專利名稱：建蘭開花整合基因-CeFT基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體涉及一種在建蘭中表達的開花整合基因-CeFT基因、含有該基因的重組植物表達載體，以及CeFT基因在縮短植物童期，促進植物提前開花中的應用
背景技術：
FT (FLOWERING LO⑶S T)基因是花期調控途徑中的關鍵基因。它位于花發育途徑中的匯集點，整合來自光周期途徑、春化途徑和自主途徑等不同花發育途徑的信號，在植物花發育中發揮著重要作用。擬南芥的FT基因屬于FT/TFL1基因家族，又稱為磷脂酰乙醇胺結合蛋白 (phosphatidyletha nolamine-binding protein,PEBP)基因家族，因其蛋白易與磷脂酰乙醇胺結合而得名。根據PEBP基因家族成員在擬南芥和水稻中的系統發生關系以及對開花時間的調控作用，將其分為3個亞家族(I)FT亞家族(FT-Iike)，包括FT基因、TSF基因， 起促進開花作用，TSF與FT功能部分冗余；(2) MFT亞家族(MFT-Iike)，包括MFT基因，在開花時間調控上與FT功能冗余；(3) TFLl亞家族(TFLl-Iike)，包括了 TFL1、BFT和ATC基因， 起開花抑制作用(Chardon and Damerv al，2005)。在植物PEBP基因家族中，FT和TFLl基因是研究最為清楚的兩個成員。FT為開花促進因子，TFLl為開花抑制因子，它們在決定開花時間的過程中起關鍵作用。FT蛋白和TFLl的晶體結構存在一定差異，這種差異導致它們成花過程中起相反功能。Hanzawa等000 研究表明替換一個氨基酸，即FT中的Tyr85 和TFLl中的His88，便能使FT與TFLl功能互換。這兩個基因通過抑制莖端分生組織形成花原基，來延長植株的營養生長過程，從而延遲植株的生殖生長進程。FT蛋白是成花素的主要組成部分，在不同的開花遺傳途徑中，上游關鍵基因調控FT基因，使FT蛋白從韌皮部移動到莖頂端分生組織(SAM)，與帶堿性亮氨酸拉鏈蛋白 (basic region-leucine zipper, b-ZIP)轉錄因子 FD (FLOWERING LOCUS D)在莖尖通過蛋白質的相互作用來促進成花轉變，并通過轉錄激活花分生組織特性基因API (APETALA1)來啟動花發育過程。在擬南芥中超表達以下植物的FT同源基因，均能顯著促進開花擬南芥(Abe et al.，2005)，楊樹(Hsu et al.，2006)，番茄(Lifschitz et al.，2006)，矮牽牛(Hayama et al.，2007)，葡萄(Carmona et al.，2007)，南瓜(Lin et al.，2007)以及水稻(Kojima et al·，2002)等。而在番茄(Lifschitz et al.，2006)，楊樹(Bohlenius et al. ,2006 ；Hsu et al.，2006)，小麥(Yan et al.，2006)，矮牽牛(Hayama et al. ,2007)等植物中異源表達FT或FT同源基因同樣也能引起早花現象。尤其是在木本植物楊樹中，野生型需要經過 8-20年才能開花，而超表達PtFTl的毛果楊在培養皿中培養四周后便可觀察到柔荑花序 (Bohlenius et al. ,2006) 反之，在擬南芥和水稻中，采用RNAi或miRNA手段使FT基因的表達下調后，植株的開花時間延遲(Kojima et al. ,2002 ；Komiya et al.，2008)。這些結果表明FT及其同源基因是植物開花所必需的。
FT不僅在成花轉變過程中起重要作用，而且還參與調節生長發育的一些過程。如調控擬南芥果莢和種子的發育過程，FT mRNA在子葉中表達量比較高，而在頂端分生組織表達量非常低。另外，在楊樹中，FT同源基因PtFTl表達水平還是秋季生長停滯和芽休眠的一個關鍵性決定因素，秋季短日照通過調控PtFTl的活性從而誘導不同緯度的林木群體生長停滯和芽休眠的啟動。建蘭(Cymbidiumensifolium)是蘭科(Orchidaceae)蘭屬(Cymbidium)中的小花型地生種，其花香馥郁，色澤淡雅，花姿秀美，葉態飄逸，備受歡迎，為我國傳統銘花之一， 具有很好的市場價值。建蘭的幼年期較長，約3年左右，生產成本高，因此如何花期調控縮短建蘭的童期，使其提早開花有很重要的理論意義和經濟意義。此外我國對花卉的傳統消費期主要集中在春節和其它重要節假日，要實現建蘭的產業化還要能夠應節上市，其商品價值才會更高。建蘭的花期通常在6-10月，一年可多次開花，但在春節、元旦等重要節日中卻不能開花，此外，建蘭的花期一般只有1個月，作為年宵花卉還需在花期和延長開花時間上進行調控。目前，在建蘭以及相關的國蘭的花期調控方面的研究比較少，潘瑞熾和葉慶生發現低溫可促進墨蘭和春蘭的花芽分化和發育，高溫(30/25°C和25/20°C )有利于建蘭花芽分化與發育。但有關建蘭的成花機理與相關基因克隆和功能研究還未見報道。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種在建蘭中表達的開花整合基因-CeFT基因及其編碼蛋白和含有該基因的重組植物表達載體。本發明的第二個目的是提供CeFT基因在縮短植物童期，促進植物提前開花中的應用，如縮短擬南芥童期，促進其提前開花。本發明以建蘭“金絲馬尾”(C. ensifolium ‘Jin Si Ma Wei，)的花芽為材料，提取其總RNA，再將mRNA逆轉錄成cDNA第一鏈，以該cDNA第一鏈模板，根據FT的同源基因設計引物，利用RT-PCR和RACE的方法擴增拼接獲得全長cDNA序列，該cDNA序列長度為77!3bp， 其序列如SEQ ID NO. 1所示，其開放閱讀框為自5，端第87位至第617位堿基，共531bp，將此開放閱讀框命名為CeFT基因，其編碼的蛋白的氨基酸序列具有176個氨基酸殘基，其序列如SEQ ID NO. 2所示，將該蛋白命名為CeFT蛋白。將建蘭的CeFT基因編碼的蛋白質序列用ClustalW2分析其同源性，結果顯示CeFT 蛋白具有FT類蛋白的兩個保守基序即14個保守氨基酸序列(LGRQTVYAPGWRQN)和LYN/1YN 三聯體，從第25到163個氨基酸中還含有一個保守的PEBP結構域，它與文心蘭OnFT的同源性為94%;與水稻Hd3a、擬南芥FT的氨基酸序列同源性分別為79%，74%，由此可見，CeFT 基因是一個新的開花整合基因FT基因。本發明人將上述CeFT基因與植物表達載體連接，通過農桿菌介導，將含有CeFT基因的重組植物表達載體轉化到擬南芥中，經篩選培養獲得含有CeFT基因的轉基因擬南芥。 通過實驗發現，該轉基因擬南芥與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥花期提前，10個轉化株的平均開花時間為22天，而野生型的平均開花時間為31天。由此表明，外源CeFT基因為具有功能的結構基因，其在宿主擬南芥中實現了超量表達，它縮短了轉基因擬南芥的開花時間。
從上述結果分析可以表明，本發明的CeFT基因是一個新的開花整合基因，該基因能縮短開花時間，從而影響植株的發育。因此可以將本發明的CeFT基因應用到縮短植物童期，促進植物開花中。本發明的 CeFT基因與植物表達載體連接，通過農桿菌介導進入植物細胞、組織或器官，通過組織培養成轉基因的植物轉化體，從而實現縮短植物童期生長期，促進植物開花。所述的植物表達載體可為任意一種可用于根瘤農桿菌或發根農桿菌轉化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如PBI系列載體、pBin系列載體、Gateway 系列載體、pCAMBIA系列載體或其它衍生植物表達載體等，上述載體均為公開銷售的商品。本發明首次從建蘭中克隆到FT同源基因-CeFT基因，并且通過實驗證明該基因能夠影響植物生長發育進程，縮短了童期，并促使植物提前開花。因此，本發明提供的建蘭 CeFT基因為基因工程改良植物的生長進程，對植物的花期進行調控提供了一種有效的技術手段，具有廣泛的應用前景和極大的經濟價值。
圖1是建蘭CeFT基因推導的氨基酸序列與文心蘭OnFT (EU583502)、水稻 Hd3a(BAB61028. 1)、擬南芥AtFT (BAA77838. 1)等同源基因的氨基酸序列比較圖(具有一致性和相似性的氨基酸分別用黑色和灰色陰影表示)；圖2是通過RT-PCR檢測在沒有發育花梗的成年建蘭植株的根、莖、葉和腋芽中的 CeFT基因表達量的電泳顯示圖，其中1為根；2為假鱗莖；3為葉；4為腋芽；圖3是通過RT-PCR檢測花梗長度達IOcm的成年植株的根、莖、葉、腋芽、花梗和花蕾中的CeFT基因表達量的電泳顯示圖，其中1為根；2為假鱗莖；3為葉；4為腋芽；5為花梗；6為花蕾；圖4是表達載體pBI121-3k_CeFT轉化農桿菌的PCR鑒定圖，其中M為Marker 2000，1-3為篩選到的陽性克隆編號、+為連接載體pBI121-35s-CeFT質粒陽性對照；-為空載體質粒PBI121陰性對照。圖5是轉基因(CeFT)擬南芥的PCR鑒定圖，其中M為Marker 2000、1-14為CeFT 轉基因擬南芥株系編號、+為連接載體pBI121-35S-CeFT質粒陽性對照；-為野生型擬南芥陰性對照。
具體實施例方式下面結合具體實施例進一步闡釋本發明。應理解，這些實施例僅以用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規方法進行。如J.薩姆布魯克等《分子克隆實驗指南》、F.奧斯伯等《精編分子生物學實驗指南》 中所述條件，或按照所用產品生產廠商的使用說明。實施例1 一、建蘭CeFT基因的克隆及其同源性分析。(1)以建蘭品種“金絲馬尾” (C. ensifolium ‘Jin Si Ma Wei，)的花芽為試驗材料，植物材料在溫室正常條件下生長(L/D，16h/8h ；25-28°C )。(2) RNA提取用Trizol reagent (購自hvitrogen公司)進行試驗材料的總RNA提取，整個操作過程嚴格按照Trizol試劑的RNA提取流程說明。(3)采用M-MLV反轉錄酶(購自ftOmgra公司)逆轉錄mRNA成cDNA第一鏈，方法按照試劑說明書進行。(4)基因的克隆以逆轉錄的建蘭花芽cDNA第一鏈為模板，利用引物FT-IF和 FT-IR進行PCR擴增，回收PCR產物，測序，獲得2(^bp的核心片段。引物FT-IF:5' -TAGGACGAGTGATTGGTGA-3 ‘FT-IR 5' -TCACTTGGACTTGGAGCAT-3‘采用Golden DNA polymerase (TIANGEN)進行PCR擴增，加樣體系參照酶的說明書，其PCR反應程序為94°C變性％iin，隨后進行35個循環反應(94°C 30s,51°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸 5min。利用該2(^bp的核心片段，根據RACE方法，設計擴增3’端序列的引物FT3A和 FT3B,以及擴增5，端序列的引物FT5A和FT5B，引物為FT3A 5' -TAGGACGAGTGATTGGTGA-3‘FT3B 5' -TTCAGCAGTAGTGGAGCAG-3‘FT5A 5' GGCTGCTCCACTACTGCTGAAGGCT 3‘FT5B 5' CAAGTACATCACCAATCACTCGTCC 3‘3，端序列 PCR 擴增反應程序為采用 Golden DNA polymerase (TIANGEN)進行 PCR 擴增，加樣體系參照酶的說明書，其PCR反應程序為94°C變性3min，隨后30個循環反應 (94°C 30s，53°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸 5min。5，端序列PCR擴增反應程序為采用Golden DNA polymerase (TIANGEN)進行 PCR擴增，加樣體系參照酶的說明書，其PCR反應程序為95°C變性lmin，接著5個循環反應 (94°C 30s,72°C ^iin)，再接著 5 個循環反應(94°C 30s, 70°C 30s, 72°C 1.5min)，最后 30 個循環反應(94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 1. 5min)，72°C延伸 lOmin，4°C終止反應。回收擴增產物，對5’端和3’端序列的擴增序列進行測序，最后與核心片段拼接獲得全長cDNA序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示，該序列長度為77!3bp，該序列的開放閱讀框為SEQ ID NO. 1的自5，端第87位至第617位堿基，共531bp，將該開放閱讀框命名為CeFT 基因，該基因編碼由176個氨基酸殘基組成的多肽，命名為CeFT蛋白，蛋白質的pI/Mw分別為6. 42/19848. 3。將建蘭CeFT基因編碼的氨基酸(CeFT蛋白)序列用ClustalW2分析其同源性，結果顯示CeFT蛋白包含區分FT和TFLl蛋白的關鍵氨基酸殘基Tyr(Y)，以及140 位的另一個決定性氨基酸殘基Gln (Q)，另外還具有FT類蛋白的兩個保守基序即14個保守氨基酸序列(LGRQTVYAPGWRQN)和LYN/IYN三聯體，還有一個保守的PEBP結構域，它與文心蘭OnFT的同源性最高，為94% ；與水稻Hd3a、擬南芥FT的氨基酸序列同源性分別為79%， 74%，具體比對見圖1。二、建蘭CeFT基因表達模式分析在建蘭未開花期和開花時期，用Trizol reagent (Invitrogen)分別提取建蘭植株的未開花期的根、假鱗莖、葉和腋芽以及開花期的根、假鱗莖、葉、腋芽、花梗和花蕾的總RNA,測定0D260后定量取出2 μ gRNA,然后再使用oligo-dT引物和PrimeScript Reverse Transcriptase (購自Takara公司)進行逆轉錄反應(方法參考說明書)， 以擴增 FT 核心片段的特異引物 FT-IF 5 ‘ -TAGGACGAGTGATTGGTGA-3 ‘，FT-IR 5 ‘ -TCACTTGGACTTGGAGCAT-3 ‘進行PCR擴增，該引物跨越內含子。采用Go 1 den DNA polymerase (TIANGEN)進行PCR擴增，加樣體系參照酶的說明書，其反應程序為94°C變性 ^iin,隨后進行32個循環反應(94°C 30s,54°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸5min。反應產物以1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳結果如圖2和3所示，其中對照為來自建蘭的ACTIN基因，擴增該對照的ACTIN基因的引物為ACTPF:5' -CCTCTCAATCCCAAGGCAAACA-3‘ ,ACTPR 5' -GACCTCGGGGCACCTAAATCTC-3‘，采用 Golden DNA polymerase (TIANGEN)進行 PCR 擴增，加樣體系參照酶的說明書，其反應程序為94°C變性％iin，隨后進行32個循環反應(94°C 30s,54°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸5min。從圖2和圖3中可以看出，CeFT基因在建蘭各器官中均有表達，營養生長階段，CeFT表達水平較低，生殖生長階段，表達水平較高。營養生長期CeFT基因在腋芽的表達量最高(圖2、；生殖生長期CeFT基因在花蕾的表達量最高， 在花梗、腋芽中的表達量次之，在根和葉中的表達量最低(圖3)。三、建蘭CeFT基因在擬南芥中的表達及轉基因植株的表型鑒定。(1)含目的基因CeFT表達載體的構建以前面逆轉錄得到的cDNA為模板，使用Takara公司的LA Taq酶進行擴增，反應體系按說明書，擴增引物為CeFT-F 5’ CCGTCTAGAATGAATAGAGAGAGAGACTCTTTG 3’CeFT-R 5’ CTTGAATTCTCAATCCTGCATCCTTCTTCCGCC 3’反應程序為94 °C 4min ； 94°C 30sec，60°C 45sec，72°C 2min, 35cycles ；72 °C 5min。將擴增得到的CeFT基因回收后，與Takara公司的pMD18_T載體連接，轉化進入大腸桿菌中。提取含有CeFT基因的T載體質粒，利用酶切位點)(ba I和EcoR I將CeFT基因從T載體上切下，與帶有3 啟動子和nos終止子的植物表達載體PBI121同樣用)(ba I和 EcoR I酶切后連接，連接酶用T4 DNALigase (購自Takara公司)，具體操作按說明書方法進行，構建表達載體pBI121-3k-CeFT。(2)將重組表達載體pBI121-35s-CeFT采用凍融法轉化到根瘤農桿菌GV3101中。>從_701中取出農桿菌感受態細胞，冰上解凍，加入5μ 1重組表達載體 pBI121-;35s-CeFT，輕輕混勻，冰浴 30min。>將此混合物轉移置研缽中，液氮速凍lmin，迅速轉入37°C金屬浴中，將其融化， 約 2-3min。>向混合物中加入Iml LB,于搖床200rpm培養2_4h。所述的LB液體培養基為本領域常用培養基，其配方參考J.薩姆布魯克等《分子克隆實驗指南》。>將轉化產物涂布于LB+Kan (卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的平板上，吹干，封口，放于培養箱培養48小時。>挑取單克隆進行菌落PCR鑒定，如圖4所示，以質粒pBI121-3k_CeFT為陽性(+) 對照，以空載體質粒PBI121為陰性(-)對照，1、2、3都是篩選到的含有目的基因(CeFT基因)的根瘤農桿菌GV3101克隆陽性克隆。(3)利用花序浸染法轉化擬南芥>挑取一個陽性克隆，接種于LB+Kan (卡那霉素)50mg/L+Genta 25mg/L的液體培養基中，28°C 200rpm振蕩培養24-36h,使OD600 = 0 . 8左右。>將菌液轉入無菌的50ml離心管中，5000rpm，15min離心收集菌種，再用同等體積的滲透培養基(1/2MS+0. 5g/L MES+5% Sucrose, pH5. 7)重懸農桿菌，并加入表面活性劑 Silwet，使其終濃度達到0.02% ΟΟΟμΙ/L)。所述的MS培養基是本領域常用培養基，其配方參考(Murashige T and Skoog F，1962)。>取剛開花的擬南芥植株(花苞)于此溶液中浸泡lmin。斜置晾干多余的菌液。>將浸染菌液的擬南芥花序蓋膜保濕，黑暗培養8小時左右，再揭膜置于光照下正常管理成熟收獲種子。(4)轉基因植株的分子鑒定。收集當代轉基因植株種子(Ttl代)，滅菌(10% NaClO IOmin,滅菌水漂洗6次) 后播種于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS固體培養基上篩選。將生長10天左右的綠色抗性植株轉栽到盆缽里，基質為泥炭土與蛭石比為3 1(體積比)。收集T1代種子。 將該種子種植于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS培養基上，統計分離比，選取符合3 存活1死亡分離比的轉基因株系植株移栽至缽里進行栽培，收集T2代種子，將該種子種植于含有Kan抗生素(50mg/L)的1/2MS培養基上，種子在培養基上全部為綠苗，T2代種子為純合系。以質粒pBI121-3k-CeFT為陽性(+)對照，以擬南芥野生型葉片DNA為陰性(_)對照，用35S啟動子序列及插入目的基因序列設計引物，進行PCR檢測單插入株系中目的基因的表達。引物序列如下35SFT-F 5 ‘ -TTGCGATAAAGGAAAGGC-3 ‘，35SFT-R 5' -ACGAAGACGAAGCGGTGT-3 ‘，鑒定結果如圖5所示，選取陽性植株，由此而獲得轉入 pBI121-35s-CeFT表達載體的轉基因擬南芥。(5)轉基因植株進行表型鑒定。將轉基因擬南芥T2代植株和野生型擬南芥同等條件下進行培養，與野生型擬南芥相比，轉基因擬南芥抽薹及開花時蓮座葉僅有4片葉，轉基因植株都比野生型煙草提前開花，同等培養條件下，野生型擬南芥需要31天開花，而轉入CeFT基因的轉基因擬南芥僅需要22天開花。根據結果表明，外源CeFT基因在宿主擬南芥中實現了超量表達，促進了轉基因提前開花。試驗結果表明，建蘭CeFT基因為有功能的基因，可以影響植株的發育，具有促進生殖生長，從而縮短開花時間的作用。由上述結果分析表明，本發明的CeFT基因是一個新的開花整合基因FT基因，該基因能促進植物的生殖生長，縮短開花時間，從而影響植株的發育。
權利要求
1.一種建蘭開花整合基因-CeFT基因，其特征在于，所述的CeFT基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1中的第87位至617位堿基所示。
2.一種由權利要求1所述的建蘭開花整合基因-CeFT基因編碼的蛋白質，其特征在于， 所述的蛋白質的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種含有權利要求1所述的CeFT基因的重組植物表達載體。
4.根據權利要求3所述的重組植物表達載體，其特征在于，所述的重組植物表達載體中的載體為PBI載體、pBin載體、Gateway 載體或pCAMBIA載體。
5.權利要求1所述的CeFT基因在縮短植物童期，促進植物提前開花中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的植物為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種建蘭開花整合基因CeFT及其應用。CeFT基因的序列如SEQ ID NO.1中的第87位至第617位堿基所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明首次從建蘭中克隆到FT同源基因-CeFT基因，并且通過實驗證明該基因能夠影響植物生長發育進程，縮短了童期，并促使植物提前開花。因此，本發明提供的建蘭CeFT基因為基因工程改良植物的生長進程，對植物的花期進行調控提供了一種有效的技術手段，具有廣泛的應用前景和極大的經濟價值。
文檔編號C12N15/29GK102382843SQ20111036200
公開日2012年3月21日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者吳坤林, 張建霞, 曾宋君, 段俊, 黃瑋婷 申請人:中國科學院華南植物園