專利名稱：一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶k的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白酶K的微生物發酵技術領域，尤其是涉及一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝。
背景技術：
蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，從林伯氏白色念球菌(Tritirachium album limber)的發酵液中純化得到。它切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質的一般降解。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩定，還具有降解天然蛋白質的能力，因而它的應用十分廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體DNA、蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。雖然蛋白酶K用途廣泛，但由于微生物發酵生產的單位產量較低，致使其生產成本高昂，故其應用受到了很大的限制。這就要求研究者在菌種的改良上下大力氣，選育得到高表達量的生產菌株，大大提高該酶的單位產量，從而節約生產成本，使其大規模的工業化生產成為可能。目前已有的菌種誘變技術多種多樣，采用較為先進的6°Go Y射線誘變并結合原生質體紫外誘變技術，能夠大幅度的提高該菌種的生物表達量，并在優化后的發酵條件下培養菌體，最終得到較為理想的蛋白酶K的單位產量。
發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種通過對菌體的改造使其在優化后的條件下高表達量的發酵生產蛋白酶K，并運用較為先進的蛋白分離純化技術將酶與發酵液分離，最終制成滿足市場需求的合格產品。使用本發明生產蛋白酶K可大幅度提高生物表達量，有效的降低生產成本，從而取得較好的市場收益的利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，包括以下步驟:(1)發酵生產用菌種的誘變選育:涉及的生產工藝中所使用的生產菌種為林伯氏白色念球菌(Tritirachium albumLimber7MUCL 15465)的突變株，編號為MU-112，該菌株是原始出發菌種經過6°Go Y射線誘變和原生質體紫外誘變選育后，產量有大幅度提高的一株突變株，其具體的誘變選育方案如下:往培養好的出發菌株斜面中注入無菌生理鹽水，刮下斜面孢子，置于盛有玻璃珠的三角瓶內，震蕩Ih使孢子打散，脫脂棉過濾，并適當稀釋得到濃度為IO8個/ml的單孢子懸液。取上述單孢子懸液于無菌試管中，采用一定劑量的6°Go Y射線輻射誘變。經過致死率實驗驗證得出的結果為:采用劑量為900Gy的Y射線得到的一株編號為頂-76的突變株產酶量最高，且傳代10次后酶活沒有下降。
以突變株IM-76為出發菌，進行原生質體紫外誘變。原生質體制備與再生的最佳條件為:將出發菌用液體種子培養基培養44h后離心得到菌體，加入高滲緩沖液溶解的蝸牛酶及纖維素酶，在32°C恒溫處理lh，離心，用高滲緩沖液洗滌得到原生質體懸液，在15w紫外燈下，于30cm處，照射3min，然后將處理過的菌液混入軟瓊脂再生培養基，傾倒至再生培養基平板上。原生質體紫外誘變的結果是篩選得到編號為IMU-112的突變株，其產酶量較之出發菌頂-76有較大的提高，且經過10次傳代試驗，產酶量沒有下降；(2)以經過改良的燕麥培養基為種子培養基，將斜面菌種接種至一級種子培養液中，搖瓶發酵培養40 44h后以7 10%的接種量接種至二級種子培養基中；(3) 二級種子培養液在通風攪拌式發酵罐中培養40 44h后以7 10%的接種量接種于特定的發酵培養基；(4)繼續在通風攪拌式發酵罐中進行發酵培養，于48 72h后結束發酵并收集發酵液；(5)將發酵液轉移至提取儲罐中，過濾除菌體并收集濾出液；(6)往濾出液中添加25%飽和度的硫酸銨進行沉淀，該過程要不斷攪拌，待硫酸銨全部加完后，測定混懸液的PH值，并用0.1N的HCl溶液調節pH值至5.0，4°C離心并收集上清液；(7)往上清液中繼續添加硫酸銨至飽和度為60%，4°C離心得沉淀；(8)將沉淀溶于層析緩沖液中，不斷攪拌使沉淀全部溶解，過濾清液；(9)以市售的CM-Sep harose Fast Flow凝膠為離子交換層析介質,進一步分離純化蛋白酶K，將層析介質裝柱后，用層析緩沖液進行平衡，平衡后將沉淀溶解過濾清液上樣，流速控制在線速度25-50cm/hr，上樣完畢，用上述緩沖液沖柱，沖至流出液的OD28tol小于0.1，換用洗脫液洗脫，流速控制在線速度25-50cm/hr，收集洗脫峰；(10)采用超濾膜系統對洗脫峰進行濃縮脫鹽，將濃縮脫鹽液用0.22um濾膜過濾除囷；(11)采用冷凍干燥技術，將過濾除菌液直接冷凍干燥，得到固體白色粉狀成品蛋白酶K。所述的經過改良的燕麥培養基的成份為:燕麥粉12.0g/L，酪蛋白胨3g/L，甘氨酸0.05g/L，乳酸0.2ml/L,加水至I升。利用一級種子培養液進行培養時采用以下步驟:斜面挑取I 2環菌體，在裝液量10 20% (v/v)，培養液pH 5.0 6.0，搖床轉速180 220rev/min，培養溫度22 28°C的條件下培養40 44h。利用二級種子培養液進行培養時采用以下步驟:以7 10%的接種量將一級種子液接種至二級種子培養基中，在IOL通風攪拌式發酵罐中培養，培養條件為控制pH為
5.0 6.0，溫度為22 28°C，通氣量1.2vvm，攪拌轉速250 500rev/min，培養至40 44h時接種發酵培養基。所述的發酵培養基的配方組成為:葡萄糖10 15g/L,酪蛋白胨10 15g/L,MgSO4.7H20 0.2g/L，Na2HPO4 2 3g/L 及 K2HPO4 0.1 0.2g/L，另加入 IOml 一定組成的營養鹽溶液，加水至I升，工藝條件為:以5% 8%的接種量將二級種子液接種至發酵培養基中，并控制發酵pH為5.0 6.0，溫度為22 28°C，通氣量l.0vvm，攪拌轉速250 500rev/min,發酵48 72h收獲發酵液，營養鹽溶液組成為:0.005mol/LFeS04,0.0Olmol/LMnSO4,0.0015mol/L ZnCl2,0.002mol/L CaCl20發酵液用機電一體化箱式板框過濾設備進行過濾除菌體，所得濾液用試劑級硫酸銨進行分級鹽析。所述的層析緩沖液為:0.05M NH4AC pH6.0 ;所述的洗脫液為0.05MNH4ACpH6.0+0.5M NaCl pH6.0。所述的超濾膜系統中采用的超濾膜的截留分子量為10，000。冷凍干燥采用的冷凍溫度為-40°C以下。步驟(1)中所述軟瓊脂再生培養基的成分與再生培養基相同，但瓊脂添加量不同，為7g/Lo步驟(4)中所述發酵液用機電一體化箱式板框過濾設備進行過濾除菌體，所得濾液用試劑級硫酸銨進行分級鹽析。步驟(5)所述層析緩沖液為:0.05M NH4AC pH6.0,洗脫液為0.05MNH4ACpH6.0+0.5M NaCl pH6.0.
步驟(6)中所述超濾膜的截流分子量為10000 ；步驟(7)中所述真空冷凍干燥工序中酶液的冷凍溫度為-40°C以下。步驟⑴、⑵、(3)、(4)、中所涉及的蛋白酶k的測定參照以下方法所述進行:試劑:(a) 0.05N HCl:精密吸取0.82ml濃HCl用純化水稀釋至200ml ；(b) 0.5N NaOH:稱取 4.0g NaOH 溶于 200ml 純化水中；(c)底物溶液:稱取2.0g血紅蛋白溶于35ml純化水中，加入36.0g尿素和16ml0.5M NaOH,室溫攪拌30 60分鐘，再加入0.618g硼酸，攪拌溶解，用5N HCl調節pH至
7.5，用純化水定容至IOOml ；(d)酪氨酸對照品溶液(2.5mmol/L):稱取 45.3mg 溶于 IOOml 0.05MHC1 中；(e)0.3M三氯乙酸溶液:稱取9.8g三氯乙酸溶于200ml純化水中。(f)福林試劑:加IOml福林酚試劑到20ml純化水中。待測酶液:稱取1Omg待測樣品溶于Iml純化水中，臨用前適當稀釋為一定濃度(若待測樣品為發酵液，則直接將發酵液稀釋適當倍數即可)。測定方法:取三只試管分別標明空白、酪氨酸對照品和待測樣品，分別加入2.5ml底物溶液，置于37°C水浴預熱5分鐘，然后分別在對照品管中加入02ml酪氨酸，在待測品管中加入0.2ml待測酶液，在空白管中加入0.2ml 0.05M HCl,并分別計時，37°C水浴應lOmin，加入5.0ml三氯乙酸溶液終止反應，然后加入0.2ml待測酶液至空白管和對照品管中，加如
0.2ml 0.05M HCl至待測酶液管中，混勻后室溫放置lOmin，濾紙過濾后分別吸取1.0ml濾液，2.0ml 0.5N NaOH和0.6ml福林試劑，充分混勻后，放置15分鐘，在578nm處測定吸光度。計算:
0.5 μ mol酪氨酸樣品A578—空白A578
單位/毫克=--X - X稀釋倍數
0.2ml XI Omin對照品 A578與現有技術相比，本發明的技術方法，通過小試、中試，已建立起一套成熟的生產工藝，可以用于規模化生產，最后制得的產品符合國際通用標準，滿足市場需求。具體的產品質量標準可以達到:
質量標準參數
純度^ 98.0%
干燥失重 S 1.0%
重金屬彡2ppm
活性單位> 35U/mg
比活40U/mg蛋白，17.5U/mg干粉
相對分子質量29,730`本發明的有益效果在于:首先，6°Go Y射線誘變選育得到的高產能菌株遺傳特性穩定，經過30次以上的傳代培養，產酶能力未見下降，這對于大生產來說意義重大，能夠較好的控制產品的生產過程，保證產能。其次,采用CM-Sepharose Fast Flow凝膠為離子交換層析介質進行蛋白酶K的分離純化能有效的將目的蛋白與雜蛋白進行分離，從而大大提聞了廣品的純度。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例1采用經過6°Go Y射線誘變和原生質體紫外誘變選育得到的突變株IMU-112為出發菌，將斜面保藏的該菌用接種環挑取2環至裝有200ml —級種子培養基的IOOOml三角瓶中，共接種3瓶。調節培養基pH為5.5，搖床轉速180rev/min，在28 °C下培養44h后，以8 %的接種量接種至裝有6升二級種子培養基的IOL發酵罐中，在培養過程中，控制pH為5.5，溫度為28°C，通氣量為1.2vvm,攪拌轉速350rev/min，連續培養44h，然后以7.5%的接種量接種至裝液量為80L的100L發酵罐內，并控制發酵pH為5.5，溫度為28°C，通氣量1.0vvm,攪拌轉速350rev/min發酵64h收獲發酵液。一級、二級種子培養基的成分配比為:燕麥粉
12.0g/L,酪蛋白胨3g/L，甘氨酸0.05g/L,乳酸0.2ml/L,調pH為5.5，加水至I升。發酵培養基的成分配比為:葡萄糖12g/L，酪蛋白胨12g/L，MgS04.7Η20 0.2g/L,Na2HPO4 2.2g/L及K2HPO4 0.15g/L，另加入IOml —定組成的營養鹽溶液，調pH為5.5，加水至I升。發酵液的單位酶活為11.2u/ml。將收獲的發酵液用機電一體化箱式板框過濾設備過濾除去發酵液中大量的菌體，所得澄清濾液約為72.4升，往濾液中添加試劑級硫酸銨，至飽和度為25%，4°C靜置過夜，用大型冷凍式離心機離心并去除沉淀，得到濾液54.8升，再繼續往上清液中添加硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置12h后，離心得到沉淀0.53公斤，將沉淀用5倍層析緩沖液攪拌溶解后，過濾得清液2.8L。將ILCM-S印harose Fast Flow離子交換層析介質裝柱，用3L0.05M NH4AC pH6.0層析緩沖液進行平衡，平衡至柱流出液pH及電導率值與層析緩沖液一致后，調節上述沉淀溶解過濾清液至PH6.1-6.2，電導率略低于層析緩沖液電導率值(略低0.2-0.3 X IO4 μ s/cm)后上樣，上樣完畢，用3L層析緩沖液洗柱，洗至流出液OD28tlnm 小于 0.1，換用 0.05M NH4AC pH6.0+0.5M NaCl pH6.0 洗脫液洗脫，收集洗脫峰 1.8L。用截留；分子量10000的超濾膜洗脫進行濃縮脫鹽，得濃縮脫鹽液1.5L。經濃縮脫鹽液用
0.22 μ m的濾膜過濾除菌，除菌液采用真空冷凍干燥技術直接冷凍干燥，最終得到23.6g蛋白酶K的固體粉末，并測得其酶活為> 30u/mg，完全符合市場需求。實施例2采用經過6°Go Y射線誘變和原生質體紫外誘變選育得到的突變株IMU-112為出發菌，將斜面保藏的該菌用接種環挑取2環至裝有150ml —級種子培養基的IOOOml三角瓶中，共接種4瓶。調節培養基pH為5.8，搖床轉速190rev/min，在26°C下培養40h后，以10%的接種量接種至裝有5升二級種子培養基的IOL發酵罐中，在培養過程中，控制pH為5.8，溫度為26°C，通氣量為1.2vvm，攪拌轉速280rev/min，連續培養40h，然后以6%的接種量接種至裝液量為85L的100L發酵罐內，并控制發酵pH為5.8，溫度為26°C，通氣量1.0vvm，攪拌轉速400rev/min發酵72h收獲發酵液。一級、二級種子培養基的成分配比為:燕麥粉
12.0g/L,酪蛋白胨3g/L，甘氨酸0.05g/L,乳酸0.2ml/L,調pH為5.8，加水至I升。發酵培養基的成分配比為:葡萄糖 1 2.5g/L，酪蛋白胨 12.5g/L，MgS04*7H20 0.2g/L，Na2HPO4 2.5g/L及K2HPO4 0.2g/L，另加入IOml —定組成的營養鹽溶液，調pH為5.8，加水至I升。發酵液的單位酶活為10.3u/ml。將收獲的發酵液用機電一體化箱式板框過濾設備過濾除去發酵液中大量的菌體，所得澄清濾液約為76.4升，往濾液中添加試劑級硫酸銨，至飽和度為25%，4°C靜置過夜，用大型冷凍式離心機離心并去除沉淀，得到濾液58.8升，再繼續往上清液中添加硫酸銨至飽和度為60%，4°C靜置12h后，離心得到沉淀0.48公斤，將沉淀用5倍層析緩沖液攪拌溶解后，過濾得清液2.6L。將ILCM-S印harose Fast Flow離子交換層析介質裝柱，用3L0.05M NH4AC pH6.0層析緩沖液進行平衡，平衡至柱流出液pH及電導率值與層析緩沖液一致后，調節上述沉淀溶解過濾清液至PH6.1-6.2，電導率略低于層析緩沖液電導率值(略低0.2-0.3 X IO4 μ s/cm)后上樣，上樣完畢，用3L層析緩沖液洗柱，洗至流出液OD28tlnm 小于 0.1，換用 0.05M NH4AC pH6.0+0.5M NaCl pH6.0 洗脫液洗脫，收集洗脫峰 1.7L。用截留；分子量10000的超濾膜洗脫進行濃縮脫鹽，得濃縮脫鹽液1.45L。經濃縮脫鹽液用
0.22 μ m的濾膜過濾除菌，除菌液采用真空冷凍干燥技術直接冷凍干燥，最終得到23.1g蛋白酶K的固體粉末，并測得其酶活為> 30u/mg，完全符合市場需求。
權利要求
1.一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟: (1)以林伯氏白色念球菌(Tritirachiumalbum Limber)為出發菌株,經過6°Go Y射線誘變和原生質體紫外誘變選育； (2)以經過改良的燕麥培養基為種子培養基，將斜面菌種接種至一級種子培養液中，搖瓶發酵培養40 44h后以7 10%的接種量接種至二級種子培養基中； (3)二級種子培養液在通風攪拌式發酵罐中培養40 44h后以7 10%的接種量接種于特定的發酵培養基； (4)繼續在通風攪拌式發酵罐中進行發酵培養，于48 72h后結束發酵并收集發酵液； (5)將發酵液轉移至提取儲罐中，過濾除菌體并收集濾出液； (6)往濾出液中添加25%飽和度的硫酸銨進行沉淀，該過程要不斷攪拌，待硫酸銨全部加完后，測定混懸液的PH值，并用0.1N的HCl溶液調節pH值至5.0，4°C離心并收集上清液； (7)往上清液中繼續添加硫酸銨至飽和度為60%，4°C離心得沉淀； (8)將沉淀溶于層析緩沖液中，不斷攪拌使沉淀全部溶解，過濾清液； (9)以市售的CM-SepharoseFast Flow凝膠為離子交換層析介質,進一步分離純化蛋白酶K，將層析介質裝柱后，用層析緩沖液進行平衡，平衡后將沉淀溶解過濾清液上樣，流速控制在線速度25-50cm/hr，上樣完畢，用上述緩沖液沖柱，沖至流出液的OD28tol小于0.1，換用洗脫液洗脫，流速控制在 線速度25-50cm/hr，收集洗脫峰； (10)采用超濾膜系統對洗脫峰進行濃縮脫鹽，將濃縮脫鹽液用0.22um濾膜過濾除菌； (11)采用冷凍干燥技術，將過濾除菌液直接冷凍干燥，得到固體白色粉狀成品蛋白酶K0
2.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，所述的6°Go Y射線誘變方法為:采用劑量為900Gy的Y射線照射3min，所述的原生質體紫外誘變為:將出發菌用液體種子培養基培養44h后離心得到菌體，加入高滲緩沖液溶解的蝸牛酶及纖維素酶，在32°C恒溫處理lh，離心，用高滲緩沖液洗滌得到原生質體懸液，在15w紫外燈下，于30cm處，照射3min，然后將處理過的菌液混入軟瓊脂再生培養基，傾倒至再生培養基平板上。
3.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，所述的經過改良的燕麥培養基的成份為:燕麥粉12.0g/L，酪蛋白胨3g/L，甘氨酸0.05g/L，乳酸0.2ml/L,加水至I升。
4.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，利用一級種子培養液進行培養時采用以下步驟:斜面挑取I 2環菌體，在裝液量10 20% (v/v)，培養液pH 5.0 6.0，搖床轉速180 220rev/min，培養溫度22 28°C的條件下培養40 44h。
5.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，利用二級種子培養液進行培養時采用以下步驟:以7 10%的接種量將一級種子液接種至二級種子培養基中，在IOL通風攪拌式發酵罐中培養，培養條件為控制pH為5.0 6.0，溫度為22 28°C，通氣量1.2vvm,攪拌轉速250 500rev/min，培養至40 44h時接種發酵培養基。
6.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，所述的發酵培養基的配方組成為:葡萄糖10 15g/L，酪蛋白胨10 15g/L，MgSO4.7H20 0.2g/L，Na2HPO4 2 3g/L 及 K2HPO4 0.1 0.2g/L，另加入 IOml 一定組成的營養鹽溶液，加水至I升，工藝條件為:以5% 8%的接種量將二級種子液接種至發酵培養基中，并控制發酵pH為5.0 6.0，溫度為22 28V，通氣量1.0vvm,攪拌轉速250 500rev/min,發酵48 72h收獲發酵液，營養鹽溶液組成為:0.005mol/L FeSO4,0.0Olmol/L MnSO4,0.0015mol/L ZnCl2,0.002mol/L CaCl20
7.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，發酵液用機電一體化箱式板框過濾設備進行過濾除菌體，所得濾液用試劑級硫酸銨進行分級鹽析。
8.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，所述的層析緩沖液為:0.05M NH4AC pH6.0 ;所述的洗脫液為0.05M NH4ACρΗ6.0+0.5Μ NaCl ρΗ6.0。
9.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，所述的超濾膜系統中采用的超濾膜的截留分子量為10，000。
10.根據權利要求1所述的一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，其特征在于，冷凍干燥采用的冷凍溫度為-40°C以下。
全文摘要
本發明涉及一種利用真菌微生物發酵生產蛋白酶K的生產工藝，以林伯氏白色念球菌(Tritirachium album Limber)為出發菌株，經60Goγ射線誘變及原生質體紫外誘變后，采用特定的培養基，經液態深層發酵生產蛋白酶K。在培養溫度為22～28℃，發酵液pH值維持在5.5～6.0范圍內，發酵罐攪拌轉速為250～500rev/min的培養條件下，蛋白酶K的產量有大幅度提高，適用于工業化生產。與現有技術相比，本發明填補了國內在蛋白酶K生產工藝上的空白，大幅度提高了生物表達量，同時降低了生產成本，從而極大地提高了產品的市場競爭力。
文檔編號C12N9/58GK103173428SQ20111043633
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者林克, 葉昀, 楊曉輝, 王洪森 申請人:上海林葉生物科技有限公司