蛋白酶缺陷絲狀真菌細胞及其使用方法

蛋白酶缺陷絲狀真菌細胞及其使用方法
【專利摘要】本公開涉及可用于在絲狀真菌細胞，特別是包含三種具有降低的活性的內源蛋白酶和編碼異源多肽的重組多核苷酸的絲狀真菌細胞，中產生異源蛋白的組合物和方法，其中所述多肽以比其中所述蛋白酶不具有降低的活性的對應親本絲狀真菌細胞中該多肽的產生水平高至少兩倍的水平產生。
【專利說明】蛋白酶缺陷絲狀真菌細胞及其使用方法 發明領域
[0001] 本公開涉及可用于在絲狀真菌細胞中產生異源蛋白質的組合物和方法。

【背景技術】
[0002] 真核生物蛋白質（特別是治療性蛋白質如免疫球蛋白）的翻譯后修飾通常是 正確的蛋白質折疊和功能必需的。因為標準的原核表達系統缺乏這類修飾所需的適當 機制，必須使用替代的表達系統來產生這些治療性蛋白質。即使在真核蛋白質不具有翻 譯后修飾的情況中，原核表達系統還通常缺乏正確折疊所需的必要的伴侶蛋白。酵母和 真菌對于表達蛋白質是有吸引力的選項，因為它們可以容易地在簡單培養基中大規模生 長，這允許低的生產成本，且酵母和真菌具有執行與在哺乳動物細胞中發現的相似功能 的翻譯后機制和伴侶蛋白。此外，操作酵母和真菌細胞的相對簡單的遺傳構成以及更復 雜的真核細胞如哺乳動物或昆蟲細胞的工具是可用的（De Pourcq等，Appl Microbiol Biotechnol，87(5) :1617-31)。盡管存在這些優點，許多治療性蛋白質仍然在哺乳動物中產 生，其產生具有與天然人蛋白質最相似的翻譯后修飾的治療性蛋白質，而由酵母和真菌天 然產生的翻譯后修飾通常與哺乳動物中發現的不同。
[0003] 為解決這種不足，開發了產生與天然人蛋白質中發現的翻譯后修飾更相似的翻譯 后修飾新的酵母和真菌菌株。因此，存在著使用酵母和真菌細胞表達更復雜的蛋白質的新 興趣。但是，由于工業上長時間內集中于哺乳動物細胞培養技術，真菌細胞表達系統如木霉 屬未如哺乳動物細胞培養一樣良好建立且因此在表達哺乳動物蛋白質時存在缺陷。
[0004] 因此，在本領域中仍需要可以穩定地產生異源蛋白質如免疫球蛋白的改進的絲狀 真菌細胞如木霉屬真菌細胞，優選以高表達水平產生。
[0005] 發明概述
[0006] 本文描述的是包括具有降低的或沒有可檢測的至少三種蛋白酶的活性且具有編 碼以提高的水平產生的異源多肽的重組多核苷酸的絲狀真菌細胞如木霉屬真菌細胞的組 合物。本文進一步描述的是提高異源多肽穩定性的方法和制備其中蛋白酶不具有降低的活 性的異源多肽的方法。
[0007] 因此，一個方面包括具有降低的或沒有可檢測的至少三種蛋白酶的活性的絲狀真 菌細胞，其中該細胞進一步包含編碼異源多肽的重組多核苷酸，該異源多肽以比其中所述 蛋白酶不具有降低的活性的對應親本絲狀真菌細胞中該多肽的產生水平高至少兩倍的水 平產生。在某些實施方式中，當所述細胞是曲霉屬細胞時，總蛋白酶活性降低到其中所述蛋 白酶不具有降低的活性的對應親本曲霉屬細胞的總蛋白酶活性的50%或更低。在其它實施 方式中，絲狀真菌細胞的總蛋白酶活性降低到其中所述蛋白酶不具有降低的活性的對應親 本絲狀真菌細胞的總蛋白酶活性的49 %或更低，31 %或更低。
[0008] 在某些實施方式中，至少三種蛋白酶的表達水平被降低或消除。在某些實施方式 中，編碼三種蛋白酶的基因各自包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變。在可以與前述實 施方式組合的某些實施方式中，三種蛋白酶編碼基因是P印l、tspl和slpl。在其它實施方 式中，三種蛋白酶編碼基因是gapl、slpl和pepl。
[0009] 在某些實施方式中，真菌細胞的四種內源蛋白酶具有降低的或沒有可檢測的活 性；編碼該四種蛋白酶的基因各自包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變。在可以與前述 實施方式組合的某些實施方式中，四種蛋白酶編碼基因是pepl、tspl、slpl和gapl。
[0010] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，三種或四種蛋白酶編碼基因選 自 pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pepll、pepl2、tspl、slpl、slp2、slp3、slp7、gapl 和gap2。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，三種或四種蛋白酶編碼基因選自 pepl、pep3、pep4、tspl、slpl、slp2、gapl和gap2。在某些實施方式中，三種或四種蛋白酶 編碼基因選自 pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、gapl、gap2、slpl、slp2 和 tspl。 toon] 在某些實施方式中，真菌細胞的五種內源蛋白酶具有降低的或沒有可檢測的活 性；編碼該五種蛋白酶的基因各自包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變。在可以與前述 實施方式組合的某些實施方式中，五種蛋白酶編碼基因是pepl、tspl、slpl、gapl和pep4。 在其它實施方式中，五種蛋白酶編碼基因是pep 1、tspl、slpl、gapl和gap2。
[0012] 在某些實施方式中，真菌細胞的六種內源蛋白酶具有降低的或沒有可檢測的活 性；編碼該六種蛋白酶的基因各自包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變。在某些實施方 式中，所述細胞具有六種蛋白酶編碼基因，其各包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變，且 六種蛋白酶編碼基因是pepl、tspl、slpl、gapl、gap2和pep4。
[0013] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞具有三到六種具有降低 的或沒有可檢測的活性的蛋白酶，該三到六種蛋白酶各選自pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、 tspl、slpl、slp2、slp3、gapl 和 gap2〇
[0014] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，細胞具有七種蛋白酶編碼基因， 其各包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變，且七種蛋白酶編碼基因是P印1、tspl、slpl、 gap1、gap2、pep4 和 pep3 〇
[0015] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，細胞具有八種蛋白酶編碼基因， 其各包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變，且八種蛋白酶編碼基因是Ρ印1、tspl、slpl、 gapl、gap2、pep4、pep3 和 pep5〇
[0016] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞具有活性降低的另外的 蛋白酶，編碼另外的蛋白酶的基因包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變，且另外的蛋白 酶選自 pep7、pep8、pepll、pepl2、tppl、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7 和 slp8。
[0017] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，異源多肽是哺乳動物多肽。在某 些實施方式中，哺乳動物多肽是糖基化的。
[0018] 在某些實施方式中，哺乳動物多肽選自免疫球蛋白、抗體及其抗原結合片段、生長 因子、干擾素、細胞因子和白介素。在某些實施方式中，哺乳動物多肽是免疫球蛋白或抗體。 在某些實施方式中，哺乳動物多肽選自胰島素樣生長因子1(IGF1)、人生長激素（hGH)和干 擾素 ct 2b (IFN a 2b)。
[0019] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，異源多肽是非哺乳動物多肽。 在某些實施方式中，非哺乳動物多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維 素酶、殼多糖酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖 淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶 (pectinolytic enzyme)、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核 糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。
[0020] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞進一步包含ALG3 (甘露 糖基轉移酶）的降低的活性或沒有可檢測的活性。在某些實施方式中，編碼ALG3的基因包 含降低或消除相應活性的突變。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞 進一步包含編碼α -1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。
[0021] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞具有降低希望活性降低 的蛋白酶的表達的突變。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，突變是編碼蛋白 酶的基因內的缺失。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，突變是編碼蛋白酶的 催化結構域的基因部分的缺失。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞 具有編碼蛋白酶的催化結構域的基因部分中的點突變。
[0022] 在其它實施方式中，一種或多種蛋白酶的蛋白酶活性的降低或消除由對于選自 pep-型蛋白酶、胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶、gap-型蛋白酶、sedolisin蛋白酶和sip-型蛋 白酶的i) 一種蛋白酶或ii)兩種或更多種蛋白酶特異性的RNAi構建體產生。在某些實施 方式中，RNAi構建體對于slp2、slp3、slp5和/或slp6是特異性的。
[0023] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞進一步包含N-乙酰葡 糖胺基轉移酶I催化結構域和N-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域。在某些實施方式 中，N-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域和N-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域由多核 苷酸編碼。在某些實施方式中，N-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域由第一多核苷酸編碼 和N-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域由第二多核苷酸編碼。在可以與前述實施方式組 合的某些實施方式中，真菌細胞進一步包含編碼甘露糖苷酶II和/或半乳糖基轉移酶的多 核苷酸。在某些實施方式中，真菌細胞包含選自α?，2-甘露糖苷酶、N-乙酰葡糖胺基轉移 酶I、Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶II、甘露糖苷酶II和/或半乳糖基轉移酶的酶，所述酶進一 步包括靶向肽，例如，用于相應酶的正確定位的異源靶向肽。在某些實施方式中，靶向肽選 自 SEQ ID Ν0:589-594。
[0024] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞是木霉屬真菌細胞、毀 絲霉屬真菌細胞、曲霉屬真菌細胞、鏈孢霉屬真菌細胞、鐮孢菌屬或青霉菌屬真菌細胞或者 金孢子菌屬真菌細胞。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞是里氏木 霉（Trichoderma reesei)〇
[0025] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，真菌細胞對于p印4蛋白酶是野 生型的。
[0026] 另一個方面包括通過以下方式提高異源多肽穩定性的方法：a)提供前述任何實 施方式的絲狀真菌細胞和b)培養該細胞以表達該異源多肽，其中所述異源多肽與其中所 述蛋白酶不具有降低的活性（例如，如不包含編碼該蛋白酶的基因的突變）的對應親本絲 狀真菌細胞中產生的異源多肽相比具有提高的穩定性。另一個方面包括通過以下方式制 備異源多肽的方法：a)提供前述任何實施方式的絲狀真菌細胞；b)培養所述宿主細胞以使 得表達所述異源多肽，和c)純化所述異源多肽。在可以與前述實施方式組合的某些實施方 式中，所述絲狀真菌細胞進一步包含載體蛋白。在某些實施方式中，所述載體蛋白是CHB1。 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，所述培養是在包含蛋白酶抑制劑的培養基 中。在某些實施方式中，所述培養是在具有選自SBT1和胰凝乳蛋白酶抑制劑的一種或兩種 蛋白酶抑制劑的培養基中。在某些實施方式中，根據該方法產生的異源多肽是糖基化的哺 乳動物多肽且多肽的總N-聚糖的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、 至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或100 % (摩爾％ )由Man3GlcNAc2N-聚糖組 成。在其它實施方式中，根據該方法產生的異源多肽是糖基化的哺乳動物多肽且多肽的總 N-聚糖的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至 少80%、至少90%或100% (摩爾％ )由復合N-聚糖組成。在某些實施方式中，根據該方 法產生的異源多肽是糖基化的哺乳動物多肽且多肽的總N-聚糖的至少10%、至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% (摩 爾％ )由雜合N-聚糖組成。在某些實施方式中，根據該方法產生的異源多肽是糖基化的哺 乳動物多肽且多肽的總N-聚糖的至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至 少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% (摩爾％ )由G1或G2N-聚糖組成。另一 個方面包括可通過上述方法獲得的異源多肽。
[0027] 另一個方面包括選自 pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、tspl、slpl、slp2、gapl 和 gap2 的至少三種蛋白酶具有降低的或沒有可檢測的活性的木霉屬真菌細胞，其中所述細胞進一 步包含編碼產生水平比對應親本木霉屬真菌細胞中該多肽的產生水平高至少2倍的哺乳 動物多肽的重組多核苷酸。
[0028] 在某些實施方式中，至少三種蛋白酶的表達水平在木霉屬真菌細胞中降低或消 除。在某些實施方式中，編碼至少三種蛋白酶的基因各自包含降低或消除木霉屬真菌細胞 中相應蛋白酶活性的突變。在某些實施方式中，木霉屬真菌細胞包括具有降低或消除蛋白 酶活性的突變的三個蛋白酶編碼基因，其選自gapl、slpl和pepl。在可以與前述實施方式 組合的某些實施方式中，木霉屬真菌細胞中的哺乳動物多肽是抗體或其抗原結合片段或者 免疫球蛋白，且該至少三種蛋白酶選自pepl、pep3、pep4、tspl、slpl、slp2、gapl和gap2。在 某些實施方式中，木霉屬真菌細胞包含四種蛋白酶編碼基因，其各包含降低或消除相應蛋 白酶活性的突變，且具有這種突變的四種蛋白酶編碼基因是P印l、tspl、slpl和gapl。在某 些實施方式中，木霉屬真菌細胞具有五種蛋白酶編碼基因，其各包含降低或消除相應蛋白 酶活性的突變，且具有這種突變的五種蛋白酶編碼基因是pepl、tspl、slpl、gapl和pep4。 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，木霉屬真菌細胞中的哺乳動物多肽是生長 因子、干擾素、細胞因子或白介素，且具有降低的活性的三種蛋白酶選自pepl、pep2、pep3、 pep4、pep5、pep8、pepll、pepl2、gapl、gap2、slpl、slp2、slpl 和 tspl。在某些實施方式中， 木霉屬真菌細胞具有五種蛋白酶編碼基因，其各包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變， 且具有這種突變的五種蛋白酶編碼基因是pepl、tspl、slpl、gapl和gap2。在某些實施方 式中，木霉屬真菌細胞具有六種蛋白酶編碼基因，其各包含降低或消除相應蛋白酶活性的 突變，且具有這種突變的六種蛋白酶編碼基因是pepl、tspl、slpl、gapl、gap2和pep4。在 可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，木霉屬真菌細胞具有七種蛋白酶編碼基因， 其各包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變，且七種蛋白酶編碼基因是P印1、tspl、slpl、 gapl、gap2、pep4和pep3。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，木霉屬真菌細胞 具有八種蛋白酶編碼基因，其各包含降低相應蛋白酶活性的突變，且具有這種突變的八種 蛋白酶編碼基因是 pepl、tspl、slpl、gapl、gap2、pep4、pep3 和 pep5。
[0029] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，木霉屬真菌細胞進一步包含一種 或多種另外的蛋白酶的降低的活性或沒有可檢測的活性。在某些實施方式中，降低或消除 木霉屬真菌細胞中一種或多種另外的蛋白酶的表達水平。在某些實施方式中，木霉屬真菌 細胞中編碼一種或多種另外的蛋白酶的基因各具有降低或消除相應蛋白酶活性的突變。 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，一種或多種另外的蛋白酶編碼基因選自 pep7、pep8、pepll、pepl2、tppl、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7 和 slp8〇
[0030] 在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，木霉屬真菌細胞進一步包含降低 的或沒有可檢測的ALG3活性。在某些實施方式中，木霉屬真菌細胞中編碼ALG3的基因包 含降低或消除相應活性的突變。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，木霉屬真 菌細胞進一步包含編碼α-1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。在可以與前述實施方式組合的 某些實施方式中，突變降低或消除木霉屬真菌細胞中基因的表達。在可以與前述實施方式 組合的某些實施方式中，突變是木霉屬真菌細胞中基因的缺失。在可以與前述實施方式組 合的某些實施方式中，突變是木霉屬真菌細胞中編碼蛋白酶的催化結構域的基因部分的缺 失。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，突變是木霉屬真菌細胞中編碼蛋白酶 的催化結構域的基因部分中的點突變。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，木 霉屬真菌細胞進一步包含Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域和Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶 II催化結構域。在某些實施方式中，Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域和Ν-乙酰葡糖 胺基轉移酶II催化結構域通過木霉屬真菌細胞的多核苷酸編碼。在某些實施方式中，Ν-乙 酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域通過木霉屬真菌細胞的第一多核苷酸編碼和Ν-乙酰葡糖 胺基轉移酶II催化結構域通過木霉屬真菌細胞的第二多核苷酸編碼。在可以與前述實施 方式組合的某些實施方式中，木霉屬真菌細胞進一步包含編碼甘露糖苷酶II的多核苷酸。 在某些實施方式中，蛋白質各與選自SEQ ID勵：1、17、37、58、66、82、98、118、129、166和182 的氨基酸序列具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少 96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 %的序列同一性。在某些實施方式中，木霉屬真 菌細胞中的總蛋白酶活性降低到其中所述蛋白酶不具有降低的活性的對應木霉屬親本細 胞的總蛋白酶活性的49%或更低，31 %或更低。在可以與前述實施方式組合的某些實施方 式中，細胞進一步包含編碼產生水平比對應親本木霉屬真菌細胞中多肽的產生水平高至少 兩倍的的哺乳動物多肽的重組多核苷酸。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中， 哺乳動物多肽以全長形式產生，其水平高于對應親本木霉屬真菌細胞中全長形式多肽的產 生水平。
[0031] 另一個方面包括通過以下方式提高異源多肽穩定性的方法：a)提供前述任一實 施方式的木霉屬真菌細胞；和b)培養所述細胞以表達異源多肽，其中該異源多肽與不包含 編碼蛋白酶的基因的突變的宿主細胞相比具有提高的穩定性。另一個方面包括通過以下方 式制備異源多肽的方法：a)提供前述任一實施方式的木霉屬真菌細胞；b)培養宿主細胞以 表達異源多肽；和c)純化異源多肽。在可以與前述實施方式組合的某些實施方式中，絲狀 真菌細胞進一步包含載體蛋白。在某些實施方式中，載體蛋白是CBH1。
[0032] 附圖簡要說明
[0033] 圖1描繪了顯示從天冬氨酸蛋白酶的親和柱純化洗脫的級分的PAGE凝膠。
[0034] 圖2描繪了顯示將IgG與天冬氨酸蛋白酶孵育的結果的PAGE凝膠。
[0035] 圖3描繪了顯示單蛋白酶刪除菌株M181和M195的產生的DNA印跡分析。圖3A 描繪了 P印1 0RF的預期信號：來自親本M127的>8kb，沒有來自轉化體的信號。圖3B描繪 了 p印1 5'側翼的預期信號：來自親本M127的>8kb，來自轉化體的4kb。圖3C描繪了 p印1 3'側翼的預期信號：來自親本M127的>8kb，來自轉化體的4. 2kb。
[0036] 圖4描繪了顯示p印1缺失菌株M182中利妥昔單抗抗體的產生的DNA印跡分析。 圖4A描繪了 peplORF的預期信號：來自親本M169的>8kb，沒有來自轉化體的信號。圖4B 描繪了 bar的預期信號：來自轉化體的1. 0+1. 7kb，來自pTTv41的3. lkb，沒有來自M169的 信號。圖4C描繪了 bar的預期信號：來自轉化體的1. 8+2. 8kb，來自pTTv41的3. lkb，沒有 來自M169的信號。
[0037] 圖5描繪了顯示含p印1菌株和Λ p印1菌株的天冬氨酸蛋白酶純化的峰級分的蛋 白質凝膠。
[0038] 圖6Α-Β描繪了免疫印跡，其說明從利妥昔單抗產生菌株Μ169刪除ρ印2蛋白酶 提高了轉化體206Α (菌株Μ455)中（Α)輕鏈和（Β)重鏈的產生。代表18kD的輕鏈片段和 38kD的重鏈片段的條帶在菌株M455中與親本菌株M169相比更強。
[0039] 圖7圖示地描繪了來自利妥昔單抗產生菌株M169和ρ印2蛋白酶刪除轉化體98A、 116A、198A、201A和206A(M455)的上清液的蛋白酶活性。轉化體116AU98A和206A與其親 本菌株M169相比顯示出降低的針對酪蛋白的蛋白酶活性。
[0040] 圖8描繪了顯示PEP3和PEP7的蛋白酶活性對MAB01重鏈和原始IGF-1的影響的 免疫印跡。圖8A描繪了 pH 5. 5下蛋白酶活性對MAB01的影響。圖8A描繪了 pH 4. 5下蛋 白酶活性對MAB01的影響。圖8C描繪了 pH 4. 5下蛋白酶活性對原始IGF-1的影響。
[0041] 圖9描繪了顯示從SIP肽親和柱純化的含蛋白酶級分的PAGE凝膠。
[0042] 圖10描繪了顯示對于MAB01重鏈的SIP蛋白酶活性的免疫印跡。
[0043] 圖11圖示地描繪了有或沒有抑制劑的情況下針對酪蛋白的蛋白酶活性。
[0044] 圖12描繪了顯示在刪除slpl、slp2、slp3和gapl各蛋白酶后MAB01重鏈和輕鏈 產生的水平的免疫印跡。圖12A顯示MAB01重鏈的產生。圖12B顯示MAB01輕鏈的產生。
[0045] 圖13圖示地描繪了在刪除slpl、slp2、slp3和gapl各蛋白酶后MAB01重鏈和輕 鏈產生的倍數提高。各條代表圖12中顯示的幾個克隆的平均。
[0046] 圖14描繪了顯示gap2刪除菌株M244的MAB01產生水平的免疫印跡。圖14A顯 示MAB01重鏈（HC)的產生。圖14B顯示MAB01輕鏈（LC)的產生。
[0047] 圖15描繪了顯示與含GAP2蛋白酶的畢赤酵母上清液孵育后MAB01抗體的水平的 免疫印跡。
[0048] 圖16描繪了顯示人IgGl的蛋白酶降解水平的免疫印跡。
[0049] 圖17描繪了來自氨基芐脒柱的親和純化（純化的級分）和來自上清液樣品（上 清液）的MAB02抗體酶譜的結果。
[0050] 圖18描繪了 Λρ印lAtspl雙重蛋白酶刪除菌株M219的產生。圖18A描繪了 tspl 0RF的預期信號：來自親本M196的6. 4kb。圖18B描繪了 tspl 5'側翼的預期信號：來自轉 化體的3. 9kb，來自M196的>8kb，來自pTTv72的3. 9kb。圖18C描繪了 tspl 3'側翼的預 期信號：來自轉化體的2. 8kb，來自M196的>8kb，來自pTTv72的3. 9kb。
[0051] 圖19描繪了顯示Apepl Δ tsp2雙重刪除菌株M194的產生的DNA印跡分析。圖 19A描繪了 tsplORF的預期信號：來自親本M181的kb。圖19B描繪了 bar的預期信號：來 自轉化體的1.4+2. 5kb，來自pTTv42的2. 9kb，沒有來自M181的信號。圖19C描繪了 bar 的預期信號：來自轉化體的1. 9+3. 2kb，來自pTTv42的2. 9kb，沒有來自M181的信號。
[0052] 圖20圖示地描繪了來自各蛋白酶刪除上清液和親本菌株M124的培養上清液的標 準化蛋白酶活性數據。蛋白酶活性在前5個菌株中在pH 5. 5下測量和在后3個刪除菌株 中在pH 4. 5下測量。蛋白酶活性是針對綠色熒光酪蛋白。六重蛋白酶刪除菌株僅具有野 生型親本菌株的6%和7重蛋白酶刪除菌株的蛋白酶活性比六重蛋白酶刪除菌株活性低約 40%。
[0053] 圖21A描繪了發酵上清液的氨基芐脒純化級分的MAB02酶譜的結果。圖21B描繪 了發酵上清液的氨基芐脒純化級分的SDS PAGE凝膠（7% )。
[0054] 圖22描繪了包含蛋白酶的SBTI親和純化級分的MAB02酶譜分析的結果。在蛋白 酶降解MAB02抗體的情況中主要蛋白質水解活性表現為白色。濃縮的級分3 (cf3)和未濃 縮的級分1-4(fl-f4)在酶譜凝膠中分析。
[0055] 圖23描繪了顯示包含蛋白酶的SBTI親和純化級分的SDS PAGE凝膠。濃縮的級 分cf3和cf4顯示于凝膠中。
[0056] 圖24描繪了顯示SBTI純化蛋白酶的利妥昔單抗重鏈降解水平的免疫印跡。
[0057] 圖25描繪了顯示與含枯草溶菌素的畢赤酵母上清液孵育過夜時的抗體降解水平 的免疫印跡。圖25A顯示利妥昔單抗重鏈的蛋白酶降解。圖25B顯示MAB01重鏈的蛋白酶 降解。
[0058] 圖26描繪了顯示三重蛋白酶刪除菌株M277的產生的DNA印跡分析。圖26A描繪 了 slplORF的預期信號：僅來自親本（M219，M228)的6. 5kb。圖26B描繪了 slpl 5'側翼 的預期信號：來自親本的6. 5kb，來自轉化體的3. 3kb，來自質粒對照pTTvl26的4. 4kb。圖 26C描繪了 slpl 3'側翼的預期信號：來自親本的6. 5kb，來自轉化體的2. 3kb，來自質粒對 照 pTTvl26 的 4. 4kb。
[0059] 圖27描繪了顯示蛋白酶刪除菌株上清液的活性的MAB02酶譜分析。染色的凝膠 上的白色區域表示蛋白酶活性的區域。
[0060] 圖28圖示地描繪了蛋白酶刪除培養物上清液與野生型M124活性相比的總蛋白酶 活性。
[0061] 圖29描繪了顯示四蛋白酶刪除菌株M307的產生的DNA印跡分析。圖29A描繪了 gaplORF的預期的信號：僅來自親本（Mill 2A = M306)的4kb。圖29B描繪了 gapl 5'側翼 的預期的信號：來自親本的5. 5kb，來自轉化體的3. 4kb，來自質粒對照pTTvll7的4. lkb。 圖29C描繪了 gapl 3'側翼的預期的信號：來自親本的5. 5kb，來自轉化體的3. lkb，來自質 粒對照 pTTvll7 的 4. lkb。
[0062] 圖30圖示地描繪了三重和四重刪除菌株與野生型M124菌株相比的總蛋白酶活 性。
[0063] 圖31圖示地描繪了 M304三重刪除菌株和M371四重刪除菌株之間隨時間變化的 蛋白酶活性。
[0064] 圖32描繪了顯示四重蛋白酶刪除菌株M369的產生的DNA印跡分析。圖32A描繪 了 gap20RF的預期信號：來自親本（M307)的4. 9kb。圖32B描繪了 gap2 5'側翼的預期信 號：來自親本的4. 9kb，來自轉化體的2. 3kb，來自質粒對照pTTvl45的2. 3kb。圖32C描繪了 gap2 3'側翼的預期信號：來自親本的4. 9kb，來自轉化體的3. 8kb，來自質粒對照pTTvl45 的3. 8kb。圖32D描繪了顯示從四重蛋白酶刪除菌株Μ369產生pyr4-的DNA印跡分析，從 而產生菌株M381(克隆14)。預期的信號是gap2 5'側翼：來自所有菌株的1.5kb，來自質 粒對照PTIV145的4. lkb。圖32E描繪了顯示從四重蛋白酶刪除菌株M369產生pyr4-的 DNA印跡分析，從而產生菌株M381 (克隆14)。預期的信號是gap2 3'側翼：來自M307的 3.6kb，來自M369+環出（loopout)克隆的2.7kb，來自質粒對照pTTvl45的3.8kb。
[0065] 圖33圖示地描繪了從利用4重蛋白酶刪除菌株M307、5重蛋白酶刪除菌株M369 及6重蛋白酶刪除轉化體10B、44B、97A、97B和120A進行的搖瓶培養獲取的第5天上清液 的蛋白酶活性。熒光酪蛋白在pH 4. 5的檸檬酸鹽緩沖液中與稀釋的上清液孵育以檢測蛋 白酶活性。
[0066] 圖34描繪了顯示6重蛋白酶刪除菌株M396和M400的產生的DNA印跡分析。圖 34A描繪了 p印40RF的預期信號：來自M307和M369的6. 3kb。圖34B描繪了 p印40RF的 預期信號：來自M307和M369的6. 3kb，沒有來自轉化體的信號。圖34C描繪了 p印4 5'側 翼的預期信號：來自M307和M369的6. 3kb，來自轉化體的4. 8kb，來自pTTvl81的4. Okb。 圖34D描繪了 p印4 3'側翼的預期信號：來自M307和M369的6. 3kb，來自轉化體的2. lkb， 來自pTTvl81的4. Okb。圖34E描繪了顯示從6重蛋白酶刪除菌株M396產生pyr4-的DNA 印跡分析。預期的信號是P印4 3'側翼：來自M307和M369的6. 3kb，來自再純化轉化體的 2. lkb，來自環出克隆的4. 9kb。
[0067] 圖35描繪了顯示上清液蛋白酶體外產生的利妥昔單抗重鏈片段的量的免疫印 跡。
[0068] 圖36描繪了顯示來自SBTI處理的培養物和未處理對照的上清液樣品的重鏈和輕 鏈降解的免疫印跡。圖36A顯示重鏈的降解。圖36B顯示輕鏈的降解。
[0069] 圖37描繪了顯示來自胰凝乳蛋白酶抑制劑和胃蛋白酶抑制劑A處理的培養物或 來自未處理的對照培養物的上清液樣品的重鏈和輕鏈降解水平的免疫印跡。圖37A顯示輕 鏈的降解。圖37B顯示重鏈的降解。
[0070] 圖38描繪了從里氏木霉培養物上清液純化抗體的過程。
[0071] 圖39描繪了顯示來自包含p印1蛋白酶刪除的里氏木霉的抗體重鏈（HC)和輕鏈 (LC)的穩定性提高的免疫印跡。三種模型抗體在大的搖瓶上清液（Λρ印1和M124)和發 酵上清液（pH 5.5 ;28°C ;20g/L 廢谷物提取物（spent grain extract)，60g/L 乳糖）中測 試。
[0072] 圖40描繪了顯示來自包含tspl蛋白酶刪除的里氏木霉細胞的利妥昔單抗（Rx) 重鏈的產生增加的免疫印跡。轉化體12-2A和12-16A與親本菌株相比清楚地顯示更多的 重鏈。
[0073] 圖41描繪了顯示與來自三重蛋白酶刪除菌株M277的上清液孵育過夜后MAB01重 鏈降解降低的免疫印跡。在第5天培養物上清液中孵育過夜后，與來自沒有蛋白酶刪除的 對照菌株M124的上清液相比，在三重蛋白酶刪除上清液中發現2. 5倍高的重鏈。當在7天 培養上清液中孵育時，與來自對照菌株M124的上清液相比，在三重蛋白酶刪除上清液中發 現4倍高的重鏈。
[0074] 圖42描繪了模型蛋白質的降解研究。來自6重蛋白酶刪除菌株的未稀釋上清液 在pH 4. 2下用于摻入純模型蛋白質中（0.05 μ g/μ 1)。摻有模型蛋白質（0.05 μ g/μ 1) 的50mM檸檬酸鈉 pH 4.0顯示為緩沖液對照。摻雜的上清液和對照在37°C下孵育20小 時。10 μ 1的各樣品加載到18% SDS PAGE凝膠中。hGH在22kD處，IFNa 2b在19. 4kD處 和 IGF1 在 7. 5kD 處。
[0075] 圖43描繪了來自6重蛋白酶刪除菌株的上清液中MAB01抗體重鏈的穩定性測試。 MAB01抗體以0. 05μ g/μ 1存在于未稀釋的上清液中。10μ 1的各樣品加載到4-20% SDS PAGE凝膠中。重鏈在來自6重蛋白酶刪除菌株的上清液中pH 4. 2下37°C下20小時孵育 后是穩定的。重鏈用TBST中1:30, 000稀釋的抗重鏈IgG AP偶聯的抗體（Sigma#A3188) 檢測。全長重鏈在凝膠上50kD處。
[0076] 圖44描繪了來自具有或不具有抑制劑和補充劑的24孔培養物的人生長激素的 第4天樣品。12 μ 1的各上清液被加載。來自Acris的初級抗體，目錄#AM00401PU-N小鼠 抗-116!1抗體（在了851'中稀釋到2以8/1111)和1:10,000稀釋的扮〇1^(1(#170-6520)山羊 抗小鼠 IgG AP偶聯二級抗體。hGH標準（200ng)，Abeam目錄#ab51232。全長hGH蛋白在 22kD 處。
[0077] 圖45描繪了里氏木霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢霉、產黃青霉、米曲霉、構巢曲霉和 黑曲霉的天冬氨酸蛋白酶的系統發生。比對利用Clustal Omega(http://www.ebi. ac.uk/ Tools/msa/clustalo/)進行且樹使用BL0SUM62采用平均距離計算。
[0078] 圖46描繪了里氏木霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢霉、產黃青霉、米曲霉、構巢曲霉 和黑曲霉的枯草溶菌素蛋白酶的系統發生。比對利用Clustal Omega(http://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行且樹使用BL0SUM62利用平均距離計算。"pyr"是指熱 解素（pyrolysin)，"prKsf3"是指蛋白酶 K，亞族 3 ;prtA、prtK、prU、prtF 和 prtBCI 是指如 Bryant 等（2009)BMC Evolutionary Biology 9:168，doi:10. 1186/1471-2148-9-168,圖 5 和附加的文件no. 8中所述的亞族。
[0079] 圖47描繪了里氏木霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢霉、產黃青霉、米曲霉、構巢曲霉和 黑曲霉的谷氨酸蛋白酶的系統發生。比對利用Clustal Omega(http://www.ebi. ac.uk/ Tools/msa/clustalo/)進行且樹使用BL0SUM62利用平均距離計算。
[0080] 圖48描繪了里氏木霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢霉、產黃青霉、米曲霉、構巢曲霉 和黑曲霉的sedolisin蛋白酶的系統發生。比對利用Clustal Omega(http://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進行且樹使用BL0SUM62利用平均距離計算。由于slp7 類似于sedolisin蛋白酶，它包括在該樹中。包括煙曲霉序列以幫助確定sedolisins 之間的關系。各蛋白酶前面的縮寫sedA/B/C/D/E是基于Reichard等（2006)APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Vol. 72, p. 1739-1748,圖 4,由其中獲取了與煙曲霉 sedolisin (對應蛋白酶）的BLAST檢索。
[0081] 圖49 :A :表達質粒pTTv67和pTTv99的示意圖。MAB01重鏈包含在pTTv67載體中 且輕鏈包含在PTIV99載體中。B :表達載體pTTv223的示意圖。MAB01重鏈和輕鏈包含在 pTTv223載體中。
[0082] 圖50 :A :MAB01產生菌株M507的分批補料發酵中pH 5. 2下MAB01輕鏈和重鏈 產生的蛋白質印跡分析。使用的抗體是針對重鏈的Sigma A3188(左印跡）和針對輕鏈的 Sigma A3813(右印跡），都以1:10,000稀釋。樣品代碼表示按天計的發酵時間。0. 1μ 1的 上清液在兩個印跡中加載到各道中。Β :ρΗ 5. 5下ΜΑΒ01產生菌株Μ507的分批補料發酵中 ΜΑΒ01輕鏈和重鏈產生的蛋白質印跡分析。使用的抗體是針對重鏈的Sigma Α3188(左側的 印跡）和針對輕鏈的Sigma Α3813 (右側的印跡），都以1:10, 000稀釋。樣品代碼表示按天 計的發酵時間。〇. ?μ 1的上清液在兩個印跡中加載到各道中。
[0083] 圖51. pH 5. 5下分批補料發酵bio00503b中菌株Μ304的ΜΑΒ01輕鏈和重鏈產生的 蛋白質印跡分析。使用的抗體是針對重鏈的Sigma A3188和針對輕鏈的Sigma A3813。來 自M304發酵bi〇00477b的第8天包括作為對照。樣品代碼表示按天計的發酵時間。0. 1μ 1 的上清液在兩個印跡中加載。最上面的印跡是重鏈和較下面的印跡是輕鏈。
[0084] 圖 52. pTTv204RNAi 表達載體。
[0085] 圖53 :表達敲減slp2表達的RNAi的菌株中檢測MAB01重鏈產生的免疫印跡。
[0086] 圖54A描繪了 M401發酵的第3天樣品的IFN- a 2b表達水平的定量。 1 μ 1/2 μ 1/4 μ 1上清液加載到4-20% SDS PAGE凝膠。免疫印跡用在TBST中稀釋到1 μ g/ ml 的 Abeam (#ab9386)抗-IFN-a 2b 抗體進行。來自 Bio-rad (#170-6520)的二級抗體是在 TBST中1:5000稀釋的山羊抗-小鼠 IgG AP偶聯二級抗體。蛋白質標準加載到凝膠上，對 應于50ng、100ng和200ng的全長IFN-a2b。光密度定量使用Totallab Quant TL100軟件 進行。對于定量，2μl樣品是最具代表性的。全長IFN-α2b對照（100ng)在19.3kD處和 載體結合的IFN- a 2b在70kDa處。
[0087] 圖54B描繪了 M577和M652發酵培養的第3-6天樣品的免疫印跡分析。0. 2μ 1 的生長上清液加載到4-20% SDS PAGE凝膠。免疫印跡使用在TBST中稀釋到1 μ g/ml的 Abcam(#ab9386)抗-IFN-a 2b 抗體進行。來自 Bio-rad(#170-6520)的二級抗體是在 TBST 中1:5000稀釋的山羊抗-小鼠 IgG AP偶聯二級抗體。全長IFN-a2b對照（100ng)在 19. 3kD處和載體結合的IFN- a 2b在70kDa處。
[0088] 圖55描繪了來自第4天（M577發酵）和第3天（M652發酵）樣品的IFN- a 2b表 達水平的定量。各樣品的〇. 05 μ 1和0. 1 μ 1的上清液加載到4-20% SDS PAGE凝膠。免 疫印跡使用在TBST中稀釋到1 μ g/ml的Abcam(#ab9386)抗-IFN-α 2b抗體進行。來自 Bi〇-rad(#170-6520)的二級抗體是在TBST中1:5000稀釋的山羊抗-小鼠 IgG AP偶聯二 級抗體。蛋白質標準加載到凝膠上，對應于50ng、100ng和200ng的全長IFN-α 2b。光密度 定量使用Totallab Quant TL100軟件進行。對于定量，0. 1 μ 1樣品是最具代表性的。全長 IFN- a 2b對照（100ng)在19. 3kD處和載體結合的IFN- a 2b在70kDa處。
[0089] 詳細說明
[0090] 本發明涉及在至少三種蛋白酶具有降低的活性或沒有活性的絲狀真菌細胞中產 生重組異源多肽的改進的方法。本發明部分地基于以下令人驚異的發現，即降低絲狀真菌 細胞中特定內源蛋白酶組合的活性提高多種重組表達的異源蛋白質（如免疫球蛋白和生 長因子）的表達和穩定性。盡管其它人產生了具有一種或多種滅活的蛋白酶的木霉屬真菌 細胞，但他們未提供關于哪些蛋白酶與提高特定類型的蛋白質（如哺乳動物蛋白質）的表 達和穩定性最相關的指導。例如，W02011/075677公開了可以在木霉屬中敲除的特定蛋白酶 且甚至公開了多種蛋白酶缺陷的木霉屬真菌細胞。但是，W02011/075677未提供關于哪些蛋 白酶對哺乳動物蛋白質（如免疫球蛋白或生長因子）的表達和穩定性具有不利影響的任何 指導，因為其中沒有描述任何哺乳動物蛋白質表達的實例。此外，W02011/075677僅公開了 單一真菌蛋白質在單一蛋白酶缺陷的三種不同真菌菌株的各菌株中的異源表達。因此，本 領域技術人員很可能將W02011/075677作為各單一蛋白質的滅活足以用于異源蛋白產生 的教導。Yoon 等（2009，Appl.Microbiol Biotechnol 82:691-701，2010:Appl.Microbiol Biotechnol DOI 10. 1007/s00253-010-2937-0)報告了用于在米曲霉中產生異源蛋白的五 重和十重蛋白酶基因破壞體（disruptant)的構建。10重蛋白酶破壞體細胞提高凝乳酶產 率僅3. 8倍，盡管存在較高數目的破壞蛋白酶基因 。Van den Hombergh等報告了黑曲霉的 三重蛋白酶基因破壞體。盡管數據顯示了蛋白酶活性的降低，但其中沒有描述任何哺乳動 物蛋白質產生的實例。
[0091] 申請人:令人驚異地證明多種蛋白酶與絲狀真菌細胞如木霉屬真菌細胞中總蛋白 酶活性的降低、異源蛋白產生的增加和異源蛋白表達后的穩定相關。特別地，發明人通過 純化蛋白酶和確定哪些蛋白酶具有與降解異源蛋白質（如哺乳動物蛋白質）最相關的活 性鑒定了在木霉屬真菌細胞中實際表達的蛋白酶（與僅在基因組中被編碼相反）。另外 地，發明人確認刪除負責特定蛋白酶活性的基因獲得總蛋白酶活性的實質降低（這與包含 這類刪除的絲狀真菌細胞中就產生的蛋白質的量和質量方面來說蛋白質穩定性的提高相 關），并導致細胞中全長異源蛋白質產生的增加。還發現經工程化以降低至少三種蛋白酶 基因的活性的木霉屬真菌細胞導致全長哺乳動物蛋白如抗體、治療性蛋白質或抗體變體 (如Fab或單域抗體）的產生的預料不到的和協同的增加。換句話說，產生的全長哺乳動 物蛋白的量大于僅包含一種或兩種蛋白酶基因刪除的木霉屬真菌細胞產生的總量。因此， 與TO2011/075677相反，本發明人證明絲狀真菌細胞如木霉屬真菌細胞中完整異源蛋白質 的產生可以通過降低或消除細胞中至少三種蛋白酶的活性而實現。
[0092] 因此，本公開的特定方面提供了通過具有降低的或沒有至少三種蛋白酶的活性產 生提高水平的異源蛋白質的絲狀真菌細胞，其中該細胞進一步包含編碼異源多肽的重組多 核苷酸，該異源多肽的產生水平與其中蛋白酶不具有降低的活性的對應親本絲狀真菌細胞 中多肽的產生水平相比高至少兩倍。換句話說，所希望的異源蛋白產生水平的提高可通過 將具有至少三種蛋白酶的降低的活性的絲狀真菌細胞中異源蛋白的產生水平與不具有這 種降低的活性但其它方面與表現出提高的水平的細胞相同的絲狀真菌細胞中異源蛋白的 產生水平相比較確定。
[0093] 本公開的其它方面提供了通過以下方式提高異源多肽穩定性的方法：a)提供具 有降低的或沒有至少三種蛋白酶的活性的本公開的絲狀真菌細胞，其中該細胞進一步包含 編碼異源多肽的重組多核苷酸；和b)培養該細胞以表達異源多肽，其中異源多肽與不包含 編碼蛋白酶的基因的突變的宿主細胞相比具有提商的穩定性。
[0094] 本公開的再其它方面提供了通過以下方式制備異源多肽的方法：a)提供具有降 低的或沒有至少三種蛋白酶的活性的本公開的絲狀真菌細胞，其中該細胞進一步包含編碼 異源多肽的重組多核苷酸；b)培養宿主細胞以表達異源多肽；和c)純化異源多肽。
[0095] 本公開的特定方面還提供通過具有降低的或沒有至少三種蛋白酶的活性而產生 提高水平的哺乳動物多肽的木霉屬真菌細胞，該至少三種蛋白酶選自pepl、pep2、pep3、 pep4、pep5、pep8、pepll、pepl2、tspl、slpl、slp2、gapl 和 gap2,其中該細胞進一步包含編 碼哺乳動物多肽的重組多核苷酸，該哺乳動物多肽的產生水平與其中蛋白酶不具有降低的 活性的對應親本木霉屬真菌細胞中多肽的產生水平相比高至少兩倍。換句話說，所希望的 異源蛋白產生水平的提高可通過將具有至少三種蛋白酶的降低的活性的木霉屬真菌細胞 中異源蛋白質的產生水平與不具有這種降低的活性但其它方面與表現出提高的水平的細 胞相同的木霉屬真菌細胞中異源蛋白質的產生水平相比較確定。
[0096] 本公開的其它方面提供了通過以下方式提高哺乳動物多肽穩定性的方法：a)提 供具有至少三種蛋白酶的降低的活性的本公開的木霉屬真菌細胞，其中該細胞進一步包含 編碼哺乳動物多肽的重組多核苷酸；和b)培養該細胞以表達哺乳動物多肽，其中哺乳動物 多肽與不包含編碼蛋白酶的基因的突變的宿主細胞相比具有提高的穩定性。
[0097] 本公開的進一步的方面提供了通過以下方式制備哺乳動物多肽的方法：a)提供 具有至少三種蛋白酶的降低的活性的本公開的木霉屬真菌細胞，其中該細胞進一步包含編 碼哺乳動物多肽的重組多核苷酸；b)培養宿主細胞以表達哺乳動物多肽；和c)純化哺乳動 物多肽。
[0098] 定義
[0099] 如本文中所使用的，"免疫球蛋白"是指包含共價偶聯在一起的重鏈和輕鏈并能夠 特異性地與抗原結合的多聚蛋白質。免疫球蛋白分子是包括幾種類型的分子如IgM、IgD、 IgG、IgA和IgE的大的分子家族。
[0100] 如本文中所使用的，"抗體"是指完整的免疫球蛋白分子以及能夠結合抗原的其片 段。這些包括雜合（嵌合）抗體分子（參見，例如Winter等Nature349:293-99225, 1991 和美國專利No. 4, 816, 567226)、F(ab'）2和F(ab)片段和Fv分子、非共價異二聚 體[227,228]、單鏈 Fv 分子（scFv)(參見，例如 Huston 等？1'〇(：.似1:1.4〇3(1.3(3；[· U. S. A. 85:5897-83, 1988)、二聚和三聚的抗體片段構建體、微抗體（參見，例如Pack等 Biochem 31，1579-84, 1992 和 Cumber 等 J. Immunology 149B, 120-26, 1992)、人源化 抗體分子（參見，例如 Riechmann 等 Nature 332, 323-27, 1988 ;Verhoeyan 等 Science 239, 1534-36, 1988和GB 2, 276, 169)和從這類分子獲得的任何功能性片段以及通過非常 規過程如噬菌體展示獲得的抗體。優選地，抗體是單克隆抗體。獲得單克隆抗體的方法是 本領域中公知的。
[0101] 如本文中所使用的，"肽"和"多肽"是包括多個連續的聚合氨基酸殘基的氨基酸序 列。為了本發明的目的，通常肽是包括最多50個氨基酸殘基的那些分子，和多肽包括超過 50個氨基酸殘基。肽或多肽可以包括修飾的氨基酸殘基、非由密碼子編碼的天然存在的氨 基酸殘基和非天然存在的氨基酸殘基。如本文中所使用的，"蛋白質"可以指任何尺寸的肽 或多肽。
[0102] 本發明的蛋白酶
[0103] 本文描述的本發明涉及通過使得細胞中存在的至少三種蛋白酶具有降低的或沒 有可檢測的活性而產生提高水平的異源多肽如哺乳動物多肽的絲狀真菌細胞如木霉屬真 菌細胞。表達異源多肽的絲狀真菌細胞中存在的這些蛋白酶通常催化表達的重組多肽的 顯著降解。因此，通過降低或消除表達異源多肽的絲狀真菌細胞中的蛋白酶活性，表達的多 肽的穩定性提高，導致多肽產生水平的提高，且在一些情況中，導致產生的多肽的質量提高 (例如，全長多肽而不是降解的多肽）。
[0104] 蛋白酶包括，但不限于天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶、枯草溶菌素蛋 白酶、谷氨酸蛋白酶和sedolisin蛋白酶。這類蛋白酶可以從絲狀真菌細胞中鑒定和分離 并測試以確定是否其活性的降低影響絲狀真菌細胞的重組多肽的產生。用于鑒定和分離蛋 白酶的方法是本領域中公知的，并包括，但不限于親和色譜、酶譜分析和凝膠電泳。鑒定的 蛋白酶然后可以通過從表達重組多肽如異源或哺乳動物多肽的絲狀真菌細胞刪除編碼所 鑒定的蛋白酶的基因并確定是否該刪除導致細胞總蛋白酶活性的降低（例如，降低到對應 親本絲狀真菌細胞總蛋白酶活性的49%或更低或者31 %或更低的水平）和表達的重組多 肽的產生水平的提高（例如，比對應親本絲狀真菌細胞中的產生水平高兩倍）來進行測試。 用于刪除基因、測量總蛋白酶活性和測量產生的蛋白質的水平的方法是本領域中公知的并 包括本文中描述的方法。"對應親本絲狀真菌細胞"指其中蛋白酶不具有降低的或消除的活 性的對應細胞。
[0105] 天冬氨酸蛋白酶
[0106] 天冬氨酸蛋白酶是利用天冬氨酸殘基水解多肽和蛋白質中的肽鍵的酶，通常，天 冬氨酸蛋白酶在其活性位點中包含兩個高度保守的天冬氨酸殘基（其在酸性pH下具有最 佳活性）。來自真核生物體如木霉屬真菌的天冬氨酸蛋白酶包括胃蛋白酶、組織蛋白酶和腎 素。這類天冬氨酸蛋白酶具有雙結構域的結構，其被認為是由祖先基因重復產生的。與這 種重復事件一致，各結構域的總體折疊 （overall fold)是相似的，盡管兩個結構域的序列 開始偏離。各結構域貢獻催化性天冬氨酸殘基中的一個。活性位點位于天冬氨酸蛋白酶的 兩個結構域形成的裂隙中。真核天冬氨酸蛋白酶進一步包括保守的二硫橋，其可以幫助鑒 別多肽為天冬氨酸蛋白酶。
[0107] 在木霉屬真菌細胞中已經鑒定了九種天冬氨酸蛋白酶：pepl(tre74156)、 pep2 (tre53961)、pep3 (trel21133)、pep4 (tre77579)、pep5 (tre81004)和 pep7 (tre58669)、 p印8(trel22076)、p印11 (trel21306)和 p印12 (trell9876)。
[0108] Pepl
[0109] 合適的p印1蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉p印1(SEQ ID NO: 1)、有性哈茨 木霉（Hypocrea lixii)gi|ll558498(SEQ ID N0:2)、棘抱木霉（Trichoderma asperellum) gi|47027997(SEQ ID N0:3)、深綠木霉（Trichoderma atroviride)jgi|Triat21297887(SEQ ID NO:4)、綠木霉（Trichoderma virens)jgi|TriviGv29_8_2I 81777 (SEQ ID NO:5)、 煙曲霉（Aspergillus fumigatus)jgi|Trire2Iafm:Afu5gl3300(SEQ ID NO:6)、米曲 霉（Aspergillus oryzae)gi| 94730408 (SEQ ID NO: 7)、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae)gi I 322712783 (SEQ ID NO: 8)、玉米赤霉（Gibberella zeae)gi I 46126795 (SEQ IDN0:9)、Fusariumvenenatumgi|l8448713(SEQIDN0:10)、尖抱鎌刀菌（Fusa;rium oxysporum)giI 342879173(SEQ ID NO: 11) > Grosmannia clavigera gi|320591399(SEQ ID N0:12)、黑白輪枝菌（Verticillium alboatrum)gi|302422750(SEQ ID N0:13)、球毛殼霉 (Chaetomiumglobosum)gi|ll6l82964(SEQIDNO:l 4)、粗糖鏈抱霉（Neurosporacrassa) gi I 85110723 (SEQ ID NO: 15)、四孢鏈孢菌（Neurospora tetrasperma)gi I 336463990 (SEQ IDN0:16)、嗜熱毀絲霉（Myceliophthorathermophila)gi367030924(SEQIDN0:491)、產 黃青霉（Penicillium chrysogenum)gi255953325(SEQ ID N0:492)、黑曲霉（Aspergillus niger)gi350639535 (SEQ ID N0:493)、構巢曲霉（Aspergillus nidulans)gi67541436 (SEQ ID NO :494)及其同源物。
[oho] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常p印1蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:1-16、SEQ ID N0:491-494的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:1-16、SEQ ID N0:491-494的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0111] 在一些實施方式中，pepl是里氏木霉pepl。里氏木霉pepl編碼的氨基酸序列示 于SEQ ID NO: 1中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID NO: 1具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID NO: 1具有100%的同一性。
[0112] Pep2
[0113] 合適的p印2蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉p印2(SEQ ID NO: 182)、深 綠木霉jgi|Triat2|l42040(SEQIDN0:183)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2|53481(SEQID N0:184)、蛹蟲草（Cordyc印smilitaris)CM01gi|346326575(SEQIDN0:185)、粗糙鏈孢霉 gi 85111370 (SEQ ID N0:495)及其同源物。
[0114] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常p印2蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:182-185、SEQ ID N0:495的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如， 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:182-185、SEQ ID NO:495的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0115] 在一些實施方式中，pep2是里氏木霉pep2。里氏木霉pep2編碼的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:182中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:182具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:182具有100 %的同一性。
[0116] Pep3
[0117] 合適的p印3蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉p印3(SEQ ID NO: 17)、深綠 木霉jgi|Triat2(SEQIDN0:18)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:19)、有性哈 茨木霉 gi 1145583125 (SEQ ID N0:20)、棘孢木霉 gi I 51860175 (SEQ ID N0:21)、黑曲霉 gi|：317〇25l64(SEQ ID NO:22)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)gi|l59l22534(SEQ ID NO: 23)、黑曲霉 gi 1134054572 (SEQ ID NO: 24)、蛹蟲草 gi |346318620 (SEQ ID NO: 25)、 Glomerella graminicola gi I 310800156 (SEQ ID NO: 26)、尖孢鐮刀菌 gi I 342871221 (SEQ ID N0:27)、Grosmannia clavigera gi|320591121 (SEQ ID N0:28)、灰葡萄孢霉 (Botryotinia fuckeliana)gi|l2002205(SEQ ID N0:29)、太瑞斯梭抱殼霉（Thielavia terrest;ris)gi| 346997107 (SEQ ID NO: 30)、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum) gi|l56055954(SEQ ID N0:31)、球毛殼霉 gi|ll6197829(SEQ ID N0:32)、四孢鏈孢菌 gi|336472132(SEQ ID N0:33)、粗糙鏈孢霉 gi|85102020(SEQ ID N0:34)、費希新薩托 菌（Neosartorya fischeri)gi|ll9467426(SEQ ID N0:35)、馬尼弗青霉菌（Penicillium marneffei)gi|212534792(SEQ ID N0:36)、嗜熱毀絲霉gi367025909(SEQ ID N0:496)、產黃 青霉 gi255947264(SEQ ID N0:497)、米曲霉 391870123(SEQ ID N0:498)及其同源物。
[0118] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常p印3蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:17-36、SEQ ID N0:496-498的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99.5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:17-36、SEQ ID NO:496-498的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0119] 在一些實施方式中，pep3是里氏木霉pep3。里氏木霉pep3編碼的氨基酸序列示 于SEQ ID N0:17中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:17具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:17具有100 %的同一性。
[0120] Pep4
[0121] 合適的pep4蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉pep4(SEQ ID N0:37)、綠木 霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:38)、深綠木霉jgi|Triat2(SEQIDN0:39)、黃綠木霉 (Trichoderma aureoviride)gi|l93735605(SEQ ID N0:40)、黑曲霉 gi|l45232965(SEQ ID N0:41)、煙曲霉gi|70999520(SEQ ID N0:42)、棒曲霉（Aspergillus clavatus) gi 1121705756(SEQ ID NO: 43), Nectria haematococca gi | 302899226(SEQ ID N0:44), Glomerella graminicola gi|310796316(SEQ ID N0:45)、蛹蟲草gi|346322842(SEQ ID N0:46)、玉米赤霉 gi|46138535(SEQ ID N0:47)、金龜子綠僵菌 gi|322708430(SEQ ID N0:48)、尖抱鎌刀菌 gi|342882947(SEQ ID N0:49)、Metarhizium acridum gi|322700747(SEQ ID N0:50)、大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)gi|346973691(SEQ ID N0:51)、灰葡萄孢霉 gi|l54309857(SEQ ID N0:52)、球毛殼霉 gi|ll6203505(SEQ ID N0:53)、太瑞斯梭抱殼霉gi|347001590(SEQIDN0:54)、稻癌病菌（Magnaportheoryzae) gi|39973863(SEQ ID NO:55)、黑孢塊菌（Tuber melanosporum)gi|296417651 (SEQ ID N0:56)、粗糙鏈孢霉 gi|85094599(SEQ ID N0:57)、嗜熱毀絲霉 gi367031892 gi255947264(SEQ ID N0:499)、產黃青霉 gi255936729 gi255947264(SEQ ID N0:500)、米 曲霉gil69770745 gi255947264(SEQ ID N0:501)、構巢曲霉gi67524891 gi255947264(SEQ ID NO:502)及其同源物。
[0122] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常p印4蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:37-57、SEQ ID N0:499-502的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:37-57、SEQ ID NO:499-502的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0123] 在一些實施方式中，pep4是里氏木霉pep4。里氏木霉pep4編碼的氨基酸序列示 于SEQ ID N0:37中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:37具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:37具有100%的同一性。
[0124] Pep5
[0125] 合適的p印5基因的實例包括，但不限于里氏木霉p印5(SEQ ID N0:58)、綠木 霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:59)、深綠木霉jgi|Triat2|277859(SEQIDN0:60)、 Metarhizium acridum gi I 322695806 (SEQ ID NO: 61)、尖孢鐮刀菌 gi 1156071418 (SEQ ID NO:62)、蛹蟲草 gi I 346324830 (SEQ ID NO:63)、玉米赤霉 gi I 46124247 (SEQ ID NO: 64)、大 麗輪枝菌gi|346978752(SEQ ID N0:65)、嗜熱毀絲霉gi367019798(SEQ ID N0:503)及其同 源物。
[0126] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常p印5蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:58-65、SEQ ID N0:503的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如， 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:58-65、SEQ ID N0:503 的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0127] 在一些實施方式中，pep5是里氏木霉pep5。里氏木霉pep5編碼的氨基酸序列示 于SEQ ID N0:58中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:58具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:58具有100%的同一性。
[0128] Pep7
[0129] 合適的p印7基因的實例包括，但不限于里氏木霉p印7 (SEQ ID NO: 186)、深綠木 霉jgi|Triat2(SEQIDN0:187)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:188)、Glomerella graminicola gi|310800487(SEQ ID NO: 189), Metarhizium acridum gi|322700577(SEQ ID N0:190)、太瑞斯梭孢殼霉 gi|347003264(SEQ ID N0:191)、鵝掌柄孢殼（Podospora anserine)gi|171680938(SEQ ID NO:192)、嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilum) gi I 340905460 (SEQ ID NO:193)、大麗輪枝菌 gi I 346975960 (SEQ ID NO: 194)、嗜熱毀絲霉 gi I 347009870, gi367026634 (SEQ ID NO: 195)、粗糙鏈孢霉 gi I 85090078 (SEQ ID NO: 196)、 稻瘟病菌 gi|39948622(SEQ ID N0:197)、球毛殼霉 gi|ll6191517(SEQ ID N0:198)、稻 瘟病菌gi|39970765(SEQIDN0:199)、構巢曲霉gi67522232(SEQIDN0:504)、黑曲霉 gi350630464(SEQ ID N0:505)、米曲霉 gi317138074(SEQ ID N0:506)及其同源物。
[0130] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常p印7蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:186-199、SEQ ID N0:504-506的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:186-199、SEQ ID NO:504-506的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0131] 在一些實施方式中，pep7是里氏木霉pep7。里氏木霉pep7編碼的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:186中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:186具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:186具有100 %的同一性。
[0132] Pep8
[0133] 合適的p印8基因的實例包括里氏木霉p印8EGR48424(SEQ ID N0:507)、綠木霉 EHK19238(SEQ ID N0:508)、深綠木霉EHK40047(SEQ ID N0:509)、四孢鏈孢菌EG053367(SEQ IDN0:510)、嗜熱毀絲霉XP_003658897(SEQIDN0:511)、粗糙鏈孢霉XP_965343(SEQID N0:512)、金龜子綠僵菌EFZ03501(SEQIDN0:513)、太瑞斯梭孢殼霉XP_003656869(SEQID N0:514)、尖孢鐮刀菌E⑶79769(SEQIDN0:515)和玉米赤霉XP_381566(SEQIDN0:516)、 稻瘟病菌XP_。。3714540·1(SEQIDN0:517)、產黃青霉XP_002557331 (SEQIDN0:518)、米 曲霉 XP_001822899.1(SEQ ID N0:519)、構巢曲霉 XP_664091.1(SEQ ID N0:520)、黑曲霉 EHA24387. 1(SEQ ID N0:521)及其同源物。
[0134] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常p印8蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:507-521的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更 高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:507-521的氨基酸序列具有具有100% 的同一'I"生。
[0135] 在一些實施方式中，pep8是里氏木霉pep8。里氏木霉pep8編碼的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:507中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:507具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:507具有100%的同一性。
[0136] Pep 11
[0137] 合適的p印11基因的實例包括，但不限于里氏木霉p印11EGR49498(SEQ ID N0:522)、綠木霉EHK26120(SEQIDN0:523)、深綠木霉EHK41756(SEQIDN0:524)、Fusarium pseudograminearum EKJ74550(SEQ ID NO:525) > Metarhizium acridum EFY91821(SEQ ID N0:526)和玉米赤霉 XP_384151(SEQ ID N0:527)、嗜熱毀絲霉 XP_003667387. 1(SEQ ID N0:528)、粗糙鏈孢霉XP_960328.1(SEQIDN0:529)及其同源物。
[0138] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常pepll蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:522-529的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更 高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:522-529的氨基酸序列具有100%的同 一性。
[0139] 在一些實施方式中，pepll是里氏木霉pep8。里氏木霉pepll編碼的氨基酸序列示 于SEQ ID N0:522中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:522 具有50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶 與SEQ ID N0:522具有100%的同一性。
[0140] Pepl2
[0141] 合適的p印12基因的實例包括，但不限于里氏木霉p印12EGR52517(SEQ ID N0:530)、綠木霉 p印 12EHK18859(SEQ ID N0:531)、深綠木霉 p印 12EHK45753(SEQ ID NO: 532)、Fusarium pseudograminearum pepl2EKJ73392 (SEQ ID NO: 533)、玉米赤霉 p印12XP_388759(SEQIDN0:534)和金龜子綠僵菌p印12EFY95489(SEQIDN0:535)、粗糙 鏈孢霉XP_964574.1(SEQIDN0:536)、嗜熱毀絲霉XP_003659978.1(SEQIDN0:537)及其 同源物。
[0142] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常p印12蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:530-537的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更 高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:530-537的氨基酸序列具有100%的同 一性。
[0143] 在一些實施方式中46口8是里氏木霉口6口12。里氏木霉口6口12編碼的氨基酸序列示 于SEQ ID N0:530中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:530 具有50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶 與SEQ ID N0:530具有100%的同一性。
[0144] 胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶
[0145] 胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶是具有與胰蛋白酶類似的底物特異性的酶。胰蛋白酶樣 絲氨酸蛋白酶利用絲氨酸殘基水解多肽和蛋白質中的肽鍵。通常，胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白 酶切割帶正電的氨基酸殘基之后的肽鍵。來自真核生物體如木霉屬真菌的胰蛋白酶樣絲氨 酸蛋白酶包括胰蛋白酶1、胰蛋白酶2和中胰蛋白酶（mesotrypsin)。這類胰蛋白酶樣絲氨 酸蛋白酶一般包含三個氨基酸（如組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸）的催化三聯體（catalytic triad),其形成使得活性位點絲氨酸親核的電荷中繼（charge relay)。真核生物胰蛋白酶 樣絲氨酸蛋白酶進一步包括由甘氨酸和絲氨酸的骨架酰胺氫原子形成的"氧陰離子穴"，其 可以幫助鑒別多肽為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。
[0146] 在木霉屬真菌細胞中已經鑒定了一種胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶： tspl (tre73897)。如以下討論的，已證明tspl對重組多肽如免疫球蛋白的表達具有顯著影 響。
[0147] 如以下實施例3中討論的，絲氨酸蛋白酶從木霉屬純化并顯示為具有降解哺乳動 物蛋白的多種蛋白酶活性。在這些活性中，tspl確認為胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶。tspl蛋 白酶基因然后從木霉屬真菌細胞刪除并證明刪除tspl實現了總蛋白酶活性的顯著降低， 從而導致該細胞產生的哺乳動物蛋白的穩定性提高。
[0148] 合適的tspl蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉tspl (SEQ ID N0:66)、深 綠木霉 jgi|Triat2|298187(SEQ ID N0:67)、jgi|TriviGv29_8_2(SEQ ID N0:68)、有性 哈茨木霉 gi|l45583579(SEQ ID N0:69)、有性哈茨木霉 gi|63025000(SEQ ID N0:70)、 核盤菌 gi|l56052735(SEQ ID N0:71)、灰葡萄孢霉 gi|l54314937(SEQ ID N0:72)、穎 枯殼針抱（Phaeosphaeria nodorum)gi|l69605891(SEQ ID N0:73)、Leptosphaeria maculans gi | 312219044 (SEQ ID NO: 74)、大麗輪枝菌 gi | 37992773 (SEQ ID NO: 75)、炭 色抱腔菌（Cochliobolus carbonum)gi|l072114(SEQ ID N0:76)、Metarhizium acridum gi I 322695345 (SEQ ID NO :77)、金龜子綠僵菌 gi I 4768909 (SEQ ID NO :78)、gi I 464963 (SEQ ID N0:79)、玉米赤霉gi|46139299(SEQ ID N0:80)、金龜子綠僵菌（SEQ ID N0:81)、構巢曲 霉 gi67523821 (SEQ ID N0:538)及其同源物。
[0149] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常tspl蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:66-81、SEQ ID N0:538的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如， 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID NO:66-81、SEQ ID NO:538 的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0150] 在一些實施方式中，tspl是里氏木霉tspl。里氏木霉tspl編碼的氨基酸序列示 于SEQ ID N0:66中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:66具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:66具有100 %的同一性。
[0151] 枯草溶菌素蛋白酶
[0152] 枯草溶菌素蛋白酶是具有與枯草溶菌素類似的底物特異性的酶。枯草溶菌素蛋白 酶利用絲氨酸殘基水解多肽和蛋白質中的肽鍵。一般地，枯草溶菌素蛋白酶是包含三個氨 基酸天冬氨酸、組氨酸和絲氨酸的催化三聯體的絲氨酸蛋白酶。這些催化性殘基的排列是 來自地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)的原型枯草溶菌素共有的。來自真核生物 體如木霉屬真菌的枯草溶菌素蛋白酶包括弗林蛋白酶、MBTPS1和TPP2。真核生物胰蛋白酶 樣絲氨酸蛋白酶進一步包括氧陰離子穴中的天冬氨酸殘基。枯草溶菌素蛋白酶slp7也類 似于sedolisin蛋白酶tppl。
[0153] 在木霉屬真菌細胞中已經鑒定了七種枯草溶菌素蛋白酶：slpl (tre51365)、 slp2(trel23244)、 slp3(trel23234)、 slp5(tre64719)、 slp6(trel21495)、 slp7(trel23865)和 slp8(tre58698)。
[0154] Slpl
[0155] 合適的slpl蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉slpl(SEQ ID N0:82)、 深綠木霉jgi|Triat2(SEQIDN0:83)、深綠木霉jgi|Triat2(SEQIDN0:84)、綠木 霉 jgi|TriviGv29_8_2(SEQ ID N0:85)、有性哈茨木霉 gi|l45583581(SEQ ID N0:86)、 Metarhizium acridum gi | 322694632 (SEQ ID NO: 87)、尖孢鐮刀菌 gi | 342877080 (SEQ ID N0:88)、玉米赤霉 gi | 46139915 (SEQ ID N0:89)、Epichloe festucae gi 1170674476 (SEQ ID NO:90) >Nectria haematococca gi|302893164(SEQ ID NO:91) >Sordaria macrospore gi I 336266150(SEQ ID NO:92)、Glomerella graminicola giI 310797947(SEQ ID NO:93)、 四孢鏈孢菌gi I 336469805 (SEQ ID N0:94)、粗糙鏈孢霉gi I 85086707 (SEQ ID N0:95)、稻瘟 病菌 gi 1145608997 (SEQ ID N0:96)、球毛殼霉 gi 1116208730 (SEQ ID N0:97)、嗜熱毀絲霉 gi367029081(SEQ ID N0:539)及其同源物。
[0156] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常slpl蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:82-97、SEQ ID N0:539的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如， 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:82-97、SEQ ID N0:539 的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0157] 在一些實施方式中，slpl是里氏木霉slpl。里氏木霉slpl編碼的氨基酸序列示 于SEQ ID N0:82中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:82具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID NO :82具有100 %的同一性。
[0158] Slp2
[0159] 合適的slp2蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉slp2(SEQ ID N0:98)、深綠 木霉jgi|Triat2(SEQIDN0:99)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:100)、有性哈 茨木霉 gi 1115111226 (SEQ ID NO: 101)、煙曲霉 gi I 70997972 (SEQ ID NO: 102)、Nectria haematococca gi I 302915240 (SEQ ID NO: 103)、玉米赤霉 gi I 46105128 (SEQ ID NO: 104)、 蟲花棒束抱（Isaria farinose) gi I 68165000 (SEQ ID NO: 105)、Glomerella graminicola giI 310797854(SEQ ID NO: 106)、Epichloe festucae giI 170674491 (SEQ ID NO:107)、 Metarhizium acridum gi|322697754(SEQ ID N0:108)、支頂抱屬（Acremonium sp.) F11177gi1147225254(SEQ ID NO: 109)、Ophiostoma piliferum gi115808807(SEQ ID NO: 110)、四孢鏈孢菌 gi I 336463649 (SEQ ID NO: 111)、嗜熱毛殼菌 gi I 340992600 (SEQ ID NO: 112)、Metarhizium flavoviride gi| 254351265 (SEQ ID NO: 113)、鵝掌柄孢 殼gi|l71680111(SEQIDN0:114)、稻瘟病菌gi|39943180(SEQIDN0:115)、核盤菌 gi 1156058540 (SEQ ID NO: 116)、柄籃狀菌（Talaromyces stipitatus)gi I 242790441 (SEQ ID N0:117)、嗜熱毀絲霉 gi367021472(SEQ ID N0:540)、黑曲霉 gil45237646(SEQ ID N0:541)、米曲霉gil69780712(SEQIDN0:542)、產黃青霉gi255955889(SEQIDN0:543)、 構巢曲霉gi259489544(SEQIDN0:544)、粗糙鏈孢霉gi85084841(SEQIDN0:545)及其同 源物。
[0160] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常slp2蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:98-117、SEQ ID N0:540-545的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:98-117、SEQ ID NO:540-545的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0161] 在一些實施方式中，slp2是里氏木霉slp2。里氏木霉slp2編碼的氨基酸序列不 于SEQ ID N0:98中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:98具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:98具有100 %的同一性。
[0162] Slp3
[0163] 合適的slp3蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉slp2(SEQIDN0:166)、深綠 木霉jgi|Triat2(SEQIDN0:167)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:168)、康寧肉座 菌（Hypocrea koningii)gi| 124295071 (SEQ ID NO: 169)、淡紫紫抱菌（Purpureocillium lilacinum)gi|l30750164(SEQ ID N0:170)、金龜子綠僵菌gi|l6215677(SEQ ID N0:171)、洛斯里被毛孢（Hirsutella rhossiliensis)gi| 90655148 (SEQ ID N0:172)、 Tolypocladium inflatum gi118542429 (SEQ ID NO:173)、Metacordyceps chlamydosporia gi|19171215(SEQ ID NO:174)、蛹蟲草gi|346321368(SEQ ID NO:175)、鐮孢菌屬 (Fusariumsp·)gi|628051(SEQIDN0:176)、四孢鏈孢菌gi|336471881(SEQIDN0:177)、 球毛殼霉 gi 1116197403 (SEQ ID NO: 178)、粗糙鏈孢霉 gi I 85084841 (SEQ ID NO: 179)、尖 孢鐮刀菌 gi I 56201265 (SEQ ID NO: 180)、玉米赤霉 gi I 46114268 (SEQ ID NO: 181)、嗜熱 毀絲霉 gi367026259(SEQ ID N0:546)、構巢曲霉 gi67538776(SEQ ID N0:547)、米曲霉 gil69771349(SEQIDN0:222)、黑曲霉gi470729(SEQIDN0:223)及其同源物。
[0164] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常slp3蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQIDN0:166-181、SEQIDN0:546-547、SEQIDN0:222-223的氨基酸序列具有50% 或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQID N0:166-181、SEQ ID N0:546-547、SEQ ID N0:222-223 的氨基酸序列具有 100%的同一性。
[0165] 在一些實施方式中，slp3是里氏木霉slp3。里氏木霉slp3編碼的氨基酸序列不于 SEQ ID N0:166中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:166具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:166具有100 %的同一性。
[0166] Slp5
[0167] 合適的slp5蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉slp5 (SEQ ID NO: 200)、深綠木 霉jgi|Triat2(SEQIDN0:201)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:202)、有性哈茨木 霉 gi 1118161442 (SEQ ID NO: 203)、尖孢鐮刀菌 gi I 342883549 (SEQ ID NO: 204)、玉米赤霉 giI 46135733(SEQ ID NO:205)、Glomerella graminicola giI 310796396(SEQ ID NO:206)、 Nectria haematococca gi I 302927954 (SEQ ID NO: 207)、蛹蟲草 gi I 346319783 (SEQ ID NO: 208)、粗糙鏈孢霉 gi I 85094084 (SEQ ID NO: 209)、四孢鏈孢菌 gi I 336467281 (SEQ ID NO: 210)、大麗輪枝菌 gi I 346971706 (SEQ ID NO: 211)、太瑞斯梭孢殼霉 gi I 347001418 (SEQ ID NO: 212)、稻瘟病菌 gi 1145605493 (SEQ ID NO: 213)、嗜熱毀絲霉 gi367032200 (SEQ ID N0:548)、產黃青霉gi62816282(SEQIDN0:549)及其同源物。
[0168] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常slp5蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:200-213、SEQ ID N0:548-549的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:200-213、SEQ ID NO:548-549的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0169] 在一些實施方式中，slp5是里氏木霉slp5。里氏木霉slp5編碼的氨基酸序列不于 SEQ ID N0:200中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:200具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:200具有100 %的同一性。
[0170] Slp6
[0171] 合適的slp6蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉slp6(SEQ ID N0:214)、深綠 木霉jgi|Triat2(SEQIDN0:215)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:216)、綠色木 霉菌（Hypocrea virens) gi I 29421423 (SEQ ID NO: 217)、有性哈茨木霉 gi 1145583127 (SEQ ID N0:218)、鉤狀木霉（Trichoderma hamatum)gi|30144643(SEQ ID N0:219)、煙曲霉 gi|2295(SEQ ID N0:220)、土曲霉（Aspergillus terreus)gi|ll5391147(SEQ ID N0:221)、 米曲霉 gi 1169771349 (SEQ ID NO: 222)、黑曲霉 gi I 470729 (SEQ ID NO: 223)、Glomerella graminicola gi|310794714(SEQ ID N0:224)、玉米赤霉 gi|46114946(SEQ ID N0:225)、 尖孢鐮刀菌 gi I 342873942 (SEQ ID NO: 226)、Nectria haematococca gi I 302884541 (SEQ ID N0:227)、費希新薩托菌（Neosartorya fischeri)gi|ll9500190(SEQ ID N0:228)、黑白 輪枝菌 gi I 302413161 (SEQ ID NO: 229)、Glomerella graminicola gi I 310790144 (SEQ ID N0:230)、粗糙鏈孢霉gi85090020(SEQIDN0:550)及其同源物。
[0172] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常slp6蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:214-230、SEQ ID N0:550的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如， 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:214-230、SEQ ID NO:550的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0173] 在一些實施方式中，slp6是里氏木霉slp6。里氏木霉slp6編碼的氨基酸序列不于 SEQ ID N0:214中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:214具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:214具有100%的同一性。
[0174] Slp7
[0175] 合適的slp7蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉slp7(SEQ ID N0:231)、深 綠木霉jgi|Triat2(SEQIDN0:232)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2(SEQIDN0:233)、金 龜子綠僵菌 gi I 322710320 (SEQ ID NO: 234)、Nectria haematococca gi I 302915000 (SEQ ID N0:235)、嗜熱毀絲霉 gi|347009020，gi367024935(SEQ ID N0:236)、玉米赤霉 gi| 46137655 (SEQ ID NO: 237)、太瑞斯梭孢殼霉 gi| 346996549 (SEQ ID NO: 238)、稻 瘟病菌 gi|l45610733(SEQ ID N0:239)、構巢曲霉 gi67541991(SEQ ID N0:551)、產黃 青霉 gi255933786(SEQ ID N0:552)、黑曲霉 gi317036543(SEQ ID N0:553)、米曲霉 gil69782882(SEQIDN0:554)、粗糙鏈孢霉gi85109979(SEQIDN0:555)及其同源物。
[0176] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常slp7蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:231-239、SEQ ID N0:551-555的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:231-239、SEQ ID NO:551-555的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0177] 在一些實施方式中，slp7是里氏木霉slp7。里氏木霉slp7編碼的氨基酸序列不于 SEQ ID N0:231中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:231具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:231具有100%的同一性。
[0178] Slp8
[0179] 合適的slp8蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉slp8(SEQ ID N0:240)、深 綠木霉jgi|Triat2|l98568(SEQIDN0:241)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2|33902(SEQID NO:242)及其同源物。
[0180] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與選自SEQ ID N0:240-242的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99· 5% 或更高）。在一些實 施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:240-242的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0181] 在一些實施方式中，slp8是里氏木霉slp8。里氏木霉slp8編碼的氨基酸序列不于 SEQ ID N0:240中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:240具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:240具有100 %的同一性。
[0182] 谷氨酸蛋白酶
[0183] 谷氨酸蛋白酶是水解多肽和蛋白質中的肽鍵的酶。谷氨酸蛋白酶對胃蛋白酶抑制 劑A是不敏感的，且因此有時稱為胃蛋白酶抑制劑不敏感的酸性蛋白酶。盡管谷氨酸蛋白 酶先前與天冬氨酸蛋白酶一起分組且通常統稱為酸性蛋白酶，目前發現谷氨酸蛋白酶具有 與天冬氨酸蛋白酶非常不同的活性位點殘基。
[0184] 在木霉屬真菌細胞中已經鑒定了兩種谷氨酸蛋白酶：gapl (tre69555)和 gap2(trel06661)。
[0185] Gapl
[0186] 合適的gapl蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉gapl (SEQ ID NO: 118)、深 綠木霉jgi|Triat2|40863(SEQIDN0:119)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2|l92684(SEQID NO: 120)、黃曲霉 gi I 238499183 (SEQ ID NO: 121)、黑曲霉 gi 1145251555 (SEQ ID NO: 122)、 土曲霉 gi 1115491521 (SEQ ID NO: 123)、gi I 37154543 (SEQ ID NO: 124)、gi I 48425531 (SEQ ID NO: 125)、gi| 351873 (SEQ ID NO: 126)、太瑞斯梭孢殼霉 gi| 346997245 (SEQ ID N0:127)、產黃曲霉 gi|255940586(SEQ ID N0:128)、嗜熱毀絲霉 gi367026504(SEQ ID N0:574)、米曲霉 gi317150886(SEQ ID N0:575)、粗糙鏈孢霉 gi85097968(SEQ ID N0:576)、黑曲霉 gil31056(SEQ ID N0:577)、產黃青霉 gi255930123(SEQ ID N0:578)、 黑曲霉 gil45236956(SEQ ID N0:579)、米曲霉 gil69772955(SEQ ID N0:580)、黑曲 霉 gil45249222(SEQ ID N0:581)、構巢曲霉 gi67525839(SEQ ID N0:582)、米曲霉 gil69785367(SEQ ID N0:583)、產黃青霉 gi255955319(SEQ ID N0:584)、嗜熱毀絲 霉gi367019352(SEQIDN0:585)、米曲霉gi391863974(SEQIDN0:586)、嗜熱毀絲霉 gi367024513(SEQ ID N0:587)及其同源物。
[0187] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常gapl蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:118-128、SEQ ID N0:574-587的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:118-128、SEQ ID NO:574-587的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0188] 在一些實施方式中，gapl是里氏木霉gapl。里氏木霉gapl編碼的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:118中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:118具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:118具有100 %的同一性。
[0189] Gap 2
[0190] 合適的gap2蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉gap2(SEQIDN0:129)、深 綠木霉jgi|Triat2|298116(SEQIDN0:130)、綠木霉jgi|TriviGv29_8_2|30331 (SEQID NO: 131)、jgi|TriviGv29_8_2 I 225131 (SEQ ID NO: 132)、黃曲霉gi| 238499183 (SEQ ID N0:133)、黑曲霉gi|l45251555(SEQ ID N0:134)、構巢曲霉gi|67901056(SEQ ID N0:135)、 棒曲霉gi|l21711990(SEQ ID N0:136)、煙曲霉gi|70986250(SEQ ID N0:137)、馬尼弗青霉 菌 gi I 212534108 (SEQ ID NO: 138)、柄籃狀菌 gi I 242789335 (SEQ ID NO: 139)、Grosmannia clavigera gi I 320591529 (SEQ ID NO: 140)、費希新薩托菌gi 1119474281 (SEQ ID NO: 141)、 馬尼弗青霉菌 gi I 212527274 (SEQ ID NO: 142)、產黃曲霉 gi I 255940586 (SEQ ID NO: 143)、 gi|l31056(SEQIDN0:144)、嗜熱毀絲霉gi367030275(SEQIDN0:588)及其同源物。
[0191] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常gap2蛋白酶）的氨基酸序列與 選自SEQ ID N0:129-144、SEQ ID N0:588的氨基酸序列具有50%或更高的同一性（例如， 60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:129-144、SEQ ID NO:588的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0192] 在一些實施方式中，gap2是里氏木霉gap2。里氏木霉gap2編碼的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:129中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:129具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:129具有100 %的同一性。
[0193] Sedolisin 蛋白酶
[0194] Sedolisin蛋白酶是利用絲氨酸殘基水解多肽和蛋白質中的肽鍵的酶。Sedolisin 蛋白酶一般包含獨特的絲氨酸、谷氨酸和天冬氨酸催化三聯體。Sedolisin蛋白酶也包含氧 陰離子穴中的天冬氨酸殘基。來自真核生物體如木霉屬真菌的sedolisin蛋白酶包括三肽 基肽酶。
[0195] 合適的tppl蛋白酶的實例包括，但不限于里氏木霉tppl (SEQ ID N0:145)、深 綠木霉 jgi I Triat2 1188756 (SEQ ID NO: 146)、綠木霉 jgi I TriviGv29_8_2 I 217176 (SEQ ID NO:147)、煙曲霉gi|70993168(SEQ ID NO:148)、米曲霉gi|169776800(SEQ ID N0:149)、黑曲霉gi|l45236399(SEQIDN0:150)、棒曲霉gi|l21708799(SEQIDN0:151)、 黑曲霉 gi|145239871(SEQ ID NO:152)、棒曲霉 gi|121714541(SEQ ID NO:153)、 土 曲霉 gi| 115387645 (SEQ ID NO: 154)、煙曲霉 gi| 70982015 (SEQ ID NO: 155)、核盤菌 gi 1156045898 (SEQ ID NO: 156)、灰葡萄孢霉 gi 1154321758 (SEQ ID NO: 157)、費希新薩 托菌 gi 1119499774 (SEQ ID NO: 158)、柄籃狀菌 gi I 242798348 (SEQ ID NO: 159)、馬尼弗 青霉菌 gi I 212541546 (SEQ ID NO: 160)、玉米赤霉 gi I 46114460 (SEQ ID NO: 161)、尖孢 鐮刀菌 gi I 342890694(SEQ ID NO: 162)、Grosmannia clavigera gi I 320592937(SEQ ID N0:163)、黑白輪枝菌 gi|302406186(SEQ ID N0:164)、大麗輪枝菌 gi|346971444(SEQ ID N0:165)、煙曲霉CAE51075·1(SEQIDN0:556)、米曲霉XP_001820835·1(SEQIDN0:557)、 產黃青霉 XP_〇〇2564029.1(SEQ ID N0:558)、構巢曲霉 XP_664805.1(SEQ ID N0:559)、產 黃青霉 XP_002565814.1(SEQ ID N0:560)、嗜熱毀絲霉 XP_003663689.1(SEQ ID N0:561)、 粗糙鏈孢霉 XP_958412.1(SEQ ID N0:562)、黑曲霉 XP_001394118.1(SEQ ID N0:563)、 煙曲霉 CAE17674. 1(SEQ ID N0:564)、黑曲霉 XP_001400873. 1(SEQ ID N0:565)、煙 曲霉 CAE46473. 1(SEQ ID N0:566)、米曲霉 ΧΡ_002373530· 1(SEQ ID N0:567)、構巢 曲霉 ΧΡ_660624· 1 (SEQ ID N0:568)、產黃青霉 ΧΡ_002562943· 1 (SEQ ID N0:569)、煙 曲霉CAE17675·1(SEQIDN0:570)、煙曲霉EAL86850·2(SEQIDN0:571)、粗糙鏈孢霉 XP_961957·1(SEQIDN0:572)、米曲霉BAB97387·1(SEQIDN0:573)及其同源物。
[0196] 因此，在某些實施方式中，本公開的蛋白酶（通常tppl蛋白酶）的氨基酸序列 與選自SEQ ID N0:145-165、SEQ ID N0:556-573的氨基酸序列具有50%或更高的同一性 (例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%、99. 5%或更高）。在一些實施方式中，蛋白酶與選自SEQ ID N0:145-165、SEQ ID NO:556-573的氨基酸序列具有100%的同一性。
[0197] 在一些實施方式中，tppl是里氏木霉tppl。里氏木霉tppl編碼的氨基酸序列示于 SEQ ID N0:145.中。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶的氨基酸序列與SEQ ID N0:145具 有 50%或更高的同一性（例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%或更高）。在進一步的實施方式中，蛋白酶與SEQ ID N0:145具有100 %的同一性。
[0198] 同源蛋白酶
[0199] 本公開的其它實施方式涉及降低與本公開的蛋白酶同源的蛋白酶的活性。本文中 使用的"同源性"是指參比序列與第二序列的至少一個片段之間的序列相似性。同源物可 以通過本領域中已知的任何方法確定，優選通過使用BLAST工具將參比序列與單一第二序 列或序列的片段比較或與序列的數據庫比較確定。如下面描述的，BLAST基于序列同一性 和相似性比較序列。
[0200] 在兩個或更多個核酸或氨基酸序列的情況中，術語"相同"或百分"同一性"是指 相同的兩個或更多個序列或子序列。當在比較窗或指定區域上進行比較或比對以獲得最 大對應性時，如使用以下序列比較算法之一或通過人工比對和目視檢查測量的，如果兩個 序列具有指定百分比的氨基酸殘基或核苷酸相同（即，在指定區域上或在未指明的情況下 在整個序列上 29%的同一性，任選地30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、99%或100%的同一性），則兩個序列"基本上相同"。任選地，同一 性在長度至少約50個核苷酸（或10個氨基酸）的區域上存在，或更優選地在長度100-500 或1000或更多個核苷酸（或20、50、200或更多個氨基酸）的區域上存在。
[0201] 對于序列比較，通常一個序列用作將測試序列與其對比的參比序列。當使用序列 比較算法時，測試序列和參比序列輸入計算機中，指定子序列坐標（如果必要）并指定序列 算法程序參數。可以使用缺省程序參數，或者可以指定可選的參數。然后序列比較算法基于 序列參數計算測試序列相對于參比序列的百分序列同一性。當比較兩個序列的同一性時， 序列不必須是連續的，但任何空位將帶來降低總體百分同一性的罰分。對于blastn，缺省參 數是Gap開放罰分=5和Gap延伸罰分=2。對于blastp，缺省參數是Gap開放罰分=11 和Gap延伸罰分=1。
[0202] 如本文中使用的，"比較窗"包括指任何數目的連續位置的片段，包括，但不限于 20-600,通常約50-約200,更通常約100-約150,其中在兩個序列最佳對準后，序列可以與 具有相同數目的連續位置的參比序列比較。用于比較的序列比對方法是本領域中公知的。 可以進行用于比較的序列的最佳比對，例如通過Smith和Waterman (1981)的局部同源性算 法、通過他6(1161]^11和￥11118(311(1970)1]\1〇113;[01 48(3):443-453 的同源性比對算法、通過 Pearson 和 Lipman (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85(8) :2444-2448 的相似性檢索方法、 通過這些算法的計算機實施（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA)或通過人工比對 和目視檢查[參見，例如Brent等，（2003)Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，Inc. (Ringbou Ed)]〇
[0203] 適合于確定百分序列同一性和序列相似性的算法的兩個實例是BLAST和BLAST 2.0 算法，其分別描述于 Altschul 等（1997)Nucleic Acids Res 25(17):3389-3402 和 Altschul 等（1990)J.M〇1 Biol 215(3) :403-410 中。用于進行 BLAST 分析的軟件通過 National Center for Biotechnology Information公開可得。該算法包括通過鑒別查詢 序列中長度W的短字串，其在與數據庫序列中相同長度的字串比對時匹配或滿足一定的正 值閾值評分T，由此首先鑒別高分值序列對（HSP)。T被稱為鄰近字串評分閾值（Altschul 等，同上）。這些初始鄰近字串選中充當啟動檢索的種子以查找包含其的更長的HSP。字串 選中在兩個方向上沿著每個序列延伸，直到累積的比對分值可增加為止。對于核苷酸序列， 利用參數Μ(-對匹配殘基的獎勵分數，通常>0)和N(非配對殘基的罰分，通常<0)計算 累積分數。對于氨基酸序列，使用評分矩陣計算累積分數。每個方向上字串選中的延伸在 下列情況時停止：累積比對分值由其最大實現值跌落量X時；累積分值由于累積了一個或 多個負分殘基比對而達到〇以下時；或達到任一個序列的末端時。BLAST算法參數W、T和X 確定比對的靈敏度的速度。BLAST程序（對于核苷酸序列）使用的默認字長（W)為11，期望 值（E)為10, Μ = 5, N = -4和兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLAST程序使用的默認字 長（W)為3,期望值（E)為10和BL0SUM62評分矩陣[參見Henikoff和Henikoff, (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89(22):10915-10919]比對值（B) 50,期望值（E) 10, Μ = 5, N =-4 和兩條鏈的比較。
[0204] BLAST算法還進行兩個序列之間相似性的統計分析（參見，例如Karl in和 Altschul，（1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12) :5873-5787)。由 BLAST 算法提供的一 種相似性測量是最小和概率（P (N))，其提供了兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間偶然發生 匹配的概率的指示。例如，如果測試核酸與參比核酸的對比中的最小和概率低于約0. 2,更 優選低于約〇. 01，最優選低于約〇. 001，則認為該核酸與參比序列相似。
[0205] 除了如上所述的序列同一性百分比之外，兩個核酸序列或多肽基本上相同的另一 指示是由第一核酸編碼的多肽與針對由第二核酸編碼的多肽產生的抗體具有免疫交叉反 應性，如下所述。因此，例如在兩個肽僅存在保守置換的差異時，多肽與第二多肽通常基本 上相同。兩個核酸序列基本上相同的另一指示是兩個分子或它們的互補序列在嚴格條件下 彼此雜交，如下所述。兩個核酸序列基本上相同的再另一指示是相同的引物可用于擴增該 序列。
[0206] 如本文中公開的，本公開的蛋白酶也可以包括作為由如上所述的蛋白酶基因編碼 的保守修飾蛋白酶變體的蛋白酶。如本文所用的，"保守修飾變體"包括編碼的氨基酸序列 的單個置換、刪除或添加，其導致氨基酸被化學相似的氨基酸置換。提供功能上相似的氨基 酸的保守置換表是本領域中公知的。這類保守修飾變體附加于多態性變體、物種間同源物 和本公開的等位基因且不排除它們。以下八個組包含相互為保守置換的氨基酸：1)丙氨酸 (A)、甘氨酸（G) ;2)天冬氨酸（D)、谷氨酸（E) ;3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q) ;4)精氨酸 (R)、賴氨酸⑷；5)異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、蛋氨酸（M)、纈氨酸（V) ;6)苯丙氨酸（F)、酪 氨酸（Y)、色氨酸（W) ;7)絲氨酸（S)、蘇氨酸⑴和8)半胱氨酸（C)、蛋氨酸（M)(參見，例 如 Creighton, Proteins (1984))。
[0207] 圖45-48描繪了所選擇的絲狀真菌的天冬氨酸蛋白酶、枯草溶菌素蛋白酶、谷氨 酸蛋白酶和Sedolisin蛋白酶的系統發生樹。
[0208] 降低本發明蛋白酶的活性的方法
[0209] 本公開的進一步的方面涉及降低表達異源多肽如哺乳動物多肽的絲狀真菌細胞 中存在的蛋白酶的活性。
[0210] 絲狀真菌細胞中存在的蛋白酶的活性可以通過本領域技術人員已知的任何方法 降低。
[0211] 在一些實施方式中，降低的蛋白酶活性通過降低蛋白酶的表達實現，例如通過啟 動子修飾或RNAi。
[0212] 在其它實施方式中，降低的蛋白酶活性通過修飾編碼蛋白酶的基因實現。這類修 飾的實例包括，但不限于敲除突變、截斷突變、點突變、錯義突變、置換突變、移碼突變、插入 突變、重復突變、擴增突變、易位突變或反轉突變，且導致相應蛋白酶活性的降低。在目標蛋 白酶編碼基因中產生至少一個突變的方法是本領域中公知的，且包括，但不限于隨機誘變 和篩選、定點誘變、PCR誘變、插入誘變、化學誘變和照射。
[0213] 在某些實施方式中，蛋白酶編碼基因的一部分被修飾，如編碼催化結構域的區域、 編碼區域或編碼區域的表達需要的控制序列。基因的這種控制序列可以是啟動子序列或其 功能性部分，即足以影響基因的表達的部分。例如，啟動子序列可以滅活從而導致無表達， 或者較弱啟動子可以替代原始啟動子序列以減少編碼序列的表達。用于可能的修飾的其它 控制序列包括，但不限于前導序列、前肽序列、信號序列、轉錄終止子和轉錄激活子。
[0214] 存在于表達重組多肽的絲狀真菌細胞中的本公開的蛋白酶編碼基因也可以通過 利用基因刪除技術修飾以消除或降低該基因的表達。基因刪除技術使得基因的部分或完全 刪除成為可能，從而消除其表達。在這類方法中，基因的刪除可以使用構建為連續地包含該 基因側翼的5'和3'區域的質粒通過同源重組完成。
[0215] 存在于表達重組多肽的絲狀真菌細胞中的本公開的蛋白酶編碼基因也可以通 過引入、替換和/或移除基因中的一個或多個核苷酸或者該基因的轉錄或翻譯所需要 的其控制序列來修飾。例如，核苷酸可以插入或移除以引入終止密碼子、移除起始密 碼子或開放閱讀框的移碼。這樣的修飾可以通過本領域中已知的方法完成，包括，但 不限于定點誘變和peR產生的誘變（參見，例如，Botstein和Shortie, 1985, Science 229:4719 ;Lo 等,1985,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:2285 ;Higuchi 等，1988，Nucleic Acids Research 16:7351 ;Shimada，1996，Meth. 皿〇1.8丨〇1.57:157;!1〇等，1989,6611677:61;!1〇忖〇11等，1989,66116 77:61及53431'和 Sommer, 1990,BioTechniques 8:404)。
[0216] 另外，存在于表達重組多肽的絲狀真菌細胞中的本公開的蛋白酶編碼基因可以通 過將基因插入包含與該基因同源的核酸片段的破壞性核酸構建體中（其將產生同源性區 域的重復和在重復的區域之間并入構建體DNA)利用基因破壞技術修飾。如果插入的構建 體將基因的啟動子和編碼序列分隔開或干擾編碼序列以使得產生非功能性基因產物，則這 種基因破壞可以消除基因表達。破壞構建體可以簡單地是伴隨與該基因同源的5'和3'區 域的選擇標記基因。選擇標記使得能夠鑒別包含破壞的基因的轉化體。
[0217] 存在于表達重組多肽的絲狀真菌細胞中的本公開的蛋白酶編碼基因也可以通 過基因轉化的方法修飾（參見，例如，Iglesias和Trautner，1983, Molecular General Genetics 189:573-76)。例如，在基因轉化中，對應于基因的核苷酸序列體外誘變以產生缺 陷核苷酸序列，其隨后轉化到木霉屬菌株中以產生缺陷基因。通過同源重組，缺陷核苷酸序 列替代內源基因。可能希望的是缺陷核苷酸序列也包含用于選擇含缺陷基因的轉化體的標 記。
[0218] 存在于表達重組多肽的絲狀真菌細胞中的本公開的蛋白酶編碼基因也可以使用 與基因的核苷酸序列互補的核苷酸序列通過已建立的反義技術修飾（參見，例如，Parish 和 Stoker, 1997, FEMS Microbiology Letters 154:151-157)。特別地，絲狀真菌細胞的基 因表達可以通過引入與基因的核苷酸序列互補的核苷酸序列（其可以轉錄到菌株中且能 夠與細胞中產生的mRNA雜交）降低或滅活。在允許互補的反義核苷酸序列與mRNA雜交的 條件下，翻譯的蛋白質的量因此降低或消除。
[0219] 另外，存在于表達重組多肽的絲狀真菌細胞中的本公開的蛋白酶編碼基因也可以 通過已建立的RNA干擾（RNAi)技術修飾（參見，例如，W02005/056772和W0 2008/080017)。
[0220] 存在于表達重組多肽的絲狀真菌細胞中的本公開的蛋白酶編碼基因也可以使用 本領域中公知的方法通過隨機或特異性誘變修飾，其包括，但不限于化學誘變（參見，例 如，Hopwood, The Isolation of Mutants in Methods in Microbiology(J. R. Norris 和 D.W. Ribbons 編輯）pp. 363-433, Academic Press, New York, 251970)。基因修飾可以通過 使絲狀真菌細胞經歷誘變和篩選其中基因表達降低或滅活的突變體細胞來進行。例如，誘 變（其可以是特異性的或隨機的）可以通過使用合適的物理和化學誘變劑、使用合適的寡 核苷酸、使DNA序列經歷peR產生的誘變或其任何組合進行。物理和化學誘變劑的實例包 括，但不限于紫外（UV)照射、羥胺、N-甲基-Ν' -硝基-N-亞硝基胍（MNNG)、N-甲基-Ν' -亞 硝基胍（NTG)、〇-甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯（EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。 當使用這類試劑時，誘變通常通過在所選擇的誘變劑存在下在合適的條件下孵育待誘變的 木霉屬細胞，且隨后選擇表現出降低的或沒有基因表達的突變體來進行。
[0221] 在某些實施方式中，本公開的蛋白酶編碼基因中的至少一個突變或修飾導致不具 有可檢測的蛋白酶活性的修飾的蛋白酶。在其它實施方式中，本公開的蛋白酶編碼基因 中的至少一個修飾導致與對應非修飾蛋白酶相比具有至少低25%、低至少50%、低至少 75 %、低至少90 %、至少95 %、至少100 %、至少200 %、至少300 %、至少400 %、至少500 %、 至少600%、至少700%、至少800%、至少900%、至少1，000%或低更高百分比的蛋白酶活 性的修飾的蛋白酶。
[0222] 在某些實施方式中，例如，在木霉屬細胞中，本公開的蛋白酶編碼基因中的至少一 個突變或修飾導致總蛋白酶活性降低到對應親本木霉屬細胞的總蛋白酶活性的49%或更 低（通常具有至少兩個不同蛋白酶基因中的突變），或降低到31%或更低（通常具有至少 三個不同蛋白酶基因中的突變），或降低到13%或更低（通常具有至少四個不同蛋白酶基 因中的突變），或降低到10%或更低（通常具有至少五個不同蛋白酶基因中的突變），或降 低到6. 3%或更低（通常具有至少六個不同蛋白酶基因中的突變），或降低到5. 5%或更低 (通常具有至少七個不同蛋白酶基因中的突變）。
[0223] 本發明的異源多肽
[0224] 本文的本發明進一步涉及通過降低細胞中存在的蛋白酶的活性提高表達異源多 肽的絲狀真菌細胞中該異源多肽的產生。
[0225] 如本文中使用的，"異源多肽"是指非天然存在于本公開的絲狀真菌細胞中（即絲 狀真菌細胞內源）的或在絲狀真菌細胞中與多肽的內源形式相比以提高的水平表達的多 肽。在某些實施方式中，異源多肽是哺乳動物多肽。在其它實施方式中，異源多肽是非哺乳 動物多肽。
[0226] 晡乳動物多狀
[0227] 本公開的哺乳動物多肽可以是具有目標生物活性的任何哺乳動物多肽。如本文中 使用的，"哺乳動物多肽"是在哺乳動物中天然表達的多肽、源自哺乳動物中天然表達的多 肽的多肽或其片段。哺乳動物多肽還包括保持生物活性的肽和寡肽。本公開的哺乳動物多 肽還可以包括結合以形成編碼的產物的兩個或更多個多肽。本公開的哺乳動物多肽可以進 一步包括融合多肽，其包含從至少兩個不同多肽獲得的部分或完整氨基酸序列的組合。哺 乳動物多肽還可以包括任何所公開的哺乳動物多肽的天然存在等位的和工程化的變體及 雜合哺乳動物多肽。
[0228] 哺乳動物多肽可以是天然糖基化的多肽或天然非糖基化的多肽。
[0229] 合適的哺乳動物多肽的實例包括，但不限于免疫球蛋白、抗體、抗原、抗微生物肽、 酶、生長因子、激素、干擾素、細胞因子、白介素、免疫增強劑（immunodilator)、神經遞質、受 體、報告蛋白、結構蛋白和轉錄因子。
[0230] 合適的哺乳動物多肽的特定實例包括，但不限于免疫球蛋白、免疫球蛋白重鏈、免 疫球蛋白輕鏈、單克隆抗體、雜合抗體、F(ab'）2抗體片段、F(ab)抗體片段、Fv分子、單鏈Fv 抗體、二聚化抗體片段、三聚化抗體片段、功能性抗體片段、免疫粘附素、胰島素樣生長因子 1、生長激素、胰島素、干擾素 a 2b、成纖維細胞生長細胞21、人血清白蛋白、駱駝抗體和/或 抗體片段、單域抗體、多聚單域抗體和促紅細胞生成素。
[0231] 合適的哺乳動物多肽的其它實例包括，但不限于氧化還原酶、轉移酶、水解酶、裂 合酶、異構酶、連接酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、糖基轉移酶、脫氧核糖核 酸酶、酯酶、半乳糖苷酶、β -半乳糖苷酶、葡糖苷酶、葡糖醛酸酶、葡糖醛酸酯酶、齒代過氧 化物酶、轉化酶、脂肪酶、氧化酶、磷脂酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、尿激酶、白蛋白、膠原蛋 白、彈性蛋白原和彈性蛋白。
[0232] 非晡乳動物多狀
[0233] 本公開的非哺乳動物多肽可以是具有目標生物活性的任何非哺乳動物多肽。如本 文中使用的，"非哺乳動物多肽"是非哺乳動物生物體如真菌細胞中天然表達的多肽、源自 非哺乳動物生物體中天然表達的多肽的多肽或其片段。非哺乳動物多肽還包括保持生物活 性的肽和寡肽。本公開的非哺乳動物多肽還可以包括結合以形成編碼的產物的兩個或更多 個多肽。本公開的非哺乳動物多肽可以進一步包括融合多肽，其包含從至少兩個不同多肽 獲得的部分或完整氨基酸序列的組合。非哺乳動物多肽還可以包括任何所公開的非哺乳動 物多肽的天然存在的等位的和工程化的變體及雜合非哺乳動物多肽。
[0234] 合適的非哺乳動物多肽的實例包括，但不限于氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧 化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖 苷酶、葡糖淀粉酶、α -葡糖苷酶、β -葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、變構酶（mutanase)、 氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核 酸酶、轉谷氨酰胺酶和木聚糖酶。
[0235] 異源多狀的產牛
[0236] 目標異源多肽使用本領域中已知的方法通過在用于產生異源多肽的營養培養基 中培養包含至少三種具有降低的活性的蛋白酶的本公開絲狀真菌細胞而由該細胞產生。例 如，細胞可以通過搖瓶培養、實驗室中的小規模或大規模發酵（包括連續、分批、分批補料 或固態發酵）或在合適培養基中和允許表達和/或分離多肽的條件下進行的工業化發酵進 行培養。培養使用本領域中已知的方法發生在包含碳和氮源及無機鹽的合適營養培養基 中。合適的培養基可從供應商獲得或可以按照公布的組成（例如，在美國典型培養物培養 中心的目錄中）制備。分泌的多肽可以從培養基直接回收。如果多肽不分泌，它可以從細 胞裂解產物獲得。
[0237] 由包含至少三種具有降低的活性的蛋白酶的本公開絲狀真菌細胞產生的目標 異源多肽可以使用對于異源多肽特異性的本領域中已知的方法檢測。這些檢測方法可 以包括，但不限于使用特異性抗體、高效液相色譜、毛細管色譜、酶產物的形成、酶底物 的消失和SDS-PAGE。例如，可以使用酶分析測定酶的活性。用于測定多種酶的酶活性 的過程是本領域中已知的（參見，例如，0. Schomburg和M. Salzmann (編輯），Enzyme Handbook, Springer-Verlag, New York, 1990)〇
[0238] 所得的異源多肽可以通過本領域中已知的方法分離。例如，目標異源多肽可以通 過常規方法從培養基分離，所述方法包括，但不限于離心、過濾、萃取、噴霧干燥、蒸發和沉 淀。分離的異源多肽然后可以進一步通過本領域中已知的多種過程純化，其包括，但不限 于色譜法（例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水性色譜、層析聚焦色譜和尺寸排阻色譜）、 電泳過程（例如，制備型等電聚焦（IEF)、差異溶解性（例如，硫酸銨沉淀）或萃取（參 見，例如，Protein Purification, J.-C.Janson 和 Lars Ryden 編輯，VCH Publishers, New York, 1989) 〇
[0239] 編碼異源多狀的多核苷酸的制各
[0240] 本公開的異源多核苷酸的序列通過本領域中已知的任何合適的方法制備，其包 括，但不限于直接化學合成或克隆。對于直接化學合成，核酸多聚物的形成通常涉及3' -封 閉和5' -封閉的核苷酸單體順序添加到生長的核苷酸鏈的末端5' -羥基上，其中各次添加 通過生長鏈的末端5' -羥基對添加的單體（其通常是磷衍生物如磷酸三酯、亞磷酰胺等） 的3'位的親核攻擊實現。這種方法是本領域技術人員已知的且在相關文章和文獻中描述 [例如，Matteucci 等，（1980)Tetrahedron Lett 21:719-722;美國專利 No. 4, 500, 707、 5, 436, 327和5, 700, 637]。另外，所需的序列可以通過使用合適的限制性酶分裂DNA、使用 凝膠電泳分離片段和之后經由本領域技術人員中已知的技術如利用聚合酶鏈反應（PCR; 例如美國專利No. 4, 683, 195)從凝膠回收所需的核酸序列而從天然來源分離。
[0241] 本公開的各異源多核苷酸可以并入表達載體中。"表達載體"或"載體"是指轉導、 轉化或感染宿主細胞的化合物和/或組合物，從而使得細胞表達該細胞本來的核酸和/或 蛋白質以外的核酸和/或蛋白質，或以非該細胞原始的方式表達核酸和/或蛋白質。"表達 載體"包含宿主細胞待表達的核酸（一般地是RNA或DNA)的序列。任選地，表達載體也包 括有助于核酸進入宿主細胞的物質，如病毒、脂質體、蛋白質衣殼等。設想用于本公開中的 表達載體包括核酸序列可以插入其中的與任何優選的或需要的操作元件一起的核酸序列。 此外，表達載體必須是可以轉移到宿主細胞中并在其中復制的表達載體。優選的表達載體 是質粒，特別是具有已良好證明的限制性位點并包含核酸序列的翻譯優選的或所需的操作 元件的質粒。這類質粒以及其它表達載體是本領域中公知的。
[0242] 單個多核苷酸的并入可以通過已知的方法完成，其包括，例如，使用限制性酶（如 BamHI、Ec〇RI、HhaI、Xh〇I、XmaI等）切割表達載體（例如質粒）中的特定位點。限制性酶產 生單鏈末端，該單鏈末端可以與具有與切割的表達載體的末端互補的末端序列或合成為具 有序列與切割的表達載體的末端互補的末端序列的多核苷酸退火。退火使用適宜的酶（例 如，DNA連接酶）進行。如本領域技術人員理解的，表達載體和所需的多核苷酸兩者經常用 相同的限制性酶切割，從而確保表達載體的末端和多核苷酸的末端彼此互補。另外，DNA連 接體可以用于幫助將核酸序列連接到表達載體中。
[0243] -系列的單個多核苷酸也可以通過利用本領域中已知的方法（例如，美國專利 No. 4, 683, 195)進行組合。
[0244] 例如，所需的多核苷酸開始可以各自在單獨的PCR中產生。之后，設計特異性引物 以使得PCR產物的末端包含互補序列。當PCR產物混合、變性和再退火時，在其3'末端具 有匹配序列的鏈重疊并可以起到彼此的引物的作用。這種重疊通過DNA聚合酶延伸以產生 其中原始序列被"剪接"到一起的分子。以這種方式，一系列的單個多核苷酸可以"剪接"到 一起并隨后同時轉導到宿主細胞中。因此，實現多個多核苷酸中各多核苷酸的表達。
[0245] 單個多核苷酸或"剪接"的多核苷酸然后并入表達載體中。本公開對于多核苷 酸并入表達載體中的方法沒有限制。本領域普通技術人員熟悉用于將多核苷酸并入表達 載體中的必要步驟。典型的表達載體包含需要的多核苷酸，在其之前是一個或多個調控 區域以及核糖體結合位點，例如大腸桿菌中的長度3-9個核苷酸并位于起始密碼子上游 3-11 個核苷酸的核苷酸序列。參見 Shine 和 Dalgarno (1975) Nature 254(5495) :34-38 及 Steitz(1979)Biological Regulation and Development (編者 Goldberger, R. F.)，1:349-399(Plenum, New York)。
[0246] 如本文中使用的，術語"可操作地連接"是指其中控制序列相對于DNA序列或多核 苷酸的編碼序列處于適宜的位置以使得控制序列指導多肽的表達。
[0247] 調控區域包括例如，包含啟動子和操縱基因的那些區域。啟動子與所需的多核苷 酸可操作地連接，從而通過RNA聚合酶啟動多核苷酸的轉錄。操縱基因是與啟動子相鄰的 核酸序列，其包含其中阻遏蛋白可以結合的蛋白質結合結構域。在不存在阻遏蛋白的情況 下，轉錄通過啟動子啟動。當存在阻遏蛋白時，對于操縱基因的蛋白質結合結構域特異性的 阻遏蛋白結合操縱基因，從而抑制轉錄。以這種方式，轉錄的控制基于所使用的特定調控 區域和相應阻遏蛋白的存在或不存在完成。實例包括乳糖啟動子（Lad阻遏蛋白在與乳糖 接觸時改變構象，從而阻止Lad阻遏蛋白結合操縱基因）和色氨酸啟動子（當與色氨酸復 合時，TrpR阻遏蛋白具有結合操縱基因的構象；在不存在色氨酸的情況下，TrpR阻遏蛋白 具有不結合操縱基因的構象）。另一個實例是tac啟動子（參見de Boer等，（1983)Proc Natl Acad Sci USA 80(1) :21-25)。如本領域普通技術人員理解的，這些和其它表達載體 可以用于本公開中，且本公開在這一方面不受限制。
[0248] 雖然任何合適的表達載體可以用于并入所需的序列，但容易獲得的表達載體包 括，但不限于：質粒如 pSC101、pBR322、pBBRlMCS-3、pUR、pEX、pMR100、pCR4、pBAD24、pUC19、 PRS426和噬菌體如Ml 3噬菌體和λ噬菌體，當然，這類表達載體可能僅適合于特定宿主細 胞。但是，本領域技術人員可以容易地通過常規試驗確定是否任何特定表達載體適合于任 何給定宿主細胞。例如，表達載體可以引入宿主細胞中，然后監測宿主細胞的存活力和載體 中包含的序列的表達。另外，可以參考描述表達載體及其對任何特定宿主細胞的適合性的 相關文章和文獻。
[0249] 用于本發明目的（包括所需異源多肽、酶和一種或多種本文描述的催化結構域的 表達）的合適的表達載體包括包含與組成型或誘導型啟動子可操作地連接的編碼所需異 源多肽、酶或催化結構域的多核苷酸的表達載體。用于與這類多核苷酸可操作地連接的特 別適合的啟動子的實例包括來自以下基因的啟動子：gpdA、cbhl、米曲霉TAKA淀粉酶、米 赫根毛霉（Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸性穩 定ct-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶（glaA)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)glaA、米赫根 毛霉脂肪酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖異構酶、構巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰 胺酶、尖孢鐮刀菌胰蛋白酶樣蛋白酶、真菌內α-L-阿拉伯糖酶（abnA)、真菌α-L-阿拉伯 呋喃糖酶A(abfA)、真菌α-L-阿拉伯呋喃糖酶B(abfB)、真菌木聚糖酶（xlnA)、真菌肌醇 六磷酸酶、真菌ATP-合酶、真菌亞基9 (oliC)、真菌磷酸丙糖異構酶（tpi)、真菌醇脫氫酶 (adhA)、真菌α -淀粉酶（amy)、真菌淀粉葡糖苷酶（glaA)、真菌乙酰胺酶（amdS)、真菌甘油 醛-3-磷酸脫氫酶（gpd)、酵母醇脫氫酶、酵母乳糖酶、酵母3-磷酸甘油酸激酶、酵母磷酸丙 糖異構酶、細菌α -淀粉酶、細菌Sp〇2和SS0。這種合適的表達載體和啟動子的實例也描述 于PCT/EP2011/070956中，其全部內容在此通過引入并入本文。
[0250] 何含通討本發明的絲狀直菌細朐產牛的異源多狀的藥物纟目合物
[0251] 在另一個方面，本發明提供包含與藥物可接受的載體一起配制的本公開的絲狀真 菌細胞產生的一種或多種目標異源多肽如哺乳動物多肽的組合物，例如藥物組合物，該絲 狀真菌細胞具有至少三種降低的蛋白酶的活性且進一步包含編碼異源多肽的重組多核苷 酸。本發明的藥物組合物也可以在組合療法中施用，即與其它的藥劑組合。例如，組合療法 可以包括與至少一種另外的治療劑組合的目標哺乳動物多肽。
[0252] 如本文中使用的，"藥物可接受的載體"包括生理相容的任何和所有的溶劑、分散 介質、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。優選地，載體適合于靜脈內、 肌肉內、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用（例如，通過注射或輸注）。取決于施用途徑，活性成 分，即目標哺乳動物多肽，可以包被在材料中以保護化合物免于酸和可滅活該化合物的其 它自然條件的作用。
[0253] 本發明的藥物組合物可以包括一種或多種藥物可接受的鹽。"藥物可接受的鹽"是 指保持母體化合物的所需生物活性且不施加任何不希望的毒理學效應的鹽（參見，例如， Berge, S. M.等（1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19)。這類鹽的實例包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸 加成鹽包括由非毒性無機酸如鹽酸、硝酸、磷酸，硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等衍生的那 些，以及由非毒性有機酸如脂族單-和二羧酸、苯基取代的鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳香酸、月旨 族和芳族磺酸等衍生的那些。堿加成鹽包括由堿土金屬如鈉、鉀、鎂、鈣等衍生的那些，以及 由非毒性有機胺如Ν，Ν' -二芐基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二 胺、普魯卡因等衍生的那些。
[0254] 發明的藥物組合物也可以包括藥物可接受的抗氧化劑。藥物可接受的抗氧化劑 的實例包括：（1)水溶性抗氧化劑如抗壞血酸、鹽酸半胱氨酸、硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉、亞 硫酸鈉等；（2)油溶性抗氧化劑如抗壞血酸棕櫚酸鹽、丁羥基茴香醚（ΒΗΑ)、丁基羥基甲苯 (ΒΗΤ)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚等；和（3)金屬螯合劑如檸檬酸、乙二胺四乙酸 (EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
[0255] 可以用于發明的藥物組合物中的合適的水性和非水性載體的實例包括水、乙醇、 多元醇（如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）及其合適的混合物、植物油如橄欖油及可注射有機 酯如油酸乙酯。適當的流動性可例如通過使用包衣材料如卵磷脂、通過保持所需的顆粒尺 寸（在分散體的情況中）和通過使用表面活性劑維持。
[0256] 這些組合物也可以包含輔劑如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。防止微生物的存 在可以通過消毒過程和通過包括各種抗細菌劑和抗真菌劑（例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁 醇、苯酚、山梨酸等）來確保。也可能需要的是包括等滲劑如糖、氯化鈉等到組合物中。另 夕卜，注射藥物形式的延長吸收可通過包括延遲吸收的試劑如單硬脂酸鋁和明膠獲得。
[0257] 藥物可接受的載體包括無菌水性溶液或分散液和用于即時制備無菌注射溶液或 分散液的無菌粉末。用于藥物活性物質的這類介質和試劑的使用是本領域中已知的。除非 任何常規的介質或試劑與活性化合物不相容，其在本發明的藥物組合物中的使用是可預期 的。補充的活性化合物也可以合并到組合物中。
[0258] 治療組合物通常必須在制造和儲存條件下是無菌的和穩定的。組合物可以配制為 溶液、微乳液、脂質體或其它適合于高藥物濃度的有序結構。載體可以是包含例如水、乙醇、 多元醇（如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）及其合適的混合物的溶劑或分散介質。適當 的流動性可例如通過使用包衣材料如卵磷脂、通過保持所需的顆粒尺寸（在分散體的情況 中）和通過使用表面活性劑維持。在許多情況中，優選的是組合物中包括等滲劑，例如糖、 多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。可注射組合物的延長吸收可通過在組合物中包括延遲 吸收的試劑例如單硬脂酸鹽和明膠獲得。
[0259] 可以如下制備無菌注射溶液：根據需要在具有上文所列舉的一種組分或組分組合 的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物，接著進行無菌微濾。一般而言，通過將活性化合物 摻入無菌媒介中來制備分散體，所述無菌媒介含有基礎分散介質及所需的那些上文所列舉 的組分中的其它組分。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況中，特定制備方法是自 先前無菌過濾的溶液產生活性成分加任何其它需要的成分的粉末的真空干燥和冷凍干燥 (凍干）。
[0260] 可以與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量隨待治療的受試者和特定 的施用方式變化。可以與載體材料組合以產生單一劑型的活性成分的量一般是產生治療效 果的該組合物的量。一般地，在百分之一百中，這一量在約0.01% -約99%的活性成分的 范圍內，優選約〇. 1 % -約70%，最優選與藥物可接受的載體組合的約1 % -約30%的活性 成分。
[0261] 劑量方案經調整以提供最佳的所需反應（例如，治療反應）。例如，可以施用單一 的大劑量，可以隨時間施用幾個分開的劑量或可以如治療狀況的緊急性所指示的成比例地 降低或提高劑量。特別有利的是配制單位劑型的腸胃外組合物以實現施用方便性和劑量均 勻性。如本文中使用的，單位劑型是指適合作為用于待治療受試者的單一劑量的物理離散 單元；各單元包含與需要的藥物載體結合的經計算以產生所需治療效果的預定量的活性化 合物。本發明的單位劑型的規格由以下方面決定并直接取決于以下方面：(a)活性化合物 的獨特特征和待獲得的特定治療效果和（b)組合這種活性化合物以處理個體的敏感性的 領域中固有的限制。
[0262] 對于目標哺乳動物多肽的施用，特別是其中哺乳動物多肽是抗體的情況中，劑量 范圍為宿主體重的約〇· 〇〇〇l-l〇〇mg/kg，更通常0· 01-5mg/kg。例如，劑量可以是0· 3mg/kg 體重，lmg/kg體重，3mg/kg體重，5mg/kg體重或10mg/kg體重或者在l-10mg/kg的范圍內。 示例性的治療方案需要每周施用一次、每兩周一次、每三周一次、每四周一次、一月一次、每 3個月一次或每3-6個月一次。用于抗體的特定劑量方案可以包括經靜脈內施用的lmg/kg 體重或3mg/kg體重，其中抗體使用以下給藥時間表之一給予：（i)每四周六個劑量，然后每 三個月；（ii)每三周；（iii)3mg/kg體重一次，之后每三周lmg/kg體重。
[0263] 或者，目標哺乳動物多肽可以作為持續釋放制劑施用，在該情況中需要較低頻率 的施用。劑量和頻率根據施用的物質在患者中的半衰期變化。一般地，人抗體顯示最長的 半衰期，之后是人源化抗體、嵌合抗體和非人抗體。施用劑量和頻率可以根據治療是預防性 的還是治療性的而變化。在預防性應用中，相對低的劑量在長時間段中以相對較低的頻率 施用。一些患者在其剩余生存期中持續接受治療。在治療性應用中，有時需要以相對短的 間隔施用相對高的劑量直到疾病進展降低或終止，且優選直到患者顯示疾病癥狀的部分或 完全改善。隨后，患者可以施用預防性方案。
[0264] 本公開的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化以獲得對于特定患者、 組成和施用途徑有效實現所需治療反應而對患者非毒性的活性成分量。選擇的劑量水平取 決于多種藥代動力學因素，包括所采用的本發明特定組合物或其酯、鹽或氨基化合物的活 性、施用途徑、施用時間、使用的特定化合物的排泄率、治療持續時間、與使用的特定組合物 組合的其它藥物、化合物和/或物質、所治療患者的年齡、性別、體重、狀況、總體健康和先 前病史及醫學領域中公知的類似因素。
[0265] 本公開的免疫球蛋白的"治療有效劑量"優選導致疾病癥狀嚴重性的降低、無疾病 癥狀期的頻率和持續時間的增加或者防止由于患病導致的損害或殘疾。例如，對于腫瘤的 治療，"治療有效劑量"優選相對于未治療受試者抑制細胞生長或腫瘤生長至少約20%，更 優選至少約40 %，甚至更優選至少約60 %，且再更優選至少約80 %。化合物抑制腫瘤生長 的能力可以在指示人腫瘤中的效力的動物模型系統中評估。或者，組合物的這一性質可以 通過熟練的實施者已知的分析方法檢驗化合物體外抑制這種抑制作用的能力來評估。治療 有效量的治療化合物可以減小腫瘤尺寸或以其它方式改善受試者的癥狀。本領域技術人員 能夠基于如受試者體型、受試者癥狀的嚴重性和所選擇的特定組合物或施用途徑的因素確 定這種量。
[0266] 本公開的組合物可以使用本公開中已知的多種方法中的一種或多種經由一種或 多種施用途徑施用。如本領域技術人員理解的，施用途徑和/或方式根據所需的結果變化。 用于本發明的結合部分的特定施用途徑包括靜脈內、肌肉內、皮內、腹膜內、皮下、脊髓或其 它腸胃外施用途徑，例如通過注射或輸注。如本文中使用的，短語"腸胃外施用"意思是腸 施用和局部施用以外的施用方式，通常是通過注射，且包括，但不限于靜脈內、肌肉內、動脈 內、鞘內、囊內、眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、 脊柱內、硬膜外及胸骨內注射和輸注。
[0267] 或者，根據本公開的哺乳動物多肽可以經由非腸胃外途徑如局部、表皮或粘膜施 用途徑施用，例如，鼻內、口服、陰道、直腸、舌下或局部。
[0268] 活性化合物可以用保護化合物免于快速釋放的載體制備，如控釋制劑，包括植入 物、透皮貼片和微囊化遞送系統。可以使用生物可降解的生物相容性聚合物如乙烯乙酸乙 烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制備這類制劑的許多方法獲得專利 或一般為本領域技術人員已知（參見，例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson 編輯，Marcel Dekker，Inc.，New York, 1978)。
[0269] 治療組合物可以利用本領域中已知的醫療機械施用。例如，在特定實施方式 中，本發明的治療組合物可以利用無針皮下注射裝置施用，如美國專利No. 5, 399, 163 ; 5, 383, 851 ;5, 312, 335 ;5, 064, 413 ;4, 941，880 ;4, 790, 824 或 4, 596, 556 中公開的裝置。 可用于本發明中的公知植入物和模塊的實例包括：美國專利No. 4, 487, 603,其公開了用于 以受控速率分配藥物的可植入微輸注泵；美國專利No. 4, 486, 194,其公開了用于通過皮膚 施用藥物的治療裝置；美國專利No. 4, 447, 233,其公開了用于以精確輸注速率遞送藥物的 藥物輸注泵；美國專利No. 4, 447, 224,其公開了用于連續藥物遞送的可變流量植入輸注裝 置；美國專利No. 4, 439, 196,其公開了具有多腔區室的滲透性藥物遞送系統和美國專利 No. 4, 475, 196,其公開了滲透性藥物遞送系統。
[0270] 在某些實施方式中，根據本公開的哺乳動物多肽的使用是用于治療可用治療性抗 體治療的任何疾病。
[0271] 本發明的絲狀真菌細胞
[0272] 本文的本發明還涉及通過降低或消除表達異源多肽的細胞中存在的且催化異源 多肽降解的至少三種蛋白酶的活性來提高絲狀真菌細胞中異源多肽如哺乳動物多肽的產 生水平。降低或消除表達異源多肽的絲狀真菌細胞中存在的蛋白酶的活性提高了表達的重 組多肽的穩定性，其導致異源多肽產生水平的提高。絲狀真菌細胞中存在的蛋白酶的活性 可以例如通過修飾編碼蛋白酶的基因降低。
[0273] "絲狀真菌細胞"包括來自真菌和卵菌亞門的所有絲狀形式的細胞（如由 Hawksworth 等定義的，Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第 8 版，1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK)。絲狀真菌細胞一般特征 在于由幾丁質、纖維素、葡聚糖、脫乙酰殼多糖、甘露聚糖和其它復合多糖組成的菌絲體壁。 營養性生長是通過菌絲延伸且碳分解代謝是專性需氧的。相反，酵母如釀酒酵母的營養性 生長是通過單細胞菌體的出芽和碳分解代謝可以是發酵的。
[0274] 任何絲狀真菌細胞可以用于本公開中，只要它在用核酸序列轉化和/或者經修飾 或突變以降低蛋白酶活性后保持存活。優選地，絲狀真菌細胞不受必要核酸序列轉導、蛋白 質（例如哺乳動物蛋白）的后續表達或得到的中間體的不利影響。
[0275] 合適的絲狀真菌細胞的實例包括，但不限于來自支頂孢屬、曲霉屬、鐮孢菌屬、 腐質霉屬、毛霉屬、毀絲霉屬、鏈抱霉屬、青霉屬、柱霉屬、梭抱殼屬、彎頸霉屬或木霉屬困 株的細胞。在某些實施方式中，絲狀真菌細胞來自木霉屬、支頂孢屬、曲霉屬、短梗霉屬、 隱球菌屬、金抱子菌屬、Chrysosporium lucknowense、Filibasidium、鏈抱霉屬、赤霉屬、 Magnaporthe、毛霉屬、毀絲霉屬、漆斑菌屬、新美鞭菌屬（Neocallimastix)、鏈孢霉屬、擬青 霉屬（Paecilomyces)、青霉屬、瘤胃壺菌屬（Piromyces)、裂裙菌屬（Schizophyllum)、踝節 菌屬（Talaromyces)、Thermoascus、梭孢殼屬或彎頸霉屬菌株。
[0276] 本公開的曲霉屬真菌細胞可以包括，但不限于棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori)、棒曲霉（Aspergillus clavatus)、黃 曲霉、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、煙曲霉（Aspergillus fumigatus)、日本曲霉 (Aspergillus japonicus)、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉或土曲霉。
[0277] 本公開的鏈孢霉屬真菌細胞可以包括，但不限于粗糙鏈孢霉。
[0278] 在某些實施方式中，絲狀真菌細胞不是曲霉屬細胞.
[0279] 在某些實施方式中，絲狀真菌細胞選自木霉屬（里氏木霉）、鏈孢霉（粗糙鏈孢 霉）、青霉屬（產黃青霉）、曲霉屬（構巢曲霉、黑曲霉和米曲霉）、毀絲霉屬（嗜熱毀絲霉） 和金抱子菌屬（C. lucknowense)。
[0280] 在某些實施方式中，絲狀真菌細胞是木霉屬真菌細胞。本公開的木霉屬真菌細 胞可以源自野生型木霉屬菌株或其突變體。合適的木霉屬真菌細胞的實例包括，但不限 于哈茨木霉（Trichoderma harzianum)、康寧木霉（Trichoderma koningii)、長枝木霉 (Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、深綠木霉、綠木霉、綠色木霉及其可選的有性 形式（即肉座菌（Hypocrea))。
[0281] 破壞絲狀真菌細胞的基因和培養絲狀真菌細胞的一般方法，例如，對于青霉 屬，公開于 Kopke 等(2010)Application of the Saccharomyces cerevisiae FLP/ FRT recombination system in filamentous fungi for marker recycling and construction of knockout strains devoid of heterologous genes. Appl Environ Microbiol.76 (14):4664-74. doi:10. 1128/AEE 00670-10 中，對于曲霉屬，公開于 Maruyama 和 Kitamoto (2011)，Targeted Gene Disruption in Koji Mold Aspergillus oryzae, James A. Williams (編輯），Strain Engineering:Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 765, D0I10. 1007/978-l-61779-197-0_27 中，對于鏈孢霉屬， 公開于 Collopy 等（2010)High-throughput construction of gene deletion cassettes for generation of Neurospora crassa knockout strains. Methods Mol Biol.2010 ； 638:33-40. doi: 10. 1007/978-l-60761-611-5_3中和對于毀絲霉屬或金孢子菌屬，公開于 PCT/NL2010/000045 和 PCT/EP98/06496 中。
[0282] 絲狀直菌細朐成分
[0283] 本公開的特定方面涉及具有降低的或沒有至少三種蛋白酶的可檢測的活性和具 有編碼以提高的水平（例如至少兩倍高的水平）產生的異源多肽的重組多核苷酸的絲狀真 菌細胞。本公開的其它方面涉及具有降低的或沒有至少三種蛋白酶的可檢測的活性的木 霉屬真菌細胞，該至少三種蛋白酶選自pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pepll、pepl2、 tspl、slpl、slp2、slp7、gapl和gap2,其中細胞進一步包含編碼以比對應親本木霉屬細胞 中多肽的產生水平高至少兩倍的水平產生的哺乳動物多肽的重組多核苷酸。在某些實施方 式中，絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞具有降低的或沒有至少四種、至少五種、至少六種、 至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少i^一種、至少十二和或更多種蛋白酶的活 性。
[0284] 降低的蛋白酶的表達
[0285] 本公開的絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞中至少三種蛋白酶的降低的活性可以 是蛋白酶表達降低或消除的結果。在一些實施方式中，至少三種蛋白酶的降低的或消除的 表達是對催化結構域、編碼區域或編碼各蛋白酶的基因的編碼區域的表達所需的控制區域 進行修飾的結果。在其它實施方式中，蛋白酶的降低的或消除的表達是引入、替換和/或移 除基因或編碼各蛋白酶的基因的轉錄或翻譯需要的控制序列中的一個或多個核苷酸的結 果。
[0286] 在進一步的實施方式中，蛋白酶的降低的或消除的表達是將各包含與各基因同源 的核酸片段的破壞性核酸構建體插入編碼各蛋白酶的基因中的結果，這產生同源性區域的 重復和將構建體DNA并入重復區域之間。在其它實施方式中，蛋白酶的降低的或消除的表 達是編碼各蛋白酶的基因的基因轉化的結果。在再其它的實施方式中，蛋白酶的降低的或 消除的表達是通過對于編碼各蛋白酶的基因中的各基因特異性的反義多核苷酸或RNAi構 建體產生的結果。在一個實施方式中，RNAi構建體對于編碼天冬氨酸蛋白酶如pep-型蛋 白酶、胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶如tspl、谷氨酸蛋白酶如gap-型蛋白酶、枯草溶菌素蛋白 酶如sip-型蛋白酶或Sedolisin蛋白酶如tppl或slp7蛋白酶的基因是特異性的。在一 個實施方式中，RNAi構建體對于編碼sip-型蛋白酶的基因是特異性的。在一個實施方式 中，RNAi構建體對于編碼slp2、slp3、slp5或slp6的基因是特異性的。在一個實施方式 中，RNAi構建體對于兩種或更多種蛋白酶是特異性的。在一個實施方式中，兩種或更多種 蛋白酶是pep-型蛋白酶中的任一種、胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶中的任一種、sip-型蛋白酶 中的任一種、gap-型蛋白酶中的任一種和/或Sedolisin蛋白酶的任一種。在一個實施方 式中，兩種或更多種蛋白酶是slp2、slp3、slp5和/或slp6。在一個實施方式中，RNAi構 建體包含表22. 2的核酸序列中的任一種。
[0287] 在一些實施方式中，編碼蛋白酶的基因各包含降低或消除相應蛋白酶活性的突 變。在其它實施方式中，突變降低或消除各蛋白酶的表達。在進一步的實施方式中，突變 是降低或消除相應蛋白酶活性的敲除突變、截斷突變、點突變、錯義突變、置換突變、移碼突 變、插入突變、重復突變、擴增突變、易位突變或反轉突變。
[0288] 在一些實施方式中，突變是蛋白酶編碼基因的刪除。在其它實施方式中，突變是編 碼蛋白酶的催化結構域的蛋白酶編碼基因部分的刪除。在再其它的實施方式中，突變是編 碼蛋白酶的催化結構域的蛋白酶編碼基因部分中的點突變。
[0289] 蛋白酶基因的組合
[0290] 本公開的絲狀真菌細胞或木霉屬細胞可以包含至少三種、至少四種、至少五種、至 少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種或更多種天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶樣絲 氨酸蛋白酶、枯草溶菌素蛋白酶和/或谷氨酸蛋白酶。在某些實施方式中，蛋白酶由pep-型 蛋白酶基因、gap-型蛋白酶基因或sip-型蛋白酶基因編碼。在一些實施方式中，p印-型 蛋白酶基因選自pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pepll和pepl2。在其它實施方式中， gap-型蛋白酶基因選自gapl和gap2。在進一步的實施方式中，sip-型蛋白酶基因選自 slpl、slp2、slp3 和 slp7 或選自 slpl、slp2、slp3、slp5、slp6、slp7 和 slp8。在某些優選 的實施方式中，sip-型蛋白酶基因是slpl。
[0291] 在其它實施方式中，蛋白酶由選自pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、pep7、pep8、 pepll、pepl2、tspl、slpl、slp2、slp3、slp5、slp6、slp7、slp8、gapl、gap2 和 tppl 的基因 編碼。在一些實施方式中，絲狀真菌細胞，例如，木霉屬細胞具有降低的或沒有至少三種或 至少四種選自 pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pepll、pepl2、tspl、slpl、slp2、slp3、 slp7、gapl和gap2的蛋白酶編碼基因的表達水平。在某些實施方式中，絲狀真菌細胞，例 如木霉屬細胞具有降低的或沒有至少三種選自pepl、tspl和slpl的蛋白酶編碼基因的表 達水平。在其它實施方式中，絲狀真菌細胞或木霉屬細胞具有降低的或沒有至少三種選自 gapl、slpl和p印1的蛋白酶編碼基因的表達水平。在一些實施方式中，絲狀真菌細胞，例如 木霉屬細胞具有降低的或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、p印1和gapl的表達水平。在一些實 施方式中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、pepl、 gapl和p印4的表達水平。在一些實施方式中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的 或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、pepl、gapl、pep4和slpl的表達水平。在一些實施方式中， 絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、p印l、gapl、p印4、 slpl和slp3的表達水平。在一些實施方式中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的 或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、pepl、gapl、pep4、slpl、slp3和pep3的表達水平。在一些實 施方式中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、pepl、 gapl、pep4、slpl、slp3、pep3和pep2的表達水平。在一些實施方式中，絲狀真菌細胞，例如 木霉屬細胞具有降低的或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、pepl、gapl、pep4、slpl、slp3、pep3、 p印2和p印5的表達水平。在一些實施方式中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的 或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、pepl、gapl、pep4、slpl、slp3、pep3、pep2、pep5 和 tspl 的表 達水平。在一些實施方式中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的或沒有蛋白酶編碼 基因 slp2、pepl、gapl、pep4、slpl、slp3、pep3、pep2、pep5、tspl 和 slp7 的表達水平。在 一些實施方式中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、 pepl、gapl、pep4、slpl、slp3、pep3、pep2、pep5、tspl、slp7 和 slp8 的表達水平。在一些實 施方式中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬細胞具有降低的或沒有蛋白酶編碼基因 slp2、pepl、 gapl、pep4、slpl、slp3、pep3、pep2、pep5、tspl、slp7、slp8 和 gap2 的表達水平。
[0292] 在某些實施方式中，絲狀真菌細胞的至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至 少七種、至少八種、至少九種、至少十種或更多種蛋白酶具有降低的蛋白酶活性，其中具有 野生型活性的相應蛋白酶各具有與SEQ ID N0:l-16、17-36、37-57、58-65、66-81、82-97、 98-117、118-128、129-144、166-181、182-185 或 SEQ ID N0:491-588 的氨基酸序列至少 70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少 98%、至少99%或100%相同的氨基酸序列。在其中絲狀真菌細胞是具有一種或多種蛋白 酶的降低的蛋白酶活性的木霉屬真菌細胞的實施方式中，其中具有野生型活性的相應蛋白 酶各具有與SEQIDN0:1、17、37、58、66、82、98、118、129、166或182或者SEQIDN0:507、 SEQ ID N0:522或SEQ ID N0:530的氨基酸序列至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的氨基酸序 列。
[0293] 異源多肽
[0294] 本公開的絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞包含編碼異源多肽的重組多核苷酸。在 某些實施方式中，異源多肽是哺乳動物多肽。在其它實施方式中，異源多肽是非哺乳動物多 肽。
[0295] 在其中絲狀真菌細胞包含編碼哺乳動物多肽的重組多核苷酸的實施方式中，哺乳 動物多肽可以是非糖基化的哺乳動物多肽、糖基化的哺乳動物多肽或其組合，其包括，但不 限于免疫球蛋白、抗體、生長因子和干擾素。在一些實施方式中，哺乳動物多肽是免疫球蛋 白或抗體。在其中絲狀真菌細胞包含編碼免疫球蛋白或抗體的重組多核苷酸的實施方式 中，絲狀真菌細胞，例如木霉屬真菌細胞可以具有降低的或沒有至少三種或至少四種選自 pepl、pep3、pep4、pep8、pepll、pepl2、tspl、slpl、slp2、slp7、gapl 和 gap2 的蛋白酶編碼 基因的表達。在某些優選的實施方式中，細胞，例如木霉屬真菌細胞，包含編碼免疫球蛋白 或抗體的重組多核苷酸并具有降低的或沒有蛋白酶編碼基因 slpl、slp2、slp3、tspl、p^)l、 區&口146口446口346口246口5和83口2的表達。在某些優選的實施方式中，細胞，例如木霉屬 真菌細胞，包含編碼免疫球蛋白或抗體的重組多核苷酸并具有降低的或沒有蛋白酶編碼基 因 p印l、tspl、slpl和gapl的表達。在其它實施方式中，細胞包含編碼免疫球蛋白或抗體 的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 pepl、tspl、slpl、gapl和pep4的表達。在 其它實施方式中，細胞包含編碼免疫球蛋白或抗體的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編 碼基因 slpl、slp2和slp3的表達。在其它實施方式中，細胞包含編碼免疫球蛋白或抗體的 重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 slpl、slp2、slp3和tspl的表達。在其它實 施方式中，細胞包含編碼免疫球蛋白或抗體的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 slpl、slp2、slp3、tspl和pepl的表達。在其它實施方式中，細胞包含編碼免疫球蛋白或抗 體的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 slpl、slp2、slp3、tspl、pepl和gapl的表 達。在其它實施方式中，細胞包含編碼免疫球蛋白或抗體的重組多核苷酸并具有降低的蛋 白酶編碼基因 slpl、slp2、slp3、tspl、pepl、gapl和pep4的表達。在其它實施方式中，細 胞包含編碼免疫球蛋白或抗體的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 slpl、slp2、 81口348口1、口6口1、8&口1、口6口4和口6口3的表達。在其它實施方式中，細胞包含編碼免疫球蛋白 或抗體的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 slpl、slp2、slp3、tspl、pepl、gapl、 p印4、p印3和p印2的表達。在其它實施方式中，細胞包含編碼免疫球蛋白或抗體的重組多 核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 slpl、slp2、slp3、tspl、pepl、gapl、pep4、pep3、pep2 和pep5的表達。
[0296] 在其它實施方式中，絲狀真菌細胞包含編碼生長因子、干擾素、細胞因子或白介素 的重組多核苷酸。在其中絲狀真菌細胞，例如木霉屬真菌細胞包含編碼生長因子、干擾素、 細胞因子、人血清白蛋白或白介素的重組多核苷酸的實施方式中，絲狀真菌細胞可以具有 降低的或沒有至少三種或至少四種選自pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、gapl、gap2、 slpl、slp2、slp7和tspl的蛋白酶編碼基因的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生 長因子、干擾素、細胞因子、人血清白蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編 碼基因 pepl、tspl、slpl、gapl和gap2的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生長因 子、干擾素、細胞因子、人血清白蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基 因 slpl、slp2、pepl、gapl、pep4、slp7、pep2、pep3、pep5、tspl 和 gap2 的表達。在其它實 施方式中，細胞，例如木霉屬真菌細胞，包含編碼生長因子、干擾素、細胞因子、人血清白蛋 白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 pepl、tspl、slpl、gapl、gap2和 P印4的表達。在進一步的實施方式中，細胞包含編碼生長因子的重組多核苷酸并具有降低 的選自pepl、pep2、pep3、pep4和pep5的pep-型蛋白酶基因的表達。在某些優選的實施 方式中，生長因子是IGF-1或干擾素是干擾素- a 2b。在某些實施方式中，細胞包含編碼生 長因子、干擾素、細胞因子、人血清白蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編 碼基因 P印l、gapl和p印4的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生長因子、干擾素、細 胞因子、人血清白蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 P印l、gapl、 p印4和slp7的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生長因子、干擾素、細胞因子、人血 清白蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 pepl、gapl、pep4、slp7 和slp2的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生長因子、干擾素、細胞因子、人血清白 蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 pepl、gapl、pep4、slp7、slp2 和p印2的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生長因子、干擾素、細胞因子、人血清白 蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 pepl、gapl、pep4、slp7、slp2、 p印2和p印3的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生長因子、干擾素、細胞因子、人血 清白蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 P印1、gap 1、p印4、slp7、 slp2、pep2、p印3和p印5的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生長因子、干擾素、細 胞因子、人血清白蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編碼基因 P印l、gapl、 pep4、slp7、slp2、pep2、pep3、pep5和slpl的表達。在某些實施方式中，細胞包含編碼生 長因子、干擾素、細胞因子、人血清白蛋白或白介素的重組多核苷酸并具有降低的蛋白酶編 碼基因 pepl、gapl、pep4、slp7、slp2、pep2、pep3、pep5、slpl 和 tspl 的表達。
[0297] 在某些實施方式中，哺乳動物多肽以比沒有降低的蛋白酶活性的對應親本絲狀真 菌細胞中多肽的產生水平高至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、 至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、 至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更高倍的水平產生。 在其它實施方式中，哺乳動物多肽以比對應親本絲狀真菌細胞中多肽的全長形式的產生水 平更高的水平以全長形式產生。
[0298] 在其中絲狀真菌細胞包含編碼非哺乳動物多肽的重組多核苷酸的實施方式中，非 哺乳動物多肽可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、角質 酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、 β -葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌 醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶或木聚糖酶。在其中絲狀 真菌細胞包含編碼非哺乳動物多肽的重組多核苷酸的實施方式中，絲狀真菌細胞可以具有 降低的或沒有至少三種、至少四種、至少五種或至少六種選自pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、 pep8、pepll、pepl2、tspl、slpl、slp2、slp3、gapl和gap2的蛋白酶編碼基因的可檢測的表 達。在某些實施方式中，非哺乳動物多肽以比對應親本絲狀真菌細胞中多肽的產生水平高 至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少 15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至 少75倍、至少80倍、至少90倍、至少100倍或更高倍的水平產生。在其它實施方式中，非 哺乳動物多肽以比對應親本絲狀真菌細胞中多肽的全長形式的產生水平更高的水平以全 長形式產生。
[0299] 降低的另外的蛋白酶的活性
[0300] 在一些實施方式中，本公開的絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞也具有降低的一種 或多種另外的蛋白酶的活性。在某些實施方式中，一種或多種另外的蛋白酶的表達水平降 低。在某些優選的實施方式中，編碼一種或多種另外的蛋白酶的基因各包含降低相應蛋白 酶活性的突變。一種或多種另外的蛋白酶編碼基因可以是pep7、tppl、gap2、slp3、slp5、 slp6、slp7 或 slp8〇
[0301] 在某些實施方式中，當絲狀真菌細胞是曲霉屬細胞時，總蛋白酶活性降低到其中 蛋白酶不具有降低的活性的對應親本曲霉屬細胞中總蛋白酶活性的50%或更低。
[0302] 在某些實施方式中，總蛋白酶活性在本公開的細胞（例如木霉屬細胞）中降低到 其中蛋白酶不具有降低的活性的對應親本絲狀真菌細胞中總蛋白酶活性的49%或更低、 31%或更低、13%或更低、10%或更低、6. 3%或更低或者5. 5%或更低。
[0303] 另外的重組修飾
[0304] 在某些實施方式中，本公開的絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞也具有降低的長醇 基-P-Man:Man(5)GlcNAc(2)-PP-長醇基甘露糖基轉移酶的活性。長醇基-P-Man:Man(5) GlcNAc (2)-PP-長醇基甘露糖基轉移酶（EC 2. 4. 1. 130)將a -D-甘露糖殘基從長醇-磷 酸D-甘露糖轉移到膜脂連接的寡糖中。通常，長醇基-P-Man:Man (5) GlcNAc (2)-ΡΡ-長醇 基甘露糖基轉移酶通過alg3基因編碼。因此，在某些實施方式中，絲狀真菌細胞具有降低 的ALG3活性，其是由alg3基因編碼的活性。在一些實施方式中，alg3基因包含降低相應 ALG3活性的突變。在某些實施方式中，alg3基因從絲狀真菌細胞刪除。
[0305] 在其它實施方式中，本公開的絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞進一步包含編碼 α-l，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。編碼α-1,2-甘露糖苷酶的多核苷酸可以對于宿主細胞 是內源的，或它可以對于宿主細胞是異源的。這些多核苷酸特別可用于表達從高爾基體轉 移到ER的高甘露糖聚糖而無有效的外-α -2-甘露糖苷酶切割的絲狀真菌細胞。α -1，2-甘 露糖苷酶可以是屬于糖苷水解酶家族47 (cazy.org/GH47_all.html)的I型甘露糖苷酶。 在某些實施方式中，ct -1，2_甘露糖苷酶是列于cazy. org/GH47_characterized. html中的 酶。特別地，α-1，2-甘露糖苷酶可以是切割糖蛋白的ER-型酶如ERa-甘露糖苷酶I EC 3. 2. 1. 113酶亞家族。這類酶的實例包括人a -2-甘露糖苷酶IB (AAC26169)、哺乳動物ER 甘露糖苷酶的組合或絲狀真菌酶如a -1，2-甘露糖苷酶（MDS1)(里氏木霉AAF34579 ;Maras Μ等J Biotech. 77, 2000, 255)。對于ER/高爾基體表達，甘露糖苷酶的催化結構域通常與 靶向肽如HDEL、KDEL或者ER或早期高爾基體蛋白質的部分融合，或與動物或植物甘露糖 苷酶I的內源ER革巴向結構一起表達，參見例如，Callewaert等2001Use of HDEL-tagged Trichoderma reesei mannosyl oligosaccharide 1，2_a -D-mannosidase for N-glycan engineering in Pichia pastoris. FEBS Lett 503:173-178。
[0306] 在進一步的實施方式中，本公開的絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞還包含N-乙 酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域和N-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域。這類催化結構 域可用于在非哺乳動物細胞中表達復合N-聚糖。N-乙酰葡糖胺基轉移酶I (GlcNAc-ΤΙ ; GnTI ;EC 2. 4. 1. 101)催化UDP-N-乙酰基-D-葡糖胺+3-( a -D-甘露糖基）-β -D-甘露糖 基-R〈 = >UDP+3- (2- (N-乙酰基-β -D-葡糖胺基）-a -D-甘露糖基）-β -D-甘露糖基-R 的反應，其中R表示聚糖受體中N-連接的寡糖的其余部分。N-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化 結構域是能夠催化這一反應的N-乙酰葡糖胺基轉移酶I的任何部分。N-乙酰葡糖胺基轉 移酶 II (GlcNAc-ΤΠ ;GnTII ;EC 2. 4. 1. 143)催化 UDP-N-乙酰基-D-葡糖胺 +6-( a -D-甘 露糖基）-β -D-甘露糖基_R〈 = >UDP+6- (2- (Ν-乙酰基-β -D-葡糖胺基）-a -D-甘露糖 基）-β -D-甘露糖基-R的反應，其中R表示聚糖受體中Ν-連接的寡糖的其余部分。Ν-乙 酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域是能夠催化這一反應的Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶II的任 何部分。合適的Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域和Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化 結構域的實例可以在國際專利申請NO.PCT/EP2011/070956中發現。Ν-乙酰葡糖胺基轉移 酶I催化結構域和Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域可以通過單一多核苷酸編碼。在 某些實施方式中，單一多核苷酸編碼包含Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域和Ν-乙酰 葡糖胺基轉移酶II催化結構域的融合蛋白。或者，Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域 可以通過第一多核苷酸編碼和Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域可以通過第二多核苷 酸編碼。
[0307] 在其中絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞包含Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構 域和Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域的實施方式中，細胞還可以包含編碼甘露糖苷 酶II的多核苷酸。甘露糖苷酶Π 能夠切割GlcNAcMan5的Man5結構以生成GlcNAcMan3， 且如果與GnTII的催化結構域的作用結合，以生成GO ;且進一步地，與半乳糖基轉移酶的 催化結構域的作用結合，以生成G1和G2。在某些實施方式中，II-型甘露糖苷酶屬于糖苷 水解酶家族38(cazy. org/GH38_all. html)。這類酶的實例包括人酶AAC50302、黑腹果蠅 (D.melanogaster)酶（Van den Elsen J.M.等（2001)EMB0 J. 20:3008-3017)、具有按照 TOB-記錄號1HTY的3D結構的那些或以PBD中的催化結構域指代的其它酶。對于ER/高 爾基體表達，甘露糖苷酶的催化結構域通常與N-末端靶向肽融合，例如使用國際專利申請 No. PCT/EP2011/070956中所列的或SEQ ID NO:589-594的靶向肽。在用II-型甘露糖苷酶 的甘露糖苷酶催化結構域轉化后，選擇有效產生GlcNAc2Man3、GlcNAclMan3或G0的菌株。
[0308] 在可以與前述實施方式結合的某些實施方式中，絲狀真菌細胞進一步包含編碼 UDP-GlcNAc轉運蛋白的多核苷酸。
[0309] 在可以與前述實施方式結合的某些實施方式中，絲狀真菌細胞進一步包含 編碼β-1，4-半乳糖基轉移酶的多核苷酸。一般地，β-1，4-半乳糖基轉移酶屬于 CAZy半乳糖基轉移酶家族7 (cazy.org/GT7_all.html)。可用的i3 4GalT酶的實例包 括@46&11'1，例如牛（黃牛）酶八八八3〇534.1(511&卩6『111^等？1'〇(3.似1:1.八〇&(1.3(3；[· U.S.A. 83(6)，1573-1577(1986))、人酶（Guo S.等Glycobiology 2001，11:813-20)和小鼠 酶 AAA37297 (Shaper, N. L.等 1998J. Biol. Chem. 263 (21)，10420-10428)。在其中絲狀真菌 細胞包含編碼半乳糖基轉移酶的多核苷酸的本發明的某些實施方式中，絲狀真菌細胞還包 含編碼UDP-Gal 4表異構酶和/或UDP-Gal轉運蛋白的多核苷酸。在其中絲狀真菌細胞 包含編碼半乳糖基轉移酶的多核苷酸的本發明的某些實施方式中，乳糖可以代替葡萄糖用 作培養宿主細胞時的碳源。培養基可以在pH 4. 5和7.0之間或5.0和6. 5之間。在其中 絲狀真菌細胞包含編碼半乳糖基轉移酶的多核苷酸和任選的編碼M)P-Gal 4表異構酶和/ 或UDP-Gal轉運蛋白的多核苷酸的本發明的某些實施方式中，二價陽離子如Mn2+、Ca2+或 Mg2+可以添加到細胞培養基中。
[0310] 在可以與前述實施方式結合的某些實施方式中，宿主細胞中α-l，6-甘露糖基轉 移酶的活性水平與野生型宿主細胞中的活性水平相比降低。在某些實施方式中，絲狀真菌 具有與野生型絲狀真菌細胞中的表水平相比降低的ochl基因的表達水平。
[0311] 另一個方面包括在絲狀真菌細胞中產生Man3GlcNAc2N_聚糖[即Man a 3 (Man α 6) Man β 4GlcNAc β 4GlcNAc]的方法，包括提供具有編碼異源多肽的重組多核苷酸和具有與 野生型絲狀真菌細胞中的活性水平相比降低的alg3甘露糖基轉移酶活性水平的絲狀真 菌細胞，和培養該絲狀真菌細胞以產生Man3GlcNAc2聚糖的步驟，其中Man3GlcNAc2聚糖 占絲狀真菌細胞分泌的中性N-聚糖的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少 50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% (mol%)。在特定實施方式中， Man3GlcNAc2N-聚糖代表異源多肽的總N-聚糖的至少10%、至少20%、至少30%、至少 40%、至少 50%、至少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%或 100% (mol% )。
[0312] 另一個方面包括在絲狀真菌細胞中產生復合N-聚糖（S卩，包含 末端 GlcNAc2Man3 結構的 N-聚糖），例如 GlcNAc2Man3GlcNAc2 {:即 G0，艮P GlcNAcP 2Mana 3(GlcNAcP 2Mana 6)ManP 4GlcNAcP 4GlcNAc}聚糖的方法，包括提供具 有編碼異源多肽的重組多核苷酸、與野生型絲狀真菌細胞中的活性水平相比具有降低的 alg3甘露糖基轉移酶活性水平且進一步包含編碼N-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域 的多核苷酸和編碼N-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域的多核苷酸的絲狀真菌細胞， 和培養該絲狀真菌細胞以產生復合N-聚糖，例如GlcNA C2Man3GlcNAC2聚糖的步驟，其中 GlcNAc2Man3GlcNAc2聚糖占絲狀真菌細胞分泌的中性N-聚糖的至少5%、至少10%、至少 20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% (mol % )。在某些實施方式中，復合N-聚糖，例如GlcNAc2Man3GlcNAc2聚糖，代表多肽的 總N-聚糖的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至 少70 %、至少80 %、至少90 %或100 % (mol%)。在某些實施方式中，所述復合N-聚糖是 GlcNAcMan3 和 / 或 GlcNAc2Man3。
[0313] 另一個方面包括在絲狀真菌細胞中產生G1或G2N-聚糖或其混合物， 例如 GalGlcNAc2Man3GlcNAc2 {:艮P G1，艮P Gal β 4GlcNAc β 2Man a 3 (GlcNAc β 2Ma η α 6)Man β 4GlcNAc β 4GlcNAc}或 GlcNAc β 2Man α 3 (Gal β 4GlcNAc β 2Man α 6) 1&1113 461。嫩(^461。嫩。}和/或6&1261。嫩。21&111361。嫩。2{即62，即6&13 461。嫩(^21&111 α 3 (Gal β 4GlcNAc β 2Man a 6)Man β 4GlcNAc β 4GlcNAc}聚糖的方法，包括提供具有編碼異 源多肽的重組多核苷酸和與野生型絲狀真菌細胞中的活性水平相比具有降低的alg3甘露 糖基轉移酶活性水平且進一步包含編碼N-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域的多核苷酸、 編碼N-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域的多核苷酸和編碼GalT催化結構域的多核苷 酸的絲狀真菌細胞，和培養該絲狀真菌細胞以產生G1或G2N-聚糖或其混合物的步驟，其中 G1聚糖占絲狀真菌細胞分泌的中性N-聚糖的至少5 %、至少10 %、至少20 %、至少30 %、至 少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% (mol% )，或其中 G2聚糖占絲狀真菌細胞分泌的中性N-聚糖的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、 至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% (mol%)。在特 定實施方式中，G1聚糖占多肽的總N-聚糖的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、 至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或100 % (mol%)。在特定實施方式 中，G2聚糖占多肽的總N-聚糖的至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至 少 60%、至少 70%、至少 80%、至少 90%或 100% (mol% )。
[0314] 在某些實施方式中，產生復合N-聚糖的方法生成不同聚糖的混合物。復合N-聚 糖或Man3GlcNAc2可以占這種聚糖混合物的至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至 少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%或者更高。在某些實施方 式中，多肽的N-聚糖的至少5 %、至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至 少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %或者更多由這種聚糖混合物組成。在某些實施方 式中，產生復合N-聚糖及G1和/或G2N-聚糖的方法生成不同聚糖的混合物。復合N-聚 糖、Man3GlcNAc2、Gl和/或G2可以占這種聚糖混合物的至少5%、至少10%、至少20%、至 少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %或者更高。在某 些實施方式中，多肽的N-聚糖的至少5 %、至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少 50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %或者更多由這種聚糖混合物組成。
[0315] 在某些實施方式中，需要的是產生雜合N-聚糖的方法。如本文中使用的，術語"雜 合"意思是具有N-乙酰葡糖胺連接的包含未取代的末端甘露糖殘基（如存在于高甘露糖聚 糖中）和取代的甘露糖殘基兩者的聚糖，例如GlcNAcP 2Mana 3[Mana 3(Mana 6)Mana 6] Man β 4GlcNAc β 4GlcNAc。在這樣的實施方式中，Man5 {即 Man a 3 [Man a 3 (Man a 6)Man a 6] ManP4GlcNA(^4GlcNAc}表達絲狀真菌細胞如里氏木霉菌株用編碼異源多肽的重組多核 苷酸和編碼N-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域的多核苷酸轉化且培養該絲狀真菌細胞 以產生雜合N-聚糖，其中雜合N-聚糖占絲狀真菌細胞分泌的中性N-聚糖的至少5%、至 少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少 90%或100% (mol%)。在特定實施方式中，多肽的N-聚糖的至少10%、至少20%、至少 30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% (mol% ) 由雜合N-聚糖組成。
[0316] Man3GlcNAc2,復合的、雜合的、G1和G2N-聚糖可以連接于選自氨基酸、肽和多肽 的分子。在某些實施方式中，Man3GlcNAc2,復合的、雜合的、G1和G2N-聚糖連接于異源多 肽。在某些實施方式中，異源多肽是糖基化蛋白質。在特定實施方式中，糖基化多肽是哺乳 動物多肽。在某些實施方式中，哺乳動物多肽是抗體或其抗原結合片段。
[0317] 在某些實施方式中，糖基轉移酶，例如GnTI、GnTII或GalT或者糖基水解酶，例如， α -1，2-甘露糖苷酶或甘露糖苷酶II，包括與催化結構域連接的靶向肽。如本文中使用的， 術語"連接"意思是兩個氨基酸殘基聚合物（在多肽的情況中）或兩個核苷酸聚合物（在 多核苷酸的情況中）彼此相鄰地直接偶聯或處于相同多肽或多核苷酸內但由插入氨基酸 殘基或核苷酸分隔。如本文中使用的，"靶向肽"是指能夠將重組蛋白質定位于絲狀真菌細 胞內的內質網（ER)或高爾基體（Golgi)的重組蛋白中的任何數目的連續氨基酸殘基。靶 向肽可以是催化結構域的N-末端或C-末端。在某些實施方式中，靶向肽是催化結構域的 N-末端。在某些實施方式中，靶向肽提供與ER或高爾基體膜的直接結合。靶向肽的成分 可以來自于正常存在于ER或高爾基體中的任何酶。這樣的酶包括甘露糖苷酶、甘露糖基轉 移酶、糖基轉移酶、2型高爾基體蛋白質及MNN2、MNN4、MNN6、MNN9、MNN10、MNS1、KRE2、VAN1 和0CH1酶。合適的靶向肽描述于國際專利申請N〇.PCT/EP2011/070956中。在一個實施方 式中，GnTI或GnTII的靶向肽是人GnTII酶。在其它實施方式中，靶向肽源自木霉屬Kre2、 Kre2-樣、Ochl、Anpl和Vanl。在一個實施方式中，靶向肽選自SEQ ID N0:589-594的組。
[0318] 本發明絲狀真菌細胞的用途
[0319] 本文的本發明進一步涉及使用本公開的任何絲狀真菌細胞如木霉屬真菌細胞的 方法，該細胞具有降低的或沒有至少三種蛋白酶的蛋白酶活性和包含編碼以提高的水平 產生的異源多肽如哺乳動物多肽的重組多核苷酸，用于提高異源多肽穩定性和產生異源多 肽。測量蛋白質穩定性和產生異源多肽的方法是公知的，并包括，但不限于本公開中描述的 所有方法和技術。
[0320] 因此，本公開的特定實施方式涉及通過以下方式提高異源多肽穩定性的方法：a) 提供具有降低的或沒有至少三種蛋白酶的活性的本公開絲狀真菌細胞，其中該細胞進一步 包含編碼異源多肽的重組多核苷酸；和b)培養該細胞以使得表達異源多肽，其中與不包含 編碼蛋白酶的基因的突變的宿主細胞相比，該異源多肽具有提高的穩定性。本公開的其它 實施方式涉及通過以下方式提高哺乳動物多肽穩定性的方法：a)提供具有降低的或沒有 至少三種蛋白酶的活性的本公開木霉屬真菌細胞，其中該細胞進一步包含編碼哺乳動物多 肽的重組多核苷酸；和b)培養該細胞以使得表達哺乳動物多肽，其中與不包含編碼蛋白酶 的基因的突變的宿主細胞相比，哺乳動物多肽具有提高的穩定性。絲狀真菌細胞或木霉屬 真菌細胞可以是題為"本發明的絲狀真菌細胞"的章節中描述的任何細胞。測量多肽穩定 性和培養絲狀真菌細胞和/或木霉屬真菌細胞的方法是本領域中公知的，且包括，但不限 于本公開中描述的所有方法和技術。
[0321] 在某些實施方式中，異源多肽或哺乳動物多肽的穩定性與對應親本絲狀真菌細胞 或木霉屬真菌細胞中表達的異源多肽或哺乳動物多肽相比提高至少2倍、至少3倍、至少4 倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、 至少25倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少75倍、至少80 倍、至少90倍、至少100倍或更高倍。
[0322] 本公開的其它實施方式涉及通過以下方式制備異源多肽的方法：a)提供具有降 低的或沒有至少三種蛋白酶的活性的本公開絲狀真菌細胞，其中該細胞進一步包含編碼異 源多肽的重組多核苷酸；b)培養該細胞以使得表達異源多肽；和c)純化所述異源多肽。本 公開的進一步的實施方式涉及通過以下方式制備哺乳動物多肽的方法：a)提供具有降低 的或沒有至少三種蛋白酶的活性的本公開木霉屬真菌細胞，其中該細胞進一步包含編碼哺 乳動物多肽的重組多核苷酸；b)培養該宿主細胞以使得表達哺乳動物多肽；和c)純化所述 哺乳動物多肽。絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞可以是題為"本發明的絲狀真菌細胞"的 章節中描述的任何細胞。培養絲狀真菌或木霉屬真菌細胞和純化多肽的方法是本領域中公 知的，且包括，但不限于本公開中描述的所有方法和技術。
[0323] 在某些實施方式中，絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞在選自pH 3. 5-7、pH 3.5-6. 5、pH 4-6、pH 4.3-5. 7、pH 4.4-5. 6 和 pH 4.5-5. 5 的 pH 范圍中培養。在某些實 施方式中，為產生抗體，絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞在選自4. 7-6. 5、pH 4. 8-6. 0、pH 4· 9-5. 9和pH 5· 0-5. 8的pH范圍中培養。
[0324] 在一些實施方式中，異源多肽是哺乳動物多肽。在其它實施方式中，異源多肽是非 哺乳動物多肽。
[0325] 在某些實施方式中，哺乳動物多肽選自免疫球蛋白、免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白 輕鏈、單克隆抗體、雜合抗體、F(ab'）2抗體片段、F(ab)抗體片段、Fv分子、單鏈Fv抗體、 二聚的抗體片段、三聚的抗體片段、功能性抗體片段、單域抗體、多聚單域抗體、免疫粘附分 子、胰島素樣生長因子1、生長激素、胰島素和促紅細胞生成素。在其它實施方式中，哺乳動 物蛋白是免疫球蛋白或胰島素樣生長因子1。在再其它的實施方式中，哺乳動物蛋白是抗 體。在進一步的實施方式中，哺乳動物多肽的產率是至少0. 5、至少1、至少2、至少3、至少 4或至少5克/升。在某些實施方式中，哺乳動物多肽是抗體，任選地IgGl、IgG2、IgG3或 IgG4。在進一步的實施方式中，抗體的產率是至少0. 5、至少1、至少2、至少3、至少4或至 少5克/升。在再其它的實施方式中，哺乳動物多肽是生長因子或細胞因子。在進一步的實 施方式中，生長因子或細胞因子的產率是至少0. 1、至少0. 2、至少0. 3、至少0. 4、至少0. 5、 至少1、至少1. 5、至少2、至少3、至少4或至少5克/升。在進一步的實施方式中，哺乳動 物多肽是抗體，且該抗體包含至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的天然 抗體C-末端和N-末端而沒有另外的氨基酸殘基。在其它實施方式中，哺乳動物多肽是抗 體，且該抗體包含至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少98 %的天然抗體C-末 端和N-末端，其不缺少任何C-末端或N-末端氨基酸殘基。
[0326] 在其中哺乳動物多肽從細胞培養物純化的某些實施方式中，含有哺乳動物多肽的 培養物包含占到所產生多肽的質量的少于50 %、少于40 %、少于30 %、少于20 %或少于 10%的質量百分比的多肽片段。在某些優選的實施方式中，哺乳動物多肽是抗體，且多肽片 段是重鏈片段和/或輕鏈片段。在其中哺乳動物多肽是抗體且多肽從細胞培養物純化的其 它實施方式中，含有抗體的培養物包含占到所產生抗體的質量的少于50%、少于40%、少 于30%、少于20%或少于10%的質量百分比的游離重鏈和/或游離輕鏈。測定多肽片段的 質量百分比的方法是本領域中公知的且包括測量SDS-凝膠的信號強度。
[0327] 在進一步的實施方式中，非哺乳動物多肽選自氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過氧 化氫酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖 苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、聚糖酶、氧化酶、果 膠分解酶、過氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉谷 氨酰胺酶或木聚糖酶。
[0328] 在任何公開的方法的特定實施方式中，該方法包括提供一種或多種、兩種或更多 種、三種或更多種、四種或更多種或者五種或更多種蛋白酶抑制劑的另外的步驟。在某些實 施方式中，蛋白酶抑制劑是與哺乳動物多肽共表達的肽。在其它實施方式中，抑制劑抑制選 自天冬氨酸蛋白酶、胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶、枯草溶菌素蛋白酶和谷氨酸蛋白酶的蛋白 酶家族的至少兩種、至少三種或至少四種蛋白酶。
[0329] 在任何公開的方法的特定實施方式中，絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞還包含載 體蛋白。如本文中使用的，"載體蛋白"是絲狀真菌細胞或木霉屬真菌細胞內源的或由絲狀 真菌細胞或木霉屬真菌細胞高度分泌的蛋白質的部分。合適的載體蛋白包括，但不限于里 氏木霉甘露聚糖酶I (Man5A或ΜΑΝΙ)、里氏木霉纖維二糖水解酶II (Cel6A或CBHII)(參見， 例如，Paloheimo 等 Appl. Environ. Microbiol. 2003December ;69 (12) :7073-7082)或里氏 木霉纖維二糖水解酶I (CBHI)的那些。在一些實施方式中，載體蛋白是CBH1。在其它實施 方式中，載體蛋白是截短的里氏木霉CHB1蛋白，其包括CHB1核心區和CHB1連接體區域的 部分。在一些實施方式中，載體如纖維二糖水解酶或其片段與抗體輕鏈和/或抗體重鏈融 合。在一些實施方式中，載體如纖維二糖水解酶或其片段與胰島素樣生長因子1、生長激素、 胰島素、干擾素 a 2b、成纖維細胞生長因子21或人血清白蛋白融合。在一些實施方式中， 載體-抗體融合多肽包含Kex2切割位點。在某些實施方式中，Kex2或其它載體切割酶是 絲狀真菌細胞內源的。在某些實施方式中，載體切割蛋白酶是對于絲狀真菌細胞異源的，例 如，源自酵母的另一種Kex2蛋白或TEV蛋白酶。在某些實施方式中，載體切割酶過表達。
[0330] 應理解的是，盡管本發明已結合其某些具體的實施方式進行了描述，前述說明意 圖闡明而非限制本發明的范圍。本發明范圍內的其它方面、優勢和改進對于本發明所屬領 域的技術人員是明顯的。
[0331] 盡管已經描述了本發明，以下實施例提供用于通過說明的方式而不是限制的方式 闡明本發明。 實施例
[0332] 實施例1 一里氏木霉中天冬氨酸蛋白酶的鑒定
[0333] 這一實施例證明了來自里氏木霉（T. reesei)培養上清液的天冬氨酸蛋白酶降解 抗體重鏈和輕鏈的能力。
[0334] 天冬氨酸蛋白酶的鈍化
[0335] 據發現里氏木霉上清液中的蛋白酶活性可以用天冬氨酸蛋白酶抑制劑胃蛋白酶 抑制劑A抑制。因此，胃蛋白酶抑制劑A(Sigma#P2032)經由二氨基二丙基胺連接體與瓊脂 糖珠連接，并用作用于純化的親和樹脂。里氏木霉分批補料發酵上清液（15ml)用于將蛋白 酶分批結合35ml含50mM檸檬酸鈉、0. 2M NaCl的緩沖液，pH 3. 0中的樹脂。柱用相同的 結合緩沖液洗滌且結合的蛋白質用洗脫緩沖液（50mM Tris-HCL，1M NaCl，pH 8. 5)去除。 收集0.5ml的級分。純化總共42 μ g的蛋白酶。峰級分包含0.04 μ g/μ 1蛋白質。30 μ 1 的各級分與6 μ 1含β -巰基乙醇的Laemmli樣品緩沖液混合。樣品在95°C下加熱5分 鐘，然后與寬范圍的預染色分子量標志物（BioRad) -起加載到4-15% PAGE凝膠（BioRad mini-protean TGX預制凝膠）中。凝膠在SDS PAGE電泳緩沖液中100V下運行30分鐘，且 然后用 GelCode (Thermo Scientific)藍染染色。
[0336] 42kD雙峰帶在胃蛋白酶抑制劑A親和柱中純化（圖1)，并從SDS PAGE凝膠切除和 用測序級修飾胰蛋白酶（Pr〇mega#V5111)進行凝膠中胰蛋白酶消化。所得的肽然后從凝膠 提取并通過 C18ZipTip (Millipore#ZTC18M096)純化。純化的肽在 QSTAR Pulsar, ESI-混 合四極_T0F(AB Sciex)上通過LC-MS/MS分析。
[0337] 這一分析導致鑒別具有非常類似的分子量的4種天冬氨酸蛋白酶。鑒別的蛋白酶 包括：p印 1 (Tre74156 ;42· 7kD, 42 %序列覆蓋率）、p印2 (Tre53961 ;42· 4kD, 15 %序列覆蓋 率）、p印3(Trel21133 ;49kD,6%序列覆蓋率）和 p印5(Tre81004 ;45kD,9%序列覆蓋率）。 這些天冬氨酸蛋白酶在PAGE凝膠中以相似的分子量運行。它們的氨基酸序列相似性在 51% -64%之間。
[0338] 來自峰級分（F3)的蛋白質（0. 8 μ g)然后在37°C下與檸檬酸鈉緩沖液（50mM, pH 5. 5)中的IgGbOyg/ml)孵育20小時（圖2)。蛋白質在10uM胃蛋白酶抑制劑A存在或 不存在的情況下孵育。抗體混合物與Laemmli樣品緩沖液組合并在95°C下加熱5分鐘。這 些樣品然后與寬范圍預染色分子量標志物（Bi0Rad)-起加載到4-15%PAGE凝膠（Bi0Rad mini-protean TGX預制凝膠）中。凝膠在100V下于SDS PAGE電泳緩沖液中運行30分鐘。 在凝膠上運行之前，IgG不還原。全尺寸IgG恰在200kDa標志物之上。如可在圖2的非還 原凝膠中看到的，天冬氨酸蛋白酶能夠產生IgG的輕度降解。此外，IgG降解被胃蛋白酶抑 制劑A抑制。天冬氨酸蛋白酶活性在pH 5.5下比在酸性pH下受到更大限制，它們在酸性 pH下具有最大活性。
[0339] Deol刪除的分析
[0340] 天冬氨酸蛋白酶pepl蛋白酶然后進行測試以確定其在里氏木霉中的豐度。這通 過從源自P印1刪除菌株M182的上清液樣品純化天冬氨酸蛋白酶來進行。M182p印1刪除菌 株也產生利妥昔單抗抗體。
[0341] 在基礎菌株M124中形成的M181p印1刪除菌株在大的搖瓶培養中與M124對照瓶 一起生長。培養物在具有4g/L乳糖、2g/L廢谷物提取物（spent grain extract)和100mM PIPPS的300ml的TrMM，pH 5. 5中生長。三種不同的模型抗體在p印1刪除菌株和其親本菌 株M124的搖瓶培養上清液（在檸檬酸鈉緩沖液pH 5. 5中稀釋2mg/ml)中孵育（0. 05 μ g/ μ 1終濃度），且作為對比在親本菌株的發酵培養上清液中孵育。來自第5天培養物的含抗 體的上清液樣品（30 μ 1)加載到4-15% SDS PAGE凝膠中并轉移到硝基纖維素上以用于用 在了851'中1:30,000稀釋的抗-重鏈4?偶聯抗體（5丨8111&#43188)或抗-輕鏈4?偶聯物 (Sigma#A3813)進行免疫印跡分析。當與抗體孵育18小時過夜時，Λρ印1上清液較少的重 鏈蛋白質，如與Μ124對照菌株或發酵上清液（pH 5. 5 ;28°C;20g/L廢谷物提取物，60g/L乳 糖）對比的（圖39)。與輕鏈相比，重鏈更易降解。最大的穩定性效應對于利妥昔單抗和 MAB01重鏈是明顯的。在重鏈中，兩種不同的降解產物可以在?48kD和?38kD處看到（圖 39)。與對照相比，在Λρ印1上清液中輕鏈蛋白的穩定性中僅具有輕微改善（圖39)。
[0342] ρ印1刪除質粒的產生
[0343] 設計了用于ρ印l(TreID74156)的第一刪除構建體以使得能夠在成功整合后從 里氏木霉基因組去除選擇標記并從而再循環選擇標記用于后續的蛋白酶基因刪除。在 這種方法中，標記的再循環（即從刪除構建體去除pyr4基因）類似于針對酵母開發的 所謂 blaster 盒（Hartl，L.和 Seiboth，B·，2005, Curr Genet48:204-211 及 Alani，E. 等，1987, Genetics 116:541-545)。類似的blaster盒也已針對絲狀真菌包括紅褐肉座 菌（Hypocrea jecorina)(無性型：里氏木霉）開發（Hartl, L.和 Seiboth, B.，2005, Curr Genet 48:204-211)。
[0344] TrelD編號是指來自Joint Genome Institute里氏木霉ν2· 0基因組數據庫的 特定蛋白酶基因的識別編號。用于構建刪除質粒的引物"經眼（by eye)"或使用Primerf 軟件設計（Primer3 網站，Rozen 和 Skaletsky(2000)Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)。
[0345] 使用pyr4作為標記基因的blaster盒的原理如下：pyr4,編碼里氏木霉的乳清 苷-5'-單憐酸（01\^ :>)脫羧酶（3111；[1:11，]\1^等，1991，(]111'代11〖661161:;^819:27-33)，是尿 苷合成所需要的。缺乏0ΜΡ脫羧酶活性的菌株不能在沒有尿苷補充的最低培養基上生長 (即，是尿苷營養缺陷型）。5-氟乳清酸（5-F0A)用于產生缺乏0ΜΡ脫羧酶活性的突變菌株 (pyr4_菌株）是基于5-F0A通過OMP脫羧酶轉化為毒性中間體5-氟-UMP。因此，具有突 變的pyr4基因的細胞是5-F0A抗性的，但此外也是尿苷營養缺陷的。5-F0A抗性原則上也 可能由另一基因（pyr2,乳清酸磷酸核糖轉移酶）中的突變產生，且因此利用這一選擇獲得 的自發突變體需要通過補充具有pyr4基因的突變體對pyrf基因型進行驗證。一旦突變， pyr4基因可以用作里氏木霉中的營養缺陷型選擇標記。在我們的blaster盒中，pyr4接著 pyr4 5'未翻譯區（5'UTR)的308bp同向重復序列并由待刪除基因的5'和3'側翼區域包 圍。刪除盒的整合通過功能pyr4選擇。pyr4標記的去除隨后在5-F0A的存在下通過兩個 同源區域（5'UTR的同向重復序列）之間的重組強制進行，導致選擇標記的環出（looping out)并使得能夠在后續輪的基因刪除中利用相同的blaster盒（pyr4環出）。在環出后， 僅5' UTR的308bp序列保留在基因座中。
[0346] 因此，pyr4選擇標記和5'同向重復片段（pyr4 5' UTR的308bp)使用質粒 pAR0502(包含里氏木霉pyr4的基因組拷貝）作為模板通過PCR產生。PCR擴增用Phusion 聚合酶和HF緩沖液或GC緩沖液進行，或用Dynazyme EXT聚合酶進行。反應條件基于所擴 增的片段變化。兩個片段包含需要在酵母中利用同源重組克隆具有環出盒的質粒的40bp 重疊序列（參見下文）。為使得能夠實現可能的另外的克隆步驟，AscI消化位點置于pyr4 標記和5'同向重復序列之間且Notl位點包圍完整blaster盒。
[0347] 1066bp的5'側翼區域和1037bp的3'側翼區域選擇作為p印1刪除質粒的基礎。 片段通過PCR產生。產物用瓊脂糖凝膠電泳分離且正確的片段使用標準實驗室方法利用凝 膠提取試劑盒（Qiagen)從凝膠分離。用于側翼區域擴增的模板DNA來自里氏木霉野生型 菌株 QM6a(ATCC13631)。
[0348] 對于克隆中使用的酵母同源重組系統，對適宜的PCR-引物設置用于載體和選擇 標記的重疊序列。為使標記能夠在構建體中切換，Notl限制性位點在側翼區域和選擇標記 之間引入。Pmel限制性位點設置在載體和側翼區域之間用于在轉化到里氏木霉中之前去除 載體序列。載體骨架PRS426用限制性酶（EcoRI和Xhol)消化。限制性片段然后用瓊脂糖 凝膠電泳分離，且正確的片段使用標準實驗室方法利用凝膠提取試劑盒（Qiagen)從凝膠 分離。
[0349] 為構建刪除質粒，載體骨架及適宜的標記和側翼區域片段轉化到釀酒酵母（菌 株H3488/FY834)中。酵母轉化方案是基于描述于Colot和Collopy的鏈孢霉敲除工 作組材料（Dartmouth鏈孢霉基因組方案網站）和Gietz實驗室方案（University of Manitoba, Gietz實驗室網站）中的同源酵母重組的方法。來自酵母轉化體的質粒DNA通過 轉化到大腸桿菌中拯救。幾個克隆被培養，質粒DNA被分離和消化以使用標準實驗室方法 篩選正確的重組。具有正確插入大小的幾個克隆進行測序并儲存。
[0350] 用于pepl的第一刪除質粒（質粒pTTv41，表1. 1)使用另一選擇標記bar,攜帶鏈 霉菌的草銨勝 N-乙醜轉移酶（GenBank ID:AF013602. 1，Sweigard 等，1997, Fungal Genet Newsl 44:52-53)的合成構建體。側翼區域和標記片段通過PCR產生并使用如上所述的酵 母重組方法組裝到質粒中。為克隆第二pepl刪除質粒（pTTv71,表1. 1)，bar標記利用Notl 消化從刪除質粒pTTv41除去并使用酵母同源重組系統以上述pyr4blaster盒替代。這些 用于P印1的刪除質粒（PTIV41和pTTv71)導致p印1基因座中的1874bp刪除并覆蓋PEP1 的完整編碼序列。
[0351] 表1. 1:用于產生p印1刪除質粒的引物
[0352] 用于p印1的刪除質粒pTTv41 (TreID74156)，載體骨架pRS426
[0353]

【權利要求】
1. 一種絲狀真菌細胞，包含至少三種具有降低的活性的內源蛋白酶和編碼異源多肽的 重組多核苷酸，其中所述多肽以比其中所述蛋白酶不具有降低的活性的對應親本絲狀真菌 細胞中該多肽的產生水平高至少兩倍的水平產生。
2. 權利要求1所述的絲狀真菌細胞，條件是當所述細胞是曲霉屬細胞時，所述總蛋白 酶活性降低到其中所述蛋白酶不具有降低的活性的對應親本曲霉屬細胞的總蛋白酶活性 的50 %或更低。
3. 權利要求1或2所述的絲狀真菌細胞，其中所述總蛋白酶活性降低到其中所述蛋白 酶不具有降低的活性的對應親本絲狀真菌細胞的總蛋白酶活性的49%或更低，優選31% 或更低。
4. 權利要求1-3任一項所述的絲狀真菌細胞，其中至少三個編碼內源蛋白酶的基因各 自包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變。
5. 權利要求1-4任一項所述的絲狀真菌細胞，其中至少四個編碼內源蛋白酶的基因各 自包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變。
6. 前述權利要求任一項所述的絲狀真菌細胞，其中所述真菌細胞是木霉屬真菌細胞、 毀絲霉屬真菌細胞、曲霉屬真菌細胞、鏈孢霉屬真菌細胞、青霉屬細胞或金孢子菌屬真菌細 胞。
7. 前述權利要求任一項所述的絲狀真菌細胞，其中所述真菌細胞是里氏木霉 (Trichoderma reesei)〇
8. 權利要求6或7所述的絲狀真菌細胞，其中所述細胞對于pep4蛋白酶是野生型的。
9. 權利要求6、7或8所述的絲狀真菌細胞，其中所述細胞的至少以下三種蛋白酶具有 降低的活性或沒有活性：pepl、tspl和slpl或者gapl、slpl和pepl。
10. 權利要求6或7所述的絲狀真菌細胞，其中所述細胞的選自以下的至少三種或四種 蛋白酶具有降低的或沒有可檢測的蛋白酶活性：pep 1、pep2、pep3、pep4、pep5、pep8、pep 11、 pepl2、tspl、slpl、slp2、slp3、slp7、gapl 和 gap2〇
11. 權利要求10所述的絲狀真菌細胞，其中編碼所述具有降低的或沒有可檢測的蛋白 酶活性的三種或四種蛋白酶的基因各自包含降低或消除相應蛋白酶活性的突變。
12. 權利要求6或7所述的絲狀真菌細胞，其中所述細胞的至少八種蛋白酶具有降低的 活性或沒有蛋白酶活性，編碼所述八種蛋白酶的基因各自包含降低或消除相應蛋白酶活性 的突變，且所述八種蛋白酶是 pepl、tspl、slpl、gapl、gap2、pep4、pep3 和 pep5。
13. 權利要求6或7所述的絲狀真菌細胞，其中所述細胞包含三到六種具有降低的或 沒有可檢測的活性的蛋白酶，且所述三到六種蛋白酶各選自pepl、pep2、pep3、pep4、pep5、 tspl、slpl、slp2、slp3、gapl 和 gap2〇
14. 權利要求6-13中任一項所述的絲狀真菌細胞，其中所述細胞包含編碼另外的蛋 白酶的基因，其包含降低相應蛋白酶活性的突變，且所述另外的蛋白酶選自pep7、pep8、 pepll、pepl2、tppl、gap2、slp3、slp5、slp6、slp7 和 slp8〇
15. 前述權利要求任一項所述的絲狀真菌細胞，其中所述異源多肽是哺乳動物多肽。
16. 權利要求15所述的絲狀真菌細胞，其中所述哺乳動物多肽是糖基化的。
17. 權利要求15所述的絲狀真菌細胞，其中所述哺乳動物多肽選自抗體及其抗原結合 片段、生長因子、干擾素、細胞因子和白介素。
18. 權利要求15所述的絲狀真菌細胞，其中所述哺乳動物多肽選自胰島素樣生長因子 1 (IGF1)、人生長激素（hGH)和干擾素 a 2b (IFN a 2b)。
19. 前述權利要求任一項所述的絲狀真菌細胞，其中所述真菌細胞進一步包含具有降 低的活性的ALG3。
20. 權利要求19所述的絲狀真菌細胞，其中所述編碼ALG3的基因包含降低或消除相應 活性的突變。
21. 權利要求1-20中任一項所述的絲狀真菌細胞，其中所述真菌細胞進一步包含編碼 α -1，2-甘露糖苷酶的多核苷酸。
22. 前述權利要求任一項所述的絲狀真菌細胞，進一步包含 Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化結構域，和任選地 Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域。
23. 權利要求22所述的絲狀真菌細胞，進一步包含編碼Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶I催化 結構域的第一多核苷酸和，任選地，編碼Ν-乙酰葡糖胺基轉移酶II催化結構域的第二多核 苷酸。
24. 前述權利要求任一項所述的絲狀真菌細胞，進一步包含編碼甘露糖苷酶II和/或 半乳糖基轉移酶的多核苷酸。
25. 提高多肽的穩定性的方法，包括 a) 提供前述權利要求任一項的絲狀真菌細胞，和 b) 培養所述細胞以使得表達所述異源多肽， 其中所述異源多肽與其中所述蛋白酶不具有降低的活性的對應親本絲狀真菌細胞中 產生的異源多肽相比表現出提高的穩定性。
26. 制備異源多肽的方法，包括 a) 提供權利要求1-24的絲狀真菌細胞， b) 培養所述細胞以使得表達所述異源多肽，和 c) 純化所述異源多肽。
27. 權利要求25或權利要求26所述的方法，其中所述絲狀真菌細胞進一步包含載體蛋 白。
28. 權利要求27所述的方法，其中所述載體蛋白是CHB1。
29. 權利要求26-28中任一項所述的方法，其中所述培養是在包含蛋白酶抑制劑的培 養基中。
30. 權利要求26-29中任一項所述的方法，其中所述培養是在包含選自SBT1和胰凝乳 蛋白酶抑制劑的一種或兩種蛋白酶抑制劑的培養基中。
【文檔編號】C12N9/58GK104245919SQ201380012940
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年1月4日 優先權日:2012年1月5日
【發明者】C·蘭道斯基, A·雨斯科南, J·薩里南, A·韋斯特霍爾姆-帕維南, A·卡內爾瓦, J·納蒂南, A-L·阿尼南, N·薩洛維奧里, M·彭蒂拉, M·薩洛埃莫 申請人:諾華股份有限公司, 格利科斯芬蘭公司