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀釋的HR標記的鏈霉親和素 37°C，30min ；TMB 顯色。通過檢測，第12輪具有與ManLAM最高的親和力，將第12輪ssDNA進行不對稱PCR 擴增，得到dsDNA產物，經DNA限制性內切酶EcoRI以及BamHI消化后連接于質粒pUC19 載體(Yanisch-Perron, C.，1985)上，轉化大腸桿菌 DH5a (Hanahan，D.，1983)，通過氨芐青霉素進行抗性篩選，挑取單克隆，提取質粒后進行測序，得到上述的核苷酸序列(如SEQ ID No. 1所示)。進而，本發明提供上述DNA適配子ZXLl在制備診斷試劑中的應用。以ZXLl為模板，PCR擴增生物素以及熒光素(FAM)標記的適配子，然后采用E1ISA、流式細胞術以及激光共聚焦的方法測定與不同細菌的結和力。結果顯示，ZXLl與毒性結核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力，與其它的分支桿菌及金黃色葡萄球菌等親和力很低，與卡介苗以及無毒的恥垢分支桿菌親和力很低。因而可以使用本發明適配子對結核分枝桿菌H37Rv進行檢測，說 診斷是否感染結核菌。本發明還提供上述DNA適配子ZXLl在制備抗結核病藥物中的應用。本發明研究表明將結核分枝桿菌與樹突狀細胞(DC)混合，單鏈DNA適配子ZXLl可以降低H37Rv導致的樹突狀細胞(DC)成熟的減少，同時增加IL-12的產生，降低IL-10的產生，說明該適配子能刺激細胞免疫；毒性結核分枝桿菌H37Rv感染Balb/c小鼠后，使用單鏈適配子ZXLl進行治療，然后觀察小鼠的生存情況，發現該適配子可以延長結核感染的小鼠的生存率；毒性結核分枝桿菌H37Rv感染小鼠后經ZXLl治療，發現適配子治療組小鼠脾臟指數低于PBS對照組，說明該適配子能抗結核感染；抗酸染色證實，結核分枝桿菌H37Rv感染的小鼠在適配子 ZXLl作用后與未使用適配子組小鼠相比，小鼠肺臟的細菌載量明顯減少，說明該適配子能抗結核感染；此外，結核分枝桿菌H37Rv感染的小鼠在適配子ZXLl作用后與未使用適配子組小鼠相比，小鼠肺臟及脾臟的病理改變明顯較輕，說明該適配子能抗結核。因而，本發明適配子可以制成抗結核病的藥物，用于預防或治療結核分枝桿菌感染所引起的疾病。本發明ssDNA可以采用任何方法制備獲得，例如包括不限于直接合成；通過不對稱PCR得到；采用普通PCR方法，在任一引物上連接可分離標記(例如生物素標記)，獲得 PCR產物后變性分離(例如采用生物素-親和素系統分離)。本發明的優點和效果一、篩選獲得的ssDNA適配子可特異性與毒性結核分枝桿菌H37Rv表面ManLAM 結合，可以直接封閉ManLAM的免疫抑制作用。適配子制備簡單，價格低廉，確保了獲得的 ssDNA適配子特異性的結合在毒性結核分枝桿菌表面，進一步提高了治療的靶向性。二、為克服臨床上結核治療出現的日益嚴重的耐藥問題和副作用大的問題提供了新的解決思路。本發明制備的針對毒性結核分支桿菌表面ManLAM的ssDNA適配子為小分子核酸，其分子結構不同于廣譜抗生素，無耐藥的可能；同時它只針對結核分支桿菌發揮作用，對益生菌無害。三、免疫學實驗證實該適配子可以有效的逆轉ManLAM所致的免疫抑制作用，具有治療結核病效果。四、動物實驗結果可見，小鼠行毒性結核分枝桿菌攻毒后，用ssDNA適配子處理后的小鼠生存率明顯延長，肺臟菌落明顯少于對照組，脾臟、肺臟病理變化也較對照組輕，說明ssDNA適配子可以有效的降低結核分枝桿菌的感染，延長結核感染小鼠的生存時間。此外，該適配子已經克隆到PUC19載體上，且已經轉化至大腸桿菌Dffia中，可以直接通過該菌種進行大量制備該適配子。總而言之，本發明提供的DNA適配子與毒性結核分支桿菌作用特異性高，親和力強，為結核病的診斷提供了新型的制劑。克服了臨床上對結核抗原診斷的非特異性、不靈敏性以及周期長的缺點，為結核病的診斷和治療提供了一種新的途徑。
圖1. SELEX技術篩選特異性結合毒性結核分枝桿菌H37Rv表面ManLAM的ssDNA 適配子擴增結果圖。用合成的隨機ssDNA文庫與ManLAM進行作用，去掉未結合的部分，第5輪開始通過PBMC進行反篩，共篩選12輪。每輪篩選前將ssDNA文庫擴增為dsDNA文庫，保存，以dsDNA文庫為模板擴增下一輪ssDNA文庫。圖2.等溫滴定法測定ZXLl與ManLAM的親和力結果示意圖。以0rigin6. 0軟件對ZXLl和ManLAM作用的稀釋熱進行雙位點模型非線性最小方差擬合，得到本征結合常數Ka0 ZXLl與ManLAM結合常數為Ka :5. 27 X IO5 (士2. 9 X IO3)M-1， 而對照適配子ZXL4與ManLAM幾乎沒有親和力。圖3.表面等離子共振技術(SPR)測定單鏈DNA適配子ZXLl與ManLAM的親和力結果示意圖。以BiacoreTlOO軟件對ZXLl和ManLAM作用進行擬合，得到二者的解離常數KD值， 適配子ZXLl與ManLAM作用的解離常數KD值為8. 907 X 1θΛ 。圖4Α、4Β.適配子ZXLl與不同細菌親和能力大小的結果示意圖。以ZXLl為模板，PCR擴增生物素以及熒光素(FAM)標記的適配子，然后采用 E1ISA、流式細胞術以及激光共聚焦的方法測定與不同細菌的結和力。圖4Α顯示，ZXLl與毒性結核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力，與其它的分支桿菌及金黃色葡萄球菌等親和力很低；4Β顯示，ZXLl與毒性結核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力，而與卡介苗以及無毒的恥垢分支桿菌親和力很低。圖5. ZXLl在結核病診斷中的應用結果示意圖。圖6Α、6Β.適配子ZXLl逆轉ManLAM所致的免疫抑制作用結果示意圖。將結核分枝桿菌與樹突狀細胞(DC)混合，單鏈DNA適配子ZXLl可以降低H37Rv 導致的樹突狀細胞(DC)成熟的減少，同時增加IL-12的產生，降低IL-10的產生，說明該適配子能刺激細胞免疫。圖7.適配子ZXLl延長結核分枝桿菌感染小鼠的生存率結果示意圖。毒性結核分枝桿菌H37Rv感染Balb/c小鼠后，使用單鏈適配子ZXLl進行治療，然后觀察小鼠的生存情況，發現該適配子可以延長結核感染的小鼠的生存率。圖8.適配子ZXLl降低結核感染小鼠脾臟重量指數結果示意圖。毒性結核分枝桿菌H37Rv感染小鼠后經ZXLl治療，發現適配子治療組小鼠脾臟指數低于PBS對照組，說明該適配子能抗結核感染。圖9.結核感染恒河猴適配子ZXLl治療示意圖。圖9A-B結核感染恒河猴血液學變化；圖9C適配子ZXLl治療組肺臟中結核荷菌量明顯少于PBS對照組。
具體實施例方式以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例IDNA適配子的篩選本發明可以特異性結合毒性結核分枝桿菌H37Rv的DNA適配子，按照下列步驟篩選獲得1、構建隨機單鏈DNA文庫及引物構建長度88 個堿基的單鏈 DNA 文庫5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAG TCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGT CATA-3’，其中N代表A，T，C，G四個隨機堿基。上游引物為5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，畫線部分為 EcoRI 的 DNA 限制性酶切位點；下游引物為5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，，畫線部分為BamHI的DNA限制性酶切位點。隨機單鏈DNA文庫以及引物均可由上海博亞生物有限公司合成。2、dsDNA及ssDNA文庫的PCR擴增及保存每一輪篩選前先將ssDNA文庫擴增為dsDNA文庫后保存，取少量dsDNA文庫作為模板擴增出下一輪篩選的ssDNA文庫。反應程序均為95°C 5min，95°C 36s,60°C 36s， 72°C別s，20-30個循環，72°C 5min，均參照IBM公司Klenow Fragment產品說明書進行。 PCR產物通過3%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，膠純化試劑盒進行回收。3、SELEX 篩選每輪篩選所用的ssDNA量均為40pmol，使用前置于85°C水浴10分鐘后迅速冰浴 5min ；將提純的毒性結核分支桿菌表面的脂糖ManLAM(按照參考文獻的方法進行提取純化)溶于包被緩沖液中包被96孔ELISA板，4°C過夜；使用篩選洗脫液反復洗滌6次后加入 40pmol的ssDNA文庫，37°C孵育Ih后用篩選洗脫液洗滌6次；在篩選孔中加入1001高壓滅菌的雙蒸水(ddH20)，95°C加熱10分鐘；將孔內ddH20吸至新的EP管中，然后加入2倍體積的無水乙醇及1/10體積的NaAc (3M)置于_70°C沉淀過夜，最后通過凝膠回收。上述SELEX 篩選緩沖液為20mM pH 7.4 Tris · HCl，137mM NaCl, 5mM KCl,2mM CaCl2, ImM MgCl2。4、ManLAM梯度壓力篩選為了獲得高特異性結合的DNA適配子，選用ManLAM梯度篩選來增加篩選壓力。前三輪用8 μ g的ManLAM，后續篩選逐漸降低ManLAM的用量，第4輪到第9輪用0. 8 μ g，第10 到第12輪ManLAM量降為0. 08 μ g。并從第5輪開始通過外周血單個核細胞(PBMC)進行反篩，第5至第7輪用IX IO6的PBMC反篩，第8至第10輪用5X IO6的PBMC反篩，第11、12 輪用1 X IO7的PBMC反篩。收集第4輪獲得的ssDNA適配子40pmol，使用前置于85°C水浴 IOmin后冰浴5min ；將分離的正常人PBMC包被ELISA板，加入ssDNA適配子，37°C孵育Ih 后吸取上清液；然后將上清液重復步驟2與ManLAM進行作用。5、ssDNA適配子庫與毒性結核分枝桿菌ManLAM的親和力比較采用ElISA的方法測定每一輪的ssDNA和ManLAM的親和力。具體方法如下用每一輪的dsDNA和生物素標記的引物2通過不對稱PCR擴增大量的ssDNA適配子，然后瓊脂糖凝膠電泳回收，測濃度后備用；用0. 8μ g的ManLAM包被ELISA板，4°C過夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS (PBST)洗6次；每孔加入含鮭魚精DNA (100 μ g/mL)的PBS 100 μ L進行封閉，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分別加入100 μ L含生物素標記的每一輪的生物素標記的ssDNA(40pmol)，37°C, Ih ；用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀釋的HR標記的鏈霉親和素 37°C，30min ；TMB 顯色。通過檢測，第12輪具有與ManLAM最高的親和力，將第12輪ssDNA進行PCR擴增，得到dsDNA產物，經DNA限制性內切酶EcoRI以及BamHI消化后連接于質粒pUC19載體(Yanisch-Perron，C.，1985)上，轉化大腸桿菌 DH5a (Hanahan，D.，1983)，通過氨芐青霉素進行抗性篩選，挑取單克隆，提取質粒后進行測序，得到SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列 (命名為ZXL1)。6、等溫滴定法測定ssDNA適配子與ManLAM的親和力
將測序得到的ssDNA適配子通過等溫滴定法測定與ManLAM的親和力，37°C時適配子與ManLAM相互作用的熱力學性質的測定在美國MicroCal公司生產的VP型等溫滴定量熱儀上進行。滴定實驗中，將ManLAM溶液裝入250 μ L的滴定注射器，適配子溶液放入1. 43ml 的樣品池，攪拌器以200r/min的速度攪拌，每間隔300s加入10 μ 1的ManLAM溶液到適配子溶液中，共滴25次。參比池中加入去離子水作為樣品池的熱平衡參照。另做一空白實驗以扣除ManLAM溶液稀釋熱的影響，即在樣品池中加入緩沖液，用ManLAM溶液滴定。ManLAM 溶液的稀釋熱經測定非常小，可略去。所有的溶液都在相應溫度條件下真空脫氣處理以減小信號噪音，積分每個峰面積并扣除稀釋熱后得到結合反應熱，對適配子與ManLAM的摩爾比作圖得到反應等溫線。以MicroCal公司提供的Origin 6. O軟件中的兩結合位點模型進行非線性最小方差擬合，可計算出二者作用的本征結合常數Ka。如圖2所示，以0rigin6. O軟件對ZXLl和ManLAM作用的稀釋熱進行雙位點模型非線性最小方差擬合，得到本征結合常數Ka。ZXLl與ManLAM結合常數為Ka: 5. 27X 105(士2. 9X lO^M—1，ZXLl該序列經替換、缺失和/或者插入一個或幾個核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1類似空間結構或同等功能的序列，如ZXL2(序列為:5，-ggccggatag cgacggggcc attccaagaa-3')，其與ZXLl具有類同等功能，具有與ManLAM的高親和力的結合常數(Ka 5. 03x104M_1)(如圖 2A)，而對照適配子 ZXL4 (序列為5，-CACGCCCAATAGTGGCTC CAGCTCATCTCT)與ManLAM幾乎沒有親和力(如圖2)。7、表面等離子共振技術(SPR)測定DNA適配子ZXLl與ManLAM的親和力大小將親和力最高的單鏈DNA適配子ZXLl通過表面等離子共振技術(SPR)測定與 ManLAM的親和力大小。該親和力測定在Biacore TlOO表面等離子共振儀上進行。實驗中， 將252Ru的適配子ZXLl固定在knsor Chip CM5芯片(購自Biacore AB)的Fc4通道上， Fc3通道加不同濃度的ManLAM (濃度分別為0、0. 5Χ1(Γ7Μ、1Χ1(Γ7Μ、2Χ1(Γ7Μ、4Χ1(ΓΜ)，進樣速度為30μ Ι/min，進樣時間為lmin。如圖3所示，將反應數據通過Biocore TlOO軟件進行擬合，得到適配子ZXLl與ManLAM結合的解離常數KD值為8. 907X10—1。實施例2適配子ZXLl與不同細菌的結合力大小檢測用生物素標記的下游引物(5’-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’)通過不對稱PCR 擴增獲得大量的生物素標記的ssDNA適配子，按照每孔IXlO5的不同細菌包被ELISA板，4°C 過夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS (PBST)洗6次；每孔加入含鮭魚精DNA(100 μ g/mL) 的PBS 100 μ L進行封閉，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分別加入100 μ L含生物素標記的每一輪的生物素標記的ssDNAGOpmol)，37°C，Ih;用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀釋的HR標記的鏈霉親和素37°C，30min ；TMB顯色。流式細胞術檢測適配子ZXLl與毒性結核分枝桿菌H37Rv、卡介苗以及恥垢分枝桿菌的結合力大小。首先通過熒光FAM標記的下游引物不對稱擴增大量FAM標記的適配子 ZXLl，取上述三種細菌，調整濃度至lX107ml，分別取100 μ 1細菌于EP管中，75%乙醇固定 15min后PBS洗3次，每管加入4 μ g帶有熒光標記的單適配子，混勻，于37°C孵育2小時。 PBS洗3次后上機檢測。激光共聚焦顯微鏡測定適配子ZXLl與毒性結核分枝桿菌H37Rv以及卡介苗BCG 的結合力。首先制備FAM標記的適配子ZXLl，取H37Rv及BCG兩種細菌調整濃度至IXlO4/ml，分別取1001均勻的涂布在包有多聚賴氨酸的載玻片上，自然晾干，PBS洗3次，將FAM 標記的適配子ZXLl均勻的滴在涂有細菌的載玻片上，于37°C孵育池后PBS洗3次上機檢測。結果如圖4所示，圖4A顯示，ZXLl與毒性結核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力， 與其它的分支桿菌及金黃色葡萄球菌等親和力很低；圖4B顯示，ZXLl與毒性結核分枝桿菌 H37Rv具有最高的親和力，而與卡介苗以及無毒的恥垢分支桿菌親和力很低。表明，本發明適配子具有良好的特異性。實施例3ZXL1在結核病診斷中的應用收集結核病人的血清(武漢市醫療救治中心，其中急性未經治療的結核病患者17 例，反復多次住院化療的結核病人18例，男性患者M例，女性患者11例，患者最小年齡為 11歲，最大年齡為57歲)及14例健康志愿者血清(武漢大學中南醫院檢驗科)。在酶標板孔中加入血清樣品包被，并加入通過生物素標記的適配子ZXL1，加入 HRP標記的鏈酶親和素，37°C孵育1小時；PBS洗三次后加入TMB進行顯色5分鐘；2M硫酸終止反應后酶標儀讀數；進行檢測，結果如5所示，與健康志愿者相比，結核病患者血清中 ManLAM抗體的0D450均明顯升高(p = 0. 0023)。結果證明ZXLl在結核病診斷中具有應用前景。實施例4適配子ZXLl對ManLAM所致的免疫抑制作用的影響流式細胞術檢測ZXLl對ManLAM作用的DC細胞成熟的影響。首先無菌分離新鮮的人外周血單個核細胞，使用CD14+的磁珠分選出CD14+的細胞，計數后于6孔細胞培養板中培養，隔日更換含有IL-4和GM-CSF的1640培養基，2天后加入ManLAM，7天后加入脂多糖(LPQ刺激成熟。實驗分組分別為培養基對照組、LPS刺激組、LPS+ManLAM組以及 LPS+ManLAM+ZXLl組。最后分別收集培養上清及每組細胞，將收集的細胞分別用熒光標記 ⑶80、⑶83以及⑶86抗體進行標記，流式檢測三種分子的表達水平。酶聯免疫吸附檢測法(ELISA法)檢測培養上清中IL-10以及IL-12的表達。如上，在培養的DC細胞中分別加H37Rv、BCG以及ManLAM，收集上清后，采用eBiosicence (San Diego, CA)的IL-10以及IL-12細胞因子檢測試劑盒，ELISA檢測IL-10和IL-12的表達水平。結果如6所示，單鏈DNA適配子ZXLl可以降低H37Rv導致的樹突狀細胞(DC)成熟的減少，同時增加IL-12的產生，降低IL-10的產生，說明該適配子能刺激細胞免疫。實施例5動物實驗用IO7CFU的H37R結核菌感染小鼠，小鼠分6組，每組6只，第一組小鼠感染后作磷酸緩沖液(PBQ處理，第二組小鼠感染后行鏈霉素治療，第三組為不相關適配子(ZXL4)對照組，第四組 第六組為不同劑量ZXLl治療組(分別為5 μ g、10 μ g、15 μ g)。感染后三天開始治療，每隔三天注射一次，共注射三次。所有小鼠均為尾靜脈注射，實驗前H37Rv均經過小鼠體內傳代，以保證足夠的毒力。動物實驗證明，篩選獲得的ssDNA適配子ZXLl可以明顯延長結核感染小鼠的生存率，脾臟指數較PBS對照組明顯減小，降低結核分枝桿菌感染后小鼠肺臟的荷菌量，明顯減輕感染小鼠肺臟及脾臟的病理變化。由此可見，本發明適配子可以制備成抗結核病的藥物， 用于防治結核菌感染所引起的疾病。
另外，本發明還對恒河猴進行了治療實驗，恒河猴結核感染模型前期實驗數據證實適配子ZXLl也具有一定的結核治療作用，與PBS對照組相比，適配子治療組恒河猴血沉、 急性反應蛋白、體重均未見明顯異常，肺部X線表現輕于PBS對照組；同時肺組織、外周淋巴結組織病理變化輕于PBS對照組，且與鏈霉素治療組無明顯差異。申請人:還進一步對由ZXLl所衍生的序列進行了上述實施例2 5的相關實驗，結果表明，這些衍生的也具有同等的功能。這些序列包括1)SEQ ID No. 5 所示的序列；2) SEQ ID No. 2 (n30 為 SEQ ID No. 1 及 5)所示的序列；3)上述2)的序列由SEQ ID No. 1所示序列向5’端延伸5個核苷酸所得到的序列；4)上述2)的序列由SEQ ID No. 5所示序列向3，端延伸10個核苷酸所得到的序列；5)上述2)的序列由SEQ ID No. 1所示序列向5’端延伸12個核苷酸向3’端延伸 8個核苷酸所得到的序列。
權利要求
1.一種拮抗結核分枝桿菌表面脂糖的核酸適配子，其核苷酸序列為1)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經替換、缺失和/或者插入一個或幾個核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1同等功能的序列；或，3)含有SEQID No. 1所示核苷酸序列為核心序列并兩邊延長的序列，如SEQ ID No. 2 由1)所述序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列，其中SEQ ID No. 2中的n30為1)所述的核心序列。
2.權利要求1所述核酸適配子在制備結核病診斷試劑中的應用。
3.含有權利要求1所述核酸適配子的診斷試劑。
4.權利要求1所示的核酸適配子在制備預防或治療結核病藥物中的應用。
5.一種抗結核病藥物，其含有權利要求1所述的核酸適配子。
6.制備權利要求1所述核酸適配子的方法，其采用1)人工合成；2)不對稱PCR；或，3)采用PCR法，在其中一個引物中引入生物素標記，PCR產物變性后用親和素分離。
全文摘要
本發明公開了一種拮抗結核分枝桿菌表面脂糖的核酸適配子及其用途。該適配子是針對毒性結核分枝桿菌表面脂糖ManLAM的并具有抗結核感染和增強細胞免疫功能的小分子單鏈DNA(ssDNA)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。該小分子單鏈DNA具有與傳統抗結核藥物不同的新靶點和新結構，具有直接封閉ManLAM的免疫抑制作用。該適配子制備簡單，價格低廉，確保了獲得的單鏈DNA適配子特異性的結合在毒性結核分枝桿菌表面，進一步提高了治療的靶向性。克服了傳統上結核治療出現中日益嚴重的耐藥問題和副作用大的問題，可作為一種有效的新型抗結核藥物或結核病診斷試劑。
文檔編號C12R1/32GK102373213SQ20111036198
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月16日 優先權日2011年11月16日
發明者潘勤, 王其龍, 章曉聯 申請人:章曉聯