黑靈芝真菌免疫調節蛋白的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】一種生物基因工程【技術領域】的黑靈芝真菌免疫調節蛋白的制備方法及其應用，該黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因具有SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列。本發明對該重組真菌免疫調節蛋白基因表達于大腸桿菌獲得高表達量目的蛋白，并且證明其對乳腺癌細胞具有很好的凝集作用。這對于利用基因工程的方法大量生產重組真菌免疫調節蛋白與利用該蛋白開發成一種新型的抗腫瘤制劑的應用提供了一種新的方向，可廣泛用于保健食品及生物醫藥領域。
【專利說明】黑靈芝真菌免疫調節蛋白的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種分子生物學、基因工程【技術領域】的方法，具體是一種黑靈芝真菌免疫調節蛋白的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]真菌免疫調節蛋白(fugal immunomodulatory proteins, FIPs)是從靈芝中分離得到的繼多糖和三萜類化合物后，又一類活性物質。在FIPs家族中，目前已經報道有7種蛋白，分別為命名為 LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo、FlP-gja (AY987805)、FlP-gmi和FlP-gsi,分別來源于赤靈芝(Ganodermalucidum)、松杉靈芝(G.tsugae)、金針恭(Flammulinavelutipes)、草? (Volvarielavolvacea)、紫靈芝(G.japoncium)、小抱靈芝(G.microsporum)及紫芝(G.sinensis) [Li QZ, Wang XF, Zhou Xff.Recent status andprospects of the fungal immunomodulatory protein family.Critical Reviews in Biotechnology.2011, 31 (4):365-375]。該蛋白家族中，直接從天然蕈菌中分離得到的真菌免疫調節蛋白僅有四種，它們分別是:LZ-8 (FIP-glu)、FIP-gts、FIP-fve、FIP-vvo，其余的真菌免疫調節蛋白則是通過基因重組技術表達而來，其氨基酸序列是由基因序列翻譯后得到的。Wang XF等經過比對發現，FIPs的氨基酸序列同源性較高，一般可達60-70%左右[Wang XF, Su KQ, Bao Tff, et, al.1mmunomodulation effects of fungal proteins.CurrentTopics in Nutraceutical Research.2012，10 (I):1-11.]。 [0003]FIPs具有一定的免疫調節功能，在抗過敏、抗腫瘤、促進淋巴細胞的增殖、誘導細胞分泌細胞因子和抗移植排斥等方面均有重要作用，其中抗腫瘤作用尤其引起大家興趣。Lin JW等經MTT (四唑鹽)實驗和流式細胞儀檢測，在畢赤酵母中表達的FIP-glu可以通過誘導細胞凋亡抑制人類白血病NB4的表達水平(32ii g/mL FIP-glu可誘導約35%的人類白血病NB4細胞凋亡)，具有一定的抗癌活性[Lin Jff, Hao LX, Xu GX, et al.Molecularcloning and recombinant expression of a gene encoding a fungal immunomodulatoryprotein from GanodermaIucidum in Pichiapastoris.World Journal of Microbiologyand Biotechnology, 2008，25 (3): 383-390]。Liao CH 等在大腸桿菌中表達的 FIP-gts 在人類肺腺癌A549細胞中表現出抗腫瘤活性。當FIP-gts的濃度達到4-10ii g/mL時，可有效控制癌細胞的轉移，具有很好的抗腫瘤效果[Liao CH, Hsiao YM, Lin CH.1nductionof premature senescence in human lung cancer by fungal immunomodulatoryprotein from Ganodermatsugae.Food and Chemical Toxicology, 2008, 46(5):1851-1859]。Liao等(2006)研究認為，FIP-gts雖能顯著抑制人類肺腺癌A549癌細胞的生長，但是不會影響正常MRC-5纖維原細胞的生長，它在mRNA水平下調端粒酶催化亞基的表達，抑制端粒酶的活性并具有劑量依賴效應。端粒酶在正常的體細胞里一般不被活化，它的活性有無往往會成為決定細胞無限增殖的關鍵因素。同時，FIP-gts可以促進NK細胞(natural killer cell)、巨曬細胞以及活化血清抗體的生成,有效地調節免疫功能,一定程度上也可以抑制癌細胞的生長[Liao CH, Hsiao YM, Hsu CP, et al.Transcriptionallymediated inhibition of telomerase of fungal immunomodulatory protein fromGanodermatsugae in A549human lung adenocarcinoma cell line.Molecular Carcinogenesis，2006，45(4):220-229]。
[0004]FIPs藥理學實驗研究證明，FIPs家族的蛋白在不同藥理學實驗時，不同FIP對不同實驗樣品起作用而且其作用結果有劑量依賴性。以[3H]作為標記，用LZ-8 (FIP-glu)處理小鼠脾臟細胞。當LZ-8濃度為3.13iig/mL時，[3H]吸收值達到最大峰值[Kino K，Yamashita A, Yamaoka K，et al.1solated and characterizationof a new immunomodulatoryprotein Ling Zh1-8(LZ-8), from Ganodermalucidum,Journal of Biological Chemistry, 1989，264(I):472-478]。FIP-fve 和 FIP-vvo 對人外周血淋巴細胞增殖活性的最佳濃度分別為lOOiig/mL和5iig/mL (Ko JL, HsuCl,Lin RH,et al.A new fungal immunomodulatoryprotein FlP-fveisolatedfrom the edible mushroom, Flammulianvelutlpesand its complete aminoacid sequence,European Journal of Biochemistry, 1995, 228(2):244-249.HsuHC, HsuCI, Lin RH,et al.Fip-vvo, a new fungalimmunomodulatoryprotein isolatedfrom Volvarielavolvacea, Journal of Biological Chemistry, 1997，323(2):557-565)。Wang等研究發現，FIP-fve表現出促使人外周血淋巴細胞由G1/G0期向S期過渡的促有絲分裂的作用。IOOyg FIP-fve與人外周血單核細胞共同培養72h后，結果發現61 %的淋巴細胞DNA含量與G0/G1期細胞的DNA含量一致，而26 %和12 %的淋巴細胞DNA含量，分別相當于S和G2/M期細胞的DNA含量(Wang PH, Hsu Cl，TangSC, et al.Fungal immunomodulatoryprotein from Flammulinavelutipesinducesinterferon-y production through p38mitogen_activated protein kinase signalingpathway, Agricultural and Food Chemistry, 2004，52 (9): 2721-2725)。然而在臨床和醫藥應用的實踐中，對蛋白使用的劑量均有一定的要求，因此，把此類蛋白應用于醫藥領域首要的問題是如何進行規模化大量生產？由于真菌免疫調節蛋白在天然蘑菇(或蕈菌)中的含量非常低(20-80mg/Kg)(林景衛，孫非，張韌，等.真菌免疫調節蛋白的研究進展.中華免疫學雜志.2005，21 (6): 477-480)，加之在蛋白提取過程中真菌多糖和其它成分的干擾，使得蛋白的獲得的成本較高。因此建立穩定的原核(或真核)表達體系，通過異源表達和發酵工業過程大量生產真菌免疫調節蛋白勢在必行。
[0005]在真菌免疫調節蛋白的異源表達中，最早被采用進行研究的是原核表達系統，這也是目前掌握最為成熟的表達系統。常用的表達載體有pET-28a、pET-28b和pET_30等，表達的宿主細胞包括有大腸桿菌TGl細胞、大腸桿菌M15細胞、大腸桿菌BL21細胞等。李奇璋等將來源于紫芝(Ganodermasineses)的FlP-gsi轉入pET_30a表達載體中同樣可以在大腸桿菌BL21細胞中得到表達，獲得了重組的紫芝真菌免疫調節蛋白[李奇璋，王雪飛，黃蕾，等.紫芝免疫調節蛋白基因的原核表達與功能分析.西北植物學報，2010，30 (I): 35-40]。大腸桿菌M15細胞也是目前表達真菌免疫調節蛋白基因主要宿主之一，LiQZ等把來源于紅靈芝的真菌免疫調節蛋白基因LZ-8 (FIP-glu)克隆到pQE-30表達載體中，轉化到大腸桿菌M15細胞中，同樣獲得了重組的真菌免疫調節蛋白FIP-glu[Li QZ, WangXF, Bao Tff, et al.1n vitro synthesis of a recombinant fungal immunomodulatoryprotein from Lingzhi or Reishi medicinal mushroom, Ganoderma lucidum(ff.Curt.:Fr.)P.Karst.(Aphyllophoromycetideae) and analysis of its immunomodulatoryactivity.1nternational Journal of Medicinal Mushrooms, 2010，12 (4): 347-358]用于進一步的科學研究或產品研發。同樣，Li QZ等人還把來源于紫芝(Ganodermasinensis)的真菌免疫調節蛋白基因FlP-gsi，轉入pQE-30表達載體中，同樣在大腸桿菌M15細胞中表達，也獲得了重組的紫芝真菌免疫調節蛋白FIP-gsi[Li QZ，Wang XF, Chen YY, etal.Cytokines expression induced by Ganoderma sinensis fungal immunomodulatoryproteins (FlP-gsi)in mouse spleen cells.Applied Biochemistry and Biotechnology,2010,162(5):1403-1413]。于此同時，在某些時候大腸桿菌TGl細胞同樣也可以作為FIPs表達的宿主細胞，1997年Lin等人通過將FIP-gts基因連接到大腸桿菌細胞TGl中，獲得了與谷胱甘肽S-轉移酶組成融合蛋白標記物(GST)，再被凝血酶消化后FIP-gts產量高達 20mg/L[Lin W H, Hung C H, Hsu Cl, et al.Dimerization of the N-terminalamphipathic a -helix domain of the fungal immunomodulatory protein fromGanoderma tsugae(Fip-gts)defined by a yeast two-hybrid system and site-directedmutagenesis.Journal of Biological Chemistry,1997,272(32):20044-20048]。 綜上述所，現有的真菌免疫調節蛋白基因在大腸桿菌中的表達，其表達量大約在約20~30mg/L[葉波平，王凡，梁亦馨，等.LZ-8基因在大腸桿菌中的表達.藥物生物技術，2002，9 (I):21-23 ;白杰英，曾林，李彥舫，等.真菌免疫調節蛋白在大腸桿菌中的表達及其抗體制備.實用醫藥雜志，2006，23 (10): 1205-1207]，表達的載體和宿主細胞不同，表達蛋白的修飾也不盡相同，因而也表現出不同的生理活性。
[0006]在先前的實驗中，我們采用同源克隆方法，以黑靈芝(Ganodermaatrum)基因組DNA為模板，對真菌免疫調節蛋白(FIPs)基因進行PCR擴增，分析結果表明:黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因序列包含336bp，可編碼111個氨基酸殘基，命名為FlP-gas。FlP-gas分子量為12.4kDa，理論等電點為4.80， 符合FIPs的特性，是FIPs家族一新成員。對FlP-gas進行序列分析發現其氨基酸序列具有FIPs的保守序列模式，與紫靈芝(G.japoncium)(AAX98241),紫芝(G.sinensis),小抱靈芝(G.microsporum),赤靈芝(G.lucidum)(AAA33350),松杉靈芝(G.tsugae),金針燕(Flammulinavelutipes) (ADB24832)及草燕(Volvarielavolvacea)的 FIP 序列的同源性分別為 99%, 98%, 87%, 86%, 86%, 61%, 55% (蘇愷琪，王雪飛，周選圍.黑靈芝免疫調節蛋白基因的克隆和生物信息學分析.上海交通大學學報(農業科學版).2012,30(1):65-71.)。上述黑靈芝FIP基因的克隆和分析為進一步的原核表達提供了基因資源。
【發明內容】
[0007]本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種黑靈芝真菌免疫調節蛋白的制備方法及其應用，能夠對乳腺癌細胞具有很好的凝集作用。這對于利用基因工程的方法大量生產重組真菌免疫調節蛋白與利用該蛋白開發成一種新型的抗腫瘤制劑的應用提供了一種新的方向，可廣泛用于保健食品及生物醫藥領域。
[0008]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0009]本發明涉及一種FlP-gas蛋白的分離純化方法,所述的FlP-gas基因,其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，通過同源克隆技術從黑靈芝(G.atrum)菌絲體中克隆得到，將黑靈芝真菌免疫調節蛋白FlP-gas基因構建成原核表達載體pET-30a-FIP-gas轉化入大腸桿菌BL21感受態細胞中，經IPTG誘導其表達；原核表達產物經金屬鎳離子螯合柱純化后得到。
[0010]所述的分離純化方法，具體包括如下步驟:
[0011]I)構建表達載體； [0012]2)轉化至大腸桿菌；
[0013]3)擴大培養；
[0014]4) IPTG 誘導表達；
[0015]5)分離純化；
[0016]所述的黑靈芝真菌免疫調節蛋白為黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因FlP-gas的表達產物，其序列如SEQ ID N0.1所示；
[0017]所述的大腸桿菌宿主細胞為大腸桿菌BL21菌株。
[0018]優選地，所述的步驟I)構建表達載體的具體方法為:
[0019]1.1)根據黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因FlP-gas的序列，設計引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內切酶位點Bam H I和Hind III，以構建原核表達載體；
[0020]1.2)以FlP-gas基因為模板，經PCR擴增后，將FlP-gas基因克隆至中間載體；
[0021]1.3)用雙酶切將FlP-gas片斷從中間載體上切下，回收相應片段，用T4連接酶16 0C連接過夜得表達載體。
[0022]優選地，所述的步驟1.2中的所述的中間體為pMD18_T simple vector或pET_30a。
[0023]優選地，所述的步驟2)的具體方法為:將所述的表達載體加入大腸桿菌感受態細胞冰上放置30min，之后42°C循環水浴熱擊90s，迅速冰浴2min。加入800 u L LB培養液37°C慢搖復蘇lh。取200 ii L菌液菌液涂布在含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板，篩選轉化子并挑取陽性克隆。
[0024]優選地，所述的步驟3)的具體方法為:將獲得的陽性克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養基中，37°C振搖培養過夜，次日以2%接種量接種，37°C繼續發酵。
[0025]優選地，所述的步驟4)的具體方法為:當發酵液0D_達到0.5~0.7時，加入IPTG進行誘導，IPTG的終濃度為ImM。
[0026]優選地，所述的步驟5)的具體方法為:
[0027]5.1)將經過IPTG誘導的菌液離心收集細胞，懸浮于緩沖液中；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化；
[0028]5.2 )將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎；
[0029]5.3)超聲處理過的菌液離心取上清，上N1-NTA柱，用緩沖液I洗柱后，用緩沖液2將目的蛋白洗脫出來；
[0030]所述的緩沖液I 為 50mM NaH2PO4, 300mMNaCl, 20mM imidazole, pH 為 8.0 的水溶液；
[0031]所述的緩沖液2 為 50mM NaH2PO4, 3OOmMNaCI, 25OmM imidazole, pH8.0 的水溶液。
[0032]本發明涉及上述方法制備得到的FlP-gas蛋白的應用，將其用于制備抗腫瘤藥物。
[0033]所述的FlP-gas蛋白，經細胞凝集試驗測定其對人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231(Breast adenocarcinoma)的凝集作用，結果表明重組基因表達的真菌免疫調節蛋白FlP-gas,在體外可抑制人乳腺癌細胞MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)的繁殖,說明該蛋白對這種腫瘤細胞株有抑制作用。
[0034]本發明中所涉及的生物材料及試劑除特別注明外，均能夠從市售渠道獲得。
[0035]本發明中所述的黑靈芝真菌免疫調節蛋白FlP-gas基因序列，已經由本實驗室公開報道，見上海交通大學學報(農業科學版)，2012年第30卷第I期第65-71頁，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0036]本發明中所涉及的大腸桿菌BL21已在(李奇璋，王雪飛，黃蕾，周選圍.紫芝免疫調節蛋白基因的原核表達與功能分析，西北植物學報，2010,30(1):0035 - 0040)中公開；BL21大腸桿菌菌株可通過公開市售的商業渠道取得，如北京博邁德科技發展有限公司，公司地址:北京市海淀區西四環中路甲59號。 [0037]本發明中所述的金屬鎳離子螯合(N1-NTA)柱適用于從細菌中抽提通常含有連續
6個組氨酸尾(His Tag Protein)的具有天然結構的可溶性重組蛋白質(Native Protein),可從公開渠道購買，如上海浩然生物技術有限公司，公司地址:上海市徐匯區石龍路345弄7號春天商務樓401室。
[0038]本發明中所述的細胞凝集試驗按照常規的細胞凝集反應的操作步驟進行。其中選用的人乳腺癌細胞MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)購自中國科學院細胞庫,地址:上海市徐匯區岳陽路320號。腫瘤細胞的培養按照常規方法進行。
[0039]在本發明中，可包括含有重組真菌免疫調節蛋白基因FlP-gas的載體、所述的載體轉化的宿主細胞。
[0040]本發明利用重組基因表達的真菌免疫調節蛋白FlP-gas，在體外可抑制人和乳腺癌細胞MDA-MB-231 (Breast adenocarcinoma)的繁殖,說明該蛋白對這種腫瘤細胞株有抑制作用。該基因將通過轉基因技術轉入大腸桿菌，誘導培養后，通過蛋白表達和純化，在抗乳腺癌藥物的開發中有巨大的應用潛力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]圖1為重組黑靈芝真菌免疫調節蛋白電泳圖(A)及Western Blot檢測圖(B)。
[0042]圖2為重組黑靈芝真菌免疫調節蛋白對人乳腺癌細胞MDA-MB-231 (Breastadenocarcinoma)細胞的凝集作用示意圖；
[0043]其中:圖2-1為reFIP-gas蛋白加入6h后乳腺癌細胞凝集情況，圖2_2為reFIP-gas蛋白加入12h后乳腺癌細胞凝集情況；圖2_3為reFIP-gas蛋白加入24h后乳腺癌細胞凝集情況。
【具體實施方式】
[0044]下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1
[0045]黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因FlP-gas原核表達載體的構建:[0046]1)根據黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因FlP-gas的序列，設計能擴增出其基因全長的引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內切酶位點Bam H I和Hind III，以構建原核表達載體。
[0047]2)以黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因FlP-gas為模板，經PCR擴增后，將FlP-gas基因克隆至中間載體(如PMD18-T simple vector),測序結果與所報道的黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因FlP-gas序列比較，一致性為100%，表明擴增沒有出現錯配。
[0048]3)根據引物兩端設計的酶切位點，用雙酶切(pET_30a載體可用Hind III和Bam HI)將FlP-gas片斷從pMD18-T simple vector上切下，回收相應片段，用T4連接酶16°C連接過夜。
[0049]4)連接產物轉化大腸桿菌BL21宿主細胞，用含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板篩選轉化子并挑取陽性克隆，測序。
[0050]5)提取克隆質粒，即得到重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白表達載體pET30a-FIP-gaSo
實施例2
[0051 ] 黑靈芝真菌免疫調節蛋白FlP-gas的誘導表達與純化
[0052]1.重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白FlP-gas的誘導表達及Western blot檢測
[0053]1)將實施例1中獲得的單克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養基中，37°C振搖培養過夜。
[0054]2)次日以2%接種量接種于較大體積培養液。37°C繼續培養，至0D_達到0.5~
0.7時，加入IPTG，使IPTG的終濃度達到ImM。
[0055]3)每0、0.5、1、2、3、4、511取出ImL至_20°C保存備用。將所取得菌液樣品5，OOOrpm離心 20min 以收集菌體，去上清，菌體用 100 u L2 X SDS-PAGE Sample buffer (IOOmMpH6.8Tris-Cl，4%(ff/V) SDS, 0.2%(ff/V) BPB, 20%(ff/V) glycerine, 2%(ff/V) ^ -ME)懸浮，并在95°C水浴鍋中保溫5min。之后再分別用兩塊15%SDS_PAGE膠檢測。一塊用于考馬斯亮藍染色，另一塊用于Western blot檢測(圖1)。
[0056]圖1所示，上方(A)為含有重組表達載體pET30-FIP_gas的大腸桿菌BL21細胞經IPTG誘導蛋白表達電泳圖，下方(B)為靈芝黑靈芝真菌免疫調節蛋白FlP-gas的WesternBlot檢測。泳道M為marker，泳道1_7分別為誘導時間0、0.5、1、2、3、4、5小時的大腸桿菌細胞，箭頭所示即為黑靈芝真菌免疫調節蛋白FlP-gas。誘導5小時時，重組蛋白表達量為最高。經大腸桿菌發酵，重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白的產量高達29.76mg/L。
[0057]2.重組真菌免疫調節蛋白的分離純化
[0058]1)將經過IPTG誘導的菌液5，OOOrpm離心20min以收集細胞，用1/10體積的Lysisbuffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 1OmM imidazole, pH8.0)懸浮；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化；
[0059]2)將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎，200~300W超聲6次，每次10s，期間間隔IOs ；
[0060]3)超聲處理過的菌液于4°C下12，OOOrpm離心20~30min ;取上清,使用N1-NTA柱純化(預先用10倍柱體積的Lysis buffer平衡);用20倍柱體積的Wash buffer (50mMNaH2PO4, 300mMNaCl, 20mM imidazole, pH8.0)洗柱；目的蛋白由 Elution buffer (50mMNaH2PO4, 300mMNaCl, 250mM imidazole, pH8.0)洗脫出來。
實施例3
[0061]重組靈芝屬內真菌免疫調節蛋白FlP-gas對人乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞凝集試驗。
[0062]1.癌細胞的培養
[0063]乳腺癌細胞系MDA-MB-231用含10%胎牛血清的DMEM培養基，在5%C02、37 °C飽和濕度條件下培養，腫瘤細胞單層貼壁培養。在細胞鋪滿瓶后，用0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA的PBS液體消化，制備成單細胞懸浮于0.5%胎牛血清白蛋白(BSA)的DMEM溶液備用，人乳腺癌細胞MDA-MB-231密度調整到5-7 X 103/100 y L。
[0064]2.細胞凝集實驗
[0065]I)將實施例3.1中細胞濃度調整到5-7X 103/100 U L的乳腺癌細胞加入96孔板， 并在CO2培養箱中37 °C培養過夜。
[0066]2)將重組蛋白FlP-gas用透析袋進行透析除去溶液中的咪唑成份，透析液為PBS(IOmM Na2HPO4,137mM NaCl, 2.7mM KCl,2mM KH2PO4, pH7.4)。用 PBS 和細胞培養液稀釋至工作濃度?(20 y g/mL, 15 u g/mL, 10 u g/mL, 5 u g/mL, 200ng/mL)。
[0067]3)在96孔板中加入測試重組蛋白混合物，混合物有4個濃度梯度g/mL、10ii g/mL、15 u g/mL和20 u g/mL,每個梯度3個重復，加入PBS溶液作為陰性對照。并在CO2培養箱中37°C培養，分別在6h、12h和24h觀察。
[0068]4)將在顯微鏡下觀察結果拍照(圖2-1、2-2、2_3)。
[0069]圖2所示，其中A為PBS陰性對照；B_E加入的reFIP-gas蛋白濃度分別為:B為5 V- g/mL, C 為 10 V- g/mL, D 為 15 u g/mL, E 為 20 u g/mL ;圖 2-lreFIP-gas 蛋白加入 6h 后乳腺癌細胞凝集情況，圖2-2reFIP-gas蛋白加入12h后乳腺癌細胞凝集情況；圖2-3reFIP-gas蛋白加入24h后乳腺癌細胞凝集情況。
[0070]觀察顯示黑靈芝真菌免疫調節蛋白FlP-gas對人乳腺癌細胞的抑制結果如圖2所示。當reFIP-gas濃度為5 u g/mL時，MDA-MB-231細胞就出現凝集反應，細胞皺縮或拉長，部分細胞簇集成團，有些細胞脫壁，細胞表面反光性變差。細胞膜皺縮、外突或粘連，有的小泡破裂，或脫落形成凋亡小體。FlP-gas將MDA-MB-231細胞阻斷在G1/S期，干擾了腫瘤細胞的正常增殖活動。隨著培養時間增長和FlP-gas濃度的增加,細胞凝集活性增強,但增強效果不明顯。
【權利要求】
1.一種FIP-gas蛋白的分離純化方法,其特征在于,所述的FIP-gas基因,其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示,通過同源克隆技術從黑靈芝(Ganoderma atrum)菌絲體中克隆得到，將黑靈芝真菌免疫調節蛋白FIP-gas基因構建成原核表達載體pET-30a-FIP-gas轉化入大腸桿菌BL21感受態細胞中，經IPTG誘導其表達；原核表達產物經金屬鎳離子螯合柱純化后得到； 所述的分離純化方法，具體包括如下步驟: 1)構建表達載體； 2)轉化至大腸桿菌； 3)擴大培養； 4)IPTG誘導表達； 5)分離純化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟I)構建表達載體的具體方法為: 1.1)根據黑靈芝真菌免疫調節蛋白基因FIP-gas的序列，設計引物，并在上游和下游引物上分別添加限制性內切酶位點Bam H I和Hind III，以構建原核表達載體； 1.2)以FIP-gas基因為模板，經PCR擴增后，將FIP-gas基因克隆至中間載體； 1.3)用雙酶切將FIP-gas片斷從中間載體上切下，回收相應片段，用T4連接酶16°C連接過夜得表達載體。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征是，所述的步驟1.2中的所述的中間體為pMD18_T simple vector 或 pET_30a。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟2)的具體方法為:將所述的表達載體加入大腸桿菌感受態細胞冰上放置30min，之后42°C循環水浴熱擊90s，迅速冰浴2min ;加入800 μ L LB培養液37°C慢搖復蘇Ih ;取200 μ L菌液菌液涂布在含有50mg/mL的卡那霉素的LB平板，篩選轉化子并挑取陽性克隆。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟3)的具體方法為:將獲得的陽性克隆接種于含有50mg/mL的卡那霉素的LB液體培養基中，37°C振搖培養過夜，次日以2%接種量接種，37°C繼續發酵。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟4)的具體方法為:當發酵液0D_達到0.5~0.7時，加入IPTG進行誘導，IPTG的終濃度為ImM。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的步驟5)的具體方法為: 5.1)將經過IPTG誘導的菌液離心收集細胞，懸浮于緩沖液中；將混合物置于液氮中冷凍，之后再于冰水中融化； 5.2)將融化后的樣品在冰水混合物中超聲波破碎； 5.3)超聲處理過的菌液離心取上清，上N1-NTA柱，用緩沖液I洗柱后，用緩沖液2將目的蛋白洗脫出來。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征是，所述的緩沖液I為50mMNaH2PO4, 300mMNaCl,20mM imidazole, pH 為 8.0 的水溶液；所述的緩沖液 2 為 50mM NaH2PO4, 300mMNaCl, 250mMimidazole, pH8.0 的水溶液。
9.一種根據上述任一權利要求所述方法制備得到的FIP-gas蛋白的應用，其特征在于，將其用于制備抗腫瘤藥物。
10.根據權利要求9所述的應用 ，其特征是，所述的腫瘤是指:人乳腺癌細胞MDA-MB-231。
【文檔編號】C12N15/70GK103739684SQ201410009107
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】周選圍, 孔應予, 叢蔚然 申請人:上海交通大學