鑒定長穗偃麥草E組染色體的RAPD-SCAR₈₃₉標記及其應用的制作方法

專利名稱：鑒定長穗偃麥草E組染色體的RAPD-SCAR₈₃₉標記及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于長穗偃麥草E組染色體鑒定的技術領域，涉及一種鑒定長穗偃麥草E 組染色體的RAPD-SCAR839標記及其應用。
背景技術：
小麥是世界上重要的糧食作物之一。在中國它是僅次于水稻的第二大農作物，小麥生產對國民經濟發展有著十分重要的戰略意義。由于小麥栽培品種單一化，使其遺傳基礎日益狹窄，抗源匱乏，極大地限制了其產量和品質的進一步改良。小麥的近緣物種中存在著大量的遺傳變異，是小麥改良可以利用的有益基因資源，將這些有益基因導入小麥一直是遺傳學家和育種學家經久不衰的研究課題。偃麥草屬是小麥的一個近緣種屬，它具有普通小麥缺少的許多優良性狀，如分蘗能力強，根系發達，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿力強，多花、大穗、多實，籽粒蛋白含量高以及優良的烘烤品質，抗多種病害能力強，對小麥條銹病、 葉銹病、桿銹病、白粉病、黃矮病、條紋花葉病及腥黑穗病高抗至免疫，是小麥遺傳育種的重要親本之一。長穗偃麥草(Agropyron elongatum)是小麥的一個重要近緣種，具有蛋白質含量高、抗多種真菌和病毒病害、耐旱、耐寒、大穗多花等優異性狀，是在小麥品種改良中應用最廣泛的野生種之一。在自然界，長穗偃麥草有二倍體、四倍體和十倍體3種倍性類型。其中二倍體長穗偃麥草(Thinopyrum elongatum) E組染色體是組成偃麥草屬(Elytrigia)多倍體物種的基本染色體組，攜帶有對小麥遺傳育種有益的基因，但對于四倍體和十倍體類型的染色體組構成，一直沒有一致的結論。通過遠緣雜交及染色體工程的方法從普通小麥野生近緣種屬轉移優良基因的方法已被實踐證明是一條卓有成效的途徑。目前，國外從長穗偃麥草中成功轉移了 Sr24 (3DL), Sr26 (6AL), Sr25 (7DL，7AL)，Lrl9, 等基因。國內從小麥與長穗偃麥草雜種后代中育成了小偃4號、5號、6號、小偃107等小麥品種。通過雜交和漸滲的方式是將外源染色體的優良性狀和優異基因導入小麥的一種有效的方法，但是，在重組的小麥中，源于小麥-長穗偃麥草雜交后代的外源E組染色質或染色體的檢測成為至關重要的問題，雖然通過農學上的重要特性以及生化分析已將有價值的基因繪圖在長穗偃麥草染色體上，但這些實驗的檢測手段是不穩定的，而且不適合進行重要的農學性狀的檢測。有一些遺傳學手段，如染色體分帶、原位雜交等技術，已經將其用于小麥遺傳背景下外源遺傳物質的檢測，但這些技術費時、費力，對技術的要求也很高，而且用這些實驗手段進行大規模的后代快速篩選依然存在一定的局限。所以，迫切要求開發一種可以在小麥遺傳背景下快速、準確、大規模的鑒定長穗偃麥草外源染色質或染色體的分子標記技術。隨著分子生物學的發展，DNA分子標記已經廣泛應用于小麥遺傳育種的研究，限制片段長度多態性(RFLP)是首次被使用的分子標記，在植物遺傳研究中獲得很大的應用價值，但是，RFLP技術需要大量純化的DNA，而且實驗本身費時，對技術要求也很高，它不適合進行育種系統的大規模的篩選，因此，育種學家已經開始進行普通PCR的研究，期望在小麥育種系統中找到一種更簡單的方式鑒定外源染色質，許多基于PCR的DNA分子標記技術已經被開發，如 RAPD，AFLP，EST，SSR等。在這些標記中，RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)技術相對簡單，而且它不需要知道有關序列方面的信息，同時在指紋圖譜和系統發生學研究領域的應用是高效的。但它的重復性和穩定性卻很差，如果將其轉化為SCAR標記， 其特異性和穩定性大幅度提高，可以更方便快捷地應用于異源染色體的檢測。

發明內容
本發明解決的問題在于提供一種鑒定長穗偃麥草E組染色體的RAPD-SCAR839標記及其應用，為快速、準確地鑒定小麥遺傳背景下的外源長穗偃麥草E組染色質或染色體奠定基石出。本發明是通過以下技術方案來實現一種鑒定長穗偃麥草E組染色體特異標記基因，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2或 SEQ. ID. NO. 5 所示。一種擴增SEQ. ID. NO. 2所示的標記的引物，其引物的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示。一種擴增SEQ. ID. NO. 5所示的標記的引物對，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 3、SEQ. ID. NO. 4 所示。SEQ. ID. NO. 5所示的序列作為SCAR標記應用于小麥遺傳背景下的長穗偃麥草2E 或3E染色體的鑒定或跟蹤檢測。所述的應用是基于長穗偃麥草2E或3E染色體體系培育小麥品種的分子標記輔助育種。所述的應用是以SEQ. ID. NO. 3、SEQ. ID. NO. 4所示的上、下游引物對待測基因組進行PCR擴增，然后根據擴增產物的電泳結果，對是否含有長穗偃麥草2E或3E染色體進行判定。所述的PCR擴增的擴增程序為94°C預變性5min ；94°C變性30s，M°C退火30s， 72°C延伸60s，30 35個循環；72°C延伸lOmin。若擴增產物的電泳結果當中含有839bp的目標片段，則待測基因組中含有長穗偃麥草2E或3E染色體；若擴增產物的電泳結果當中沒有839bp的目標片段，則待測基因組中沒有長穗偃麥草2E或3E染色體。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果1、本發明采用RAPD分子標記技術對“中國春”小麥、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草三種材料進行長穗偃麥草E組染色體的多態性的分析，篩選出長穗偃麥草E組染色體的RAPD特異片段，然后再將其轉換為穩定的SCAR標記；這樣的SCAR標記具有了長穗偃麥草E組染色體的特異性，提高了檢測的準確性，非常有利于小麥遺傳背景下的長穗偃麥草E組染色體的鑒定和跟蹤檢測。與現有的鑒定方法相比，利用該SCAR標記進行鑒定則無疑正確率要明顯提升，而且是十分方便、快捷的。2、本發明獲得的SCAR標記稱為SCAIi839，利用普通小麥“中國春”、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草材料進行了 SCAR標記驗證，在二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草中擴增出了 839bp的片段，而在普通小麥“中國春”、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系中沒有該產物，初步證明此標記可以用于長穗偃麥草E組染色體的檢測。進一步用該對SCAR引物對“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系與“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系的雜種F1代、F2代進行了分析，結果在全部F1代以及部分 F2代材料中擴增出了目的片段，進一步證明了此SCAR839標記可以用來檢測小麥背景下的長穗偃麥草E組染色體，為小麥背景中長穗偃麥草E組染色體的快速跟蹤檢測提供了新途徑。3、所用到的SCAR標記的檢測，使用的PCR反應體系，不需要特殊的PCR反應儀器和特殊的反應試劑，與其它普通PCR反應要求一樣；只需要在PCR擴增之后通過電泳檢測， 就可以根據電泳結果有無大小相同的目的條帶進行判定，操作簡單方便。4、本發明提供的長穗偃麥草E組染色體的標記，通過SCAR標記的檢測，為快速鑒定小麥遺傳背景下的長穗偃麥草E組外源染色質或染色體奠定了良好的基礎，同時也為分子標記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑。


圖1為RAPD引物LWlO在三種不同材料中的擴增結果，泳道1為普通小麥“中國春”，泳道2為二倍體長穗偃麥草，泳道3為四倍體長穗偃麥草(Marker :DL2000)；圖2為核苷酸序列SEQ. ID No. 2 (稱為LW10)，在NCBI中進行Blast搜索的結果；圖3為SCAR839標記在四種不同材料中的擴增結果，泳道1為“中國春”，泳道2為二倍體長穗偃麥草，泳道3為四倍體長穗偃麥草，泳道4為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系(Marker :DL2000)；圖4為SCAIi839分子標記在“中國春”-長穗偃麥草IE 7E 一套二體附加系中的定位結果，泳道1為“中國春”-長穗偃麥草IE 二體附加系，泳道2為“中國春”-長穗偃麥草2E 二體附加系，泳道3為“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系，泳道4為“中國春”-長穗偃麥草4E 二體附加系，泳道5為“中國春”“中國春”-長穗偃麥草5E 二體附加系，泳道 6為“中國春”-長穗偃麥草6E 二體附加系，泳道7為“中國春”-長穗偃麥草7E 二體附加系，泳道8為“中國春”，泳道9為二倍體長穗偃麥草，泳道10為四倍體長穗偃麥草，泳道11 為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系(Marker :DL2000)；圖5為SCAI^9標記在“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系與“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜種后代F”F2中的擴增結果，泳道1 9為“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系與“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系雜交獲得的F1代材料，泳道 10 19為F1代自交獲得的F2代材料，泳道20為普通小麥-“中國春”，泳道21為“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系，泳道22為二倍體長穗偃麥草，泳道23為四倍體長穗偃麥草(Marker :DL2000)。
具體實施例方式本發明提供一種鑒定長穗偃麥草E組染色體的RAPD-SCAR839標記及其應用，通過 RAPD-SCAR法篩選獲得特異性的RAPD片段，并轉換為穩定的SCAR標記，并對其擴增進行了檢測。下面結合具體的實施例對標記的制備、擴增和鑒定做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
所涉及的材料來源“中國春”小麥來源于哈爾濱師范大學分子細胞遺傳與遺傳育種重點實驗室， 2010年4月將材料種于哈爾濱師范大學分子細胞遺傳與遺傳育種重點試驗苗圃基地，2個月后提取DNA進行分子標記篩選試驗。二倍體長穗偃麥草來源于日本國家生物資源計劃小麥中心(http://Ww. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp) ,2010年1月將材料種于哈爾濱師范大學分子細胞遺傳與遺傳育種溫室，3個月后提取DNA，保存備用。四倍體長穗偃麥草來源于中國農科院，2010年1月將材料種于哈爾濱師范大學分子細胞遺傳與遺傳育種溫室，3個月后提取DNA，保存備用。“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系來源于日本國家生物資源計劃小麥中心 (http//www. shigen. nig. ac. jp/-wheat/komugi/top. jsp) ,2010 年 4 月將材料種于哈爾濱師范大學分子細胞遺傳與遺傳育種重點試驗苗圃基地，2個月后提取DNA進行分子標記篩選試驗。1、RAPD分子標記方法篩選特異性RAPD片段利用RAPD分子標記方法，在普通小麥“中國春”、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草中進行多態性的篩選，獲得特異性片段。1. 1采用CTAB法從新鮮的不同材料幼嫩葉片中分別提取基因組DNA，并檢測DNA 濃度及質量；1. 2RAPD 片段擴增PCR 反應體系=DNA 模板 30ng, 10 X PCR buffer 2· 0 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM) 1. 5 μ 1， RAPD 引物(10 μ Μ) 1 μ l,r Taq polymerase (5U/μ 1)0. 2 μ 1，滅菌超純水補足至 20 μ 1 ；PCR反應程序
94 0C5 m in94 0C30s λ36 0C45s I.45cycles72 0C60s J72 0CIOmin4°Cforever 在篩選的過程中，利用普通小麥“中國春”、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草三種材料對36條RAPD引物進行篩選，篩選的依據是在普通小麥“中國春”與二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草兩種材料中存在多態性，同時二倍體長穗偃麥草和四倍體長穗偃麥草兩種材料又有同樣大小的PCR產物，且PCR產物的片段大小要大于500bp，重復性好，穩定且PCR產物的條帶要清晰。從36條RAPD引物(由上海生工生物工程有限公司合成)中篩選出特異引物 LfflO (SEQ. ID. NO. 1 所示)。1. 3取擴增產物各5 μ 1，均在含有lmg/ml EB的1. 2%瓊脂糖中電泳檢測，在紫外
6成像系統(Gel Doc-2000, Bio-Rad, USA)下觀察并照相記錄結果。1. 4構建載體并轉化將瓊脂糖電泳產物回收并純化，然后將擴增的片段連接到pMDlS-Τ載體(明酶切位點為EcoR I，HindIII)，然后將連接后的載體轉染JM109感受態細胞，接種于含有氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB固體培養基平板上，0. IMIPTG 4 μ 1和20mg/ml的X_gal 40 μ 1誘導，37 °C培養箱過夜培養；挑取少量白斑菌落進行PCR擴增，同時將其在含有氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB 固體培養基平板上劃線，擴大培養，37°C培養過夜；1.5挑去擴大培養后的細菌，提取DNA，然后進行PCR擴增，所用引物為通用引物即 RV-M, M13-47 (Kang, 2005)，其擴增體系如下94°C預變性 5min ；94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 60s，;35 個循環；72°C延伸 IOmin01. 6將擴增的片段進行測序，其核苷酸序列如SEQ. ID. No. 2所示，在NCBI中將擴增的片段(稱為LW10)進行Blast搜索，利用Primer Premier 5. 0和DNAMAN 5. 0等軟件進行序列比對及分析，結果顯示，它與小麥染色體3B特異BAC庫中的1305個堿基具有84%的同源性，其分析結果如圖2所示，也可以將該片段稱為長穗偃麥草E組染色體特異片段。該片段是來源于長穗偃麥草E組染色體的特異片段，它可以篩選含有長穗偃麥草 E組染色體的后代，該片段要求在小麥遺傳背景下具有低同源性，其優勢在于，它可以更加有效、準確地篩選小麥遺傳背景下的含有長穗偃麥草E組染色體的后代，可以使后代篩選的過程更加簡便、易行、可靠。 2、將RAPD轉化為SCAR標記根據設計SCAR引物的要求(1)引物長度范圍18_2^ρ，通常是選擇20_2^ρ ；⑵ 退火溫度范圍50 60°C，最好在52 58°C ； (3) GC含量范圍40-55% ； (4)產物片段大小 400 800bp。利用Primer Premier 5. 0和DNAMAN 5. 0等軟件進行RAPD片段特異SCAR引物設計，設計結果如下2C-F839 :GACGCAACAATAACCCTC (SEQ. ID No. 3 所示)2C-R839 :GTTTGCTTGACTGGCTTG (SEQ. ID No. 4 所示)以該引物對進行PCR擴增的反應體系和反應程序分別為PCR 反應體系=DNA 模板 30ng, 10 X PCR buffer 2· 0 μ 1，dNTP Mix (2. 5mM) 1. 5 μ 1， 上游引物(10 μ Μ) 1 μ 1，下游引物(10μΜ)1μ l,r Taq polymerase (5U/μ 1) 0· 2 μ 1，滅菌超純水補足至20 μ 1 ；所述的PCR擴增的擴增程序為94°C預變性5min ；94°C變性30s，M°C退火30s， 72°C延伸60s，30 35個循環；72°C延伸lOmin。所述PCR擴增產物片段大小為839bp，所以將其命名為SCAIi839，具體的核苷酸序列如 SEQ. ID No. 5 所示。3、SCAR839分子標記驗證 3. 1長穗偃麥草特異SCARra分子標記 提取普通小麥“中國春”、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系、二倍體長穗偃麥草、四倍體長穗偃麥草材料的DNA，以其基因組為模板，采用2C-F839和2C-R839作為引物對擴增，再將其擴增產物進行凝膠電泳，進行了 SCAR標記驗證，具體的檢測結果如圖3所示在二倍體長穗偃麥草(泳道2~)、四倍體長穗偃麥草(泳道幻中擴增出了 839bp的片段，而在普通小麥“中國春”(泳道1)、“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系(泳道4) 中沒有該目的條帶，初步證明此標記可以用于長穗偃麥草E組染色體的檢測。3. 2長穗偃麥草特異SCAI^9分子標記定位利用“中國春”-長穗偃麥草IE 7E —套二體附加系對SCARra分子標記進行定位，分別以IE 7E 二體附加系的基因組為模板，采用2C-F839和2C-R839作為引物對擴增，再將其擴增產物進行凝膠電泳，進行了 SCAR標記定位，具體的檢測結果如圖4所示其中泳道 9為陽性對照，可以看到該標記定位于“中國春”-長穗偃麥草2E(泳道2)和3E(泳道3)的兩個同祖群的染色體上。3. 3長穗偃麥草特異SCAI^9分子標記應用進一步利用SCAR839分子標記對“中國春”-殺配子染色體2C 二體附加系與“中國春”-長穗偃麥草3E 二體附加系的雜種F1代、F2代進行了分析，電泳結果如圖5所示作為陰性對照的“中國春”沒有擴增出目的片段，陽性對照二倍體長穗偃麥草擴增出目的片段，在全部F1代(泳道1 9)以及部分F2代材料(泳道10 19)中擴增出了目的片段，該SCARra標記的檢測結果與材料基因組的特性相吻合，表現出檢測的特異性；進一步證明了此SCAR839標記可以用來檢測小麥背景下的長穗偃麥草E組染色體。因此該SCAR標記就可應用于小麥遺傳背景下的長穗偃麥草2E或3E染色體鑒定或跟蹤檢測以SEQ. ID. NO. 3、SEQ. ID. NO. 4所示的上、下游引物對待測基因組進行PCR擴增，然后根據擴增產物的電泳結果，對是否含有長穗偃麥草E組染色體進行判定若擴增產物的電泳結果當中含有839bp的目標片段，則待測基因組中含有長穗偃麥草E組染色體，而且為 2E或3E染色體；若擴增產物的電泳結果當中沒有839bp的目標片段，則待測基因組中沒有長穗偃麥草2E或3E染色體。該SCAR標記也為快速鑒定小麥遺傳背景下的長穗偃麥草2E或3E染色質或染色體奠定了良好的基礎，同時也為分子標記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑篩選標準即在普通小麥“中國春”背景下含有長穗偃麥草2E或3E染色質或染色體的后代。
權利要求
1.一種鑒定長穗偃麥草E組染色體的標記基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2 或 SEQ. ID. NO. 5 所示。
2.一種擴增SEQ. ID. NO. 2所示的標記的引物，其特征在于，其引物的核苷酸序列如 SEQ. ID. NO. 1 所示。
3.一種擴增SEQ. ID. NO. 5所示的標記的引物對，其特征在于，其上、下游引物的核苷酸序列分別如 SEQ. ID. NO. 3、SEQ. ID. NO. 4 所示。
4.SEQ. ID. NO. 5所示的序列作為SCAR標記應用于小麥遺傳背景下的長穗偃麥草2E或 3E染色體的鑒定或跟蹤檢測。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，應用于基于長穗偃麥草2E或3E染色體體系培育小麥品種的分子標記輔助育種。
6.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的鑒定或跟蹤檢測是以SEQ.ID. NO. 3、 SEQ. ID. NO. 4所示的上、下游引物對待測基因組進行PCR擴增，然后根據擴增產物的電泳結果，對是否含有長穗偃麥草2E或3E染色體進行判定。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的PCR擴增的程序為94°C預變性 5min ；94°C變性 30s, 54°C退火 30s, 72°C延伸 60s, 30 35 個循環；72°C延伸 IOmin0
8.如權利要求6所述的應用，其特征在于，若擴增產物的電泳結果當中含有839bp的目標片段，則待測基因組中含有長穗偃麥草2E或3E染色體；若擴增產物的電泳結果當中沒有 839bp的目標片段，則待測基因組中沒有長穗偃麥草2E或3E染色體。
全文摘要
本發明公開了一種鑒定長穗偃麥草E組染色體的RAPD-SCAR839標記及其應用，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.5所示。通過RAPD-SCAR法篩選獲得特異性的RAPD片段，并轉換為穩定的SCAR標記，并對其擴增進行了檢測。本發明提供的長穗偃麥草E組染色體的標記，通過SCAR標記的檢測，為快速鑒定小麥遺傳背景下的長穗偃麥草2E或3E染色質或染色體奠定了良好的基礎，同時也為分子標記輔助育種提供了十分方便快捷的途徑。
文檔編號C12N15/11GK102373291SQ20111040446
公開日2012年3月14日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者吳磊, 姜格格, 孫媛媛, 徐國輝, 王丹, 趙迪, 郭長虹 申請人:哈爾濱師范大學