專利名稱：一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及透明質酸鈉的微生物發酵技術領域，尤其是涉及一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝。
背景技術：
透明質酸是一種廣泛存在于動物結締組織和某些微生物莢膜中，具有獨特分子結構和理化性質的大分子酸性粘多糖，因其很高的粘彈性和極強的保水性，可以起到諸如潤滑關節，調節血管壁的通透性，調節蛋白質、水、電解質擴散及運轉，促進創傷愈合以及改善皮膚營養代謝，使皮膚柔嫩、光滑、去皺、增加彈性、防止衰老等作用，目前已被廣泛應用于臨床醫學、制藥及化妝品工業。早期透明質酸是以動物組織如人臍帶、雞冠、牛眼玻璃體等為原料，經提取、除雜、沉淀和分級分離后制得的，這種方法因原材料來源有限，分離純化復雜、成本高昂而逐漸被微生物發酵法所代替。后者具有產量不受動物原料資源限制，成本較低，分離純化工藝簡捷，易于規模化生產等優點。但是野生的透明質酸生產菌株普遍產量較低，由此造成的高成本問題使其不適用于規模化生產，為此，我們綜合采用了多種誘變選育方法對一株野生菌進行了優選，最終得到了一株高產菌，其產量最高可達10g/L，由此大大降低了生產成本。后續的分離純化工藝較之采用離子交換等方法來說大為簡捷，提高了分離效率，最高收率可達 80%。
發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種通過對菌體的改造使其在優化后的條件下高表達量的發酵生產透明質酸，并運用過濾、吸附、絡合等分離純化技術將目的產物與發酵液分離，最終制成滿足市場需求的合格產品。使用本發明生產透明質酸鈉可大幅度提高生物表達量，有效的降低生產成本，從而取得較好的市場收益的利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，包括以下步驟:(1)以馬鏈球菌獸疫亞種為出發菌，經過亞硝基胍誘變及原生質體紫外誘變，選育得到不產β-溶血素及透明質酸酶且產透明質酸能力大大提高的遺傳特性穩定的突變株，將其在斜面種子培養基上于32 38°C的溫度培養18 24h后，接種至一級種子培養基中；(2)將培養好的一級種子培養液接種至二級種子培養液中，于32 38°C下培養6 12h至該培養液中的菌群處于指數生長期的前期；(3)將培養好的種子液接種至營養度較高的發酵培養基中，使菌體在下列條件下進行發酵生產:采用補料分批發酵，發酵液PH為5.0 9.0，溫度為32 38°C，攪拌轉速150 600rev/min，通氣量 1.0 15.0vvm，培養時間 18 24h ；(4)結束發酵，將發酵液轉移至提取儲罐中，邊攪拌邊用20%三氯乙酸調pH值至3.0，靜置過夜，用板框進行過濾并收集濾出液，然后用去離子水調節溶液中透明質酸的含量約為5g/L，測定該溶液的pH值，用2N的NaOH溶液將該溶液的pH調節至6.0 9.0 ;(5)以10 100g/L的添加量加入特定型號的硅藻土并攪拌2h，用不銹鋼板框進行過濾,收集濾出液；(6)將另一種特定型號的硅藻土按照10 100g/L的添加量加入到上述濾出液中，攪拌2h，用不銹鋼板框過濾，并收集濾出液；(7)將I 10g/L的活性炭加入上述濾出液中，攪拌2h后用板框過濾并收集濾出液；(8)取樣測定單位體積的濾出液中透明質酸的含量，然后按照2: 1(質量比)的比例添加一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，邊加邊攪拌，全部加完后，繼續攪拌2h ；(9)將上述混懸液進行板框過濾并得到沉淀；(10)配置0.2 1.0mol/L的NaCl溶液，然后將上述沉淀用該氯化鈉溶液溶解，溶解過程要不斷攪拌，以加速溶解速率；(11)將上述完全溶解后的溶液加入I 10g/L濃度的活性炭，攪拌2h后板框過濾并收集濾出液；(12)將上述濾出液通過孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾除菌，收集濾出液；(13)往上述濾出液中加入2 3倍體積的95%乙醇溶液，攪拌使原溶液中的透明質酸沉淀出來，至不再有沉淀產生時進行板框過濾，收集沉淀至潔凈容器中，用95%乙醇洗2 3次，然后將沉淀放置于真空干燥箱內進行干燥；
(14)收集干燥后的產品并進行粉碎即得到最終的產品透明質酸鈉。步驟(I)中的選育方法為:以一株馬鏈球菌獸疫亞種為出發菌株，采用在平板培養基中添加I 10%無菌綿羊血或0.01 0.1 %透明質酸鈉的篩選手段，經過亞硝基胍誘變及原生質體紫外誘變育種技術，篩選得到表達量高、不產β-溶血素及透明質酸酶且遺傳特性穩定的突變菌株。步驟(I)中馬鏈球菌獸疫亞種的突變株的選育方法為:(I)按照下述方法配制血瓊脂平板培養基:稱量葡萄糖5.0g，牛肉膏10g，酵母粉5g, MgSO4L Og,瓊脂20g,加水1L,高溫高壓滅菌后,冷卻至45°C時加入20ml無菌綿羊血,混合均勻，放置于45 °C水浴中，備用。(2)對出發菌馬鏈球菌獸疫亞種進行亞硝基胍誘變:將斜面培養基上培養24h后的新鮮菌種接種至液體種子培養基中，于32°C下震蕩培養12h，將該液體培養液離心后丟棄上清，得到的菌體沉淀物用無菌生理鹽水懸浮，并用脫脂棉過濾，適當稀釋制得IO8個/ml的菌懸液，得到的菌懸液置于小三角燒瓶中，并加入200μ g/ml的亞硝基胍溶液，混勻后于32°C下震蕩培養30min，然后用稀釋法終止反應，并將誘變后的菌液加入液體培養基中于32°C下震蕩培養lh，取Iml經過中間培養的菌液加入上述血瓊脂平板培養基中，混勻后傾倒入平皿中，培養48h，挑取平板上不產生透明圈的單菌落進行保藏，得到不產β -溶血素的突變株。(3)配制與(I)中所述成分相同的平板培養基，高溫高壓滅菌后，加入無菌透明質酸鈉使其濃度為0.02%，但不加入綿羊血，放入45°C水浴中，備用。
(4)按照(2)中所述方法取不產β_溶血素的突變株作為出發菌制備菌懸液并用亞硝基胍處理，然后取經過中間培養Ih的菌液Iml加入(3)中所述的平板培養基中，混勻后傾倒入平皿中，培養48h后，將I %濃度的無菌氯化十六烷基吡啶溶液均勻的倒在平板上，放置IOmin后，挑取平板上菌落周圍有渾濁帶的單菌落進行保藏，得到既不產β-溶血素同時也不產透明質酸酶的突變株。(5)取(4)中所述得到的突變菌株作為出發菌，進行原生質體紫外誘變選育高產透明質酸的變異株。原生質體制備與再生的最佳條件為:將出發菌用液體種子培養基培養Ilh后離心得到菌體，加入高滲緩沖液溶解的蝸牛酶及纖維素酶，在35°C恒溫處理lh，離心，用高滲緩沖液洗滌得到原生質體懸液，在15w紫外燈下，于30cm處，照射300s，然后將處理過的菌液混入軟瓊脂再生培養基，傾倒至再生培養基平板上。培養48h后，以出發菌作為對照組，挑取平板上長勢良好，粘性大且菌落大于對照組菌的單菌落進行搖瓶發酵培養，于32°C振蕩培養24h后，測定發酵液中的透明質酸含量。上述軟瓊脂再生培養基的成分為:葡萄糖5.0g，牛肉膏10g，酵母粉5g，MgSO4L Og,瓊脂4g,加水IL ;再生培養基的成分為；葡萄糖5.0g,牛肉膏IOg,酵母粉5g,MgSO4LOg,瓊脂 20g，加水 IL0可以反復進行紫外誘變選育，以期得到產量更高的正突變菌株。我們共進行了 6次紫外誘變，最終得到一株既不產生溶血素同時也不產生透明質酸酶的高產菌SY-121，經過發酵培養，最終發酵液中透明質酸的濃度為10g/L。經過10次傳代培養，產透明質酸能力沒有下降。所述的斜面種子培養基的成分為:葡萄糖1.0 10g/L,牛肉膏10 50g/L,酵母粉 5 15g/L, Na2HPO4 0.5 2.0g/L, MgSO4 0.2 1.0g/L。所述的發酵培養基成分為:葡萄糖10 70g/L，酵母粉10 50g/L，Na2HPO4I 5g/L，MgSO4 I 5g/L，消泡劑 0.5 1.5g/L。所述的補料分批發酵是將總糖為70g/L，初糖為10g/L，剩余的葡萄糖按照1:3:5: 7的量分四次分別于發酵的第8h，9h，10h，14h添加到發酵液中，發酵過程中不斷調節進氣量及攪拌轉速，使發酵液的溶氧維持在10 70%的范圍內，攪拌轉速不可大于600rev/mino步驟(5)中所述的特定型號的硅藻土為型號為⑶10的硅藻土。步驟(6)中所述的特定型號的硅藻土為型號為⑶3的硅藻土。步驟(7)中所述的活性炭為針形活性炭。步驟(8)中所述的一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液是將CPC溶于去離子水得到濃度為100g/L的溶液。與現有技術相比，本發明的技術方法，通過小試、中試，已建立起一套成熟的生產工藝，可以用于規模化生產，最后制得的產品符合國際通用標準，滿足市場需求。具體的產品質量標準可達到:
權利要求
1.一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，該工藝包括以下步驟: (1)以馬鏈球菌獸疫亞種為出發菌，經過亞硝基胍誘變及原生質體紫外誘變，選育得到不產β-溶血素及透明質酸酶且產透明質酸能力大大提高的遺傳特性穩定的突變株，將其在斜面種子培養基上于32 38°C的溫度培養18 24h后，接種至一級種子培養基中； (2)將培養好的一級種子培養液接種至二級種子培養液中，于32 38°C下培養6 12h至該培養液中的菌群處于指數生長期的前期； (3)將培養好的種子液接種至營養度較高的發酵培養基中，使菌體在下列條件下進行發酵生產:采用補料分批發酵，發酵液pH為5.0 9.0，溫度為32 38°C，攪拌轉速150 600rev/min，通氣量 1.0 15.0vvm，培養時間 18 24h ； (4)結束發酵，將發酵液轉移至提取儲罐中，邊攪拌邊用20%三氯乙酸調pH值至3.0，靜置過夜，用板框進行過濾并收集濾出液，然后用去離子水調節溶液中透明質酸的含量約為5g/L，測定該溶液的pH值，用2N的NaOH溶液將該溶液的pH調節至6.0 9.0 ; (5)以10 100g/L的添 加量加入特定型號的硅藻土并攪拌2h，用不銹鋼板框進行過濾，收集濾出液； (6)將另一種特定型號的硅藻土按照10 100g/L的添加量加入到上述濾出液中，攪拌2h，用不銹鋼板框過濾，并收集濾出液； (7)將I 10g/L的活性炭加入上述濾出液中，攪拌2h后用板框過濾并收集濾出液； (8)取樣測定單位體積的濾出液中透明質酸的含量，然后按照2: 1(質量比)的比例添加一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，邊加邊攪拌，全部加完后，繼續攪拌2h ; (9)將上述混懸液進行板框過濾并得到沉淀； (10)配置0.2 1.0mol/L的NaCl溶液，然后將上述沉淀用該氯化鈉溶液溶解，溶解過程要不斷攪拌，以加速溶解速率； (11)將上述完全溶解后的溶液加入I 10g/L濃度的活性炭，攪拌2h后板框過濾并收集濾出液； (12)將上述濾出液通過孔徑為0.22 μ m的濾膜過濾除菌，收集濾出液； (13)往上述濾出液中加入2 3倍體積的95%乙醇溶液，攪拌使原溶液中的透明質酸沉淀出來，至不再有沉淀產生時進行板框過濾，收集沉淀至潔凈容器中，用95%乙醇洗2 3次，然后將沉淀放置于真空干燥箱內進行干燥； (14)收集干燥后的產品并進行粉碎即得到最終的產品透明質酸鈉。
2.根據權利要求1所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，步驟(I)中的選育方法為:以一株馬鏈球菌獸疫亞種為出發菌株，采用在平板培養基中添加I 10%無菌綿羊血或0.01 0.1 %透明質酸鈉的篩選手段，經過亞硝基胍誘變及原生質體紫外誘變育種技術，篩選得到表達量高、不產溶血素及透明質酸酶且遺傳特性穩定的突變菌株。
3.根據權利要求2所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，所述的亞硝基胍誘變方法為:稱取IOmg NTG倒入無菌離心管中，加入0.lmol/L、pH 6.0的磷酸緩沖液10mL，暗處振蕩溶解，分裝至無菌小試管中，每管lmL，取ImL菌液加入上述離心管中，充分搖勻，立即置于37°C水浴振蕩處理30min，NTG的終濃度為500 μ g/mL后，離心收集菌體，將含NTG的上清液倒入濃NaOH溶液棄去，用無菌水洗滌菌體3次，用大量稀釋法終止NTG的誘變，最后向離心管中加2mL無菌生理鹽水，涂布無菌羊血瓊脂平板，篩選菌落周圍不產透明圈的變異菌進行鑒別并保藏，最終得到一株不產β_溶血素的變異菌株，將其作為出發菌繼續進行NTG誘變，誘變所用NTG的最終濃度調節為600 μ g/mL,涂布含0.01 0.1%透明質酸鈉的篩選平板，挑選菌落周圍不產透明圈的單菌落進行鑒別并保藏，即可得到既不產β -溶血素，又不產透明質酸酶的變異菌株； 所述的原生質體紫外誘變方法為:將上述經過亞硝基胍誘變選育得到的既不產溶血素，又不產透明質酸酶的變異菌株作為出發菌，用種子培養基培養IOh后離心得到菌體，加入2mol/L的蔗糖溶液作為高滲緩沖液，溶解的0.5mg/ml的蝸牛酶及0.2mg/ml纖維素酶溶液5ml，在32°C恒溫處理lh，離心，用高滲緩沖液洗滌得到原生質體懸液，在15w紫外燈下，于30cm處，照射lmin，然后將處理過的菌液混入軟瓊脂種子培養基中，瓊脂含量為.0.5%的種子培養基，傾倒至種子培養基平板上。于35°C培養24 48h，待平板上菌落長出后，挑取比出發菌相比菌落面積較大的單菌落進行搖瓶發酵培養，并測定透明質酸鈉產量，最終得到一株比原始菌產能提高400%的菌株，即為不產β_溶血素及透明質酸酶且產透明質酸能力大大提高的遺傳特性穩定的突變株。
4.根據權利要求1所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，所述的斜面種子培養基的成分為:葡萄糖1.0 10g/L,牛肉膏10 50g/L,酵母粉5 15g/L, Na2HPO4 0.5 2.0g/L, MgSO4 0.2 1.0g/L。
5.根據權利要求1所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，所述的發酵培養基成分為:葡萄糖10 70g/L,酵母粉10 50g/L, Na2HPO4I 5g/L,MgSO4 I 5g/L，消泡劑 0.5 1.5g/L。
6.根據權利要求 1所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，所述的補料分批發酵是將總糖為70g/L，初糖為10g/L，剩余的葡萄糖按照1:3:5:7的量分四次分別于發酵的第8h，9h，10h, 14h添加到發酵液中，發酵過程中不斷調節進氣量及攪拌轉速，使發酵液的溶氧維持在10 70%的范圍內，攪拌轉速不可大于600rev/min。
7.根據權利要求1所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，步驟(5)中所述的特定型號的硅藻土為型號為⑶10的硅藻土。
8.根據權利要求1所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，步驟(6)中所述的特定型號的硅藻土為型號為⑶3的硅藻土。
9.根據權利要求1所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，步驟(7)中所述的活性炭為針形活性炭。
10.根據權利要求1所述的一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，其特征在于，步驟⑶中所述的一定濃度的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液是將CPC溶于去離子水得到濃度為100g/L的溶液。
全文摘要
本發明涉及一種利用細菌發酵生產透明質酸鈉的生產工藝，該生產工藝以馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus Zooepidemics)為出發菌株，經亞硝基胍誘變及原生質體紫外誘變后，采用特定的培養基，先經液態深層發酵生產高產量透明質酸，再經相應的分離純化工藝得到高純度透明質酸鈉產品。在培養溫度為32～38℃，發酵液pH值維持在5.0～9.0范圍內，發酵罐攪拌轉速為150～600rev/min的培養條件下，透明質酸的產量有大幅度提高，適用于工業化生產。
文檔編號C12R1/46GK103173507SQ20111043626
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者楊曉輝, 葉昀, 林克, 王洪森 申請人:寧波林葉生物科技有限公司