利用核酸色譜法的肺炎病原菌的檢出方法

專利名稱：利用核酸色譜法的肺炎病原菌的檢出方法
技術領域：
本發明涉及肺炎病原菌的檢出方法、檢出試劑盒。更具體地說，涉及以肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎嗜衣原體(Chlamydophilia pneumoniae)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA) (Staphylococcus aureus (MRSA))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為檢出對象的肺炎病原菌的檢出方法、檢出試劑盒。
背景技術：
目前，肺炎在日本人的分原因死亡率中排第四位，作為癌癥等基礎疾病的并發癥也經常發生，作為患病者數目非常多的疾病已知。以前，作為成為肺炎病因的微生物(病原菌)的探索試驗而進行的培養檢查至少需要幾天時間，若進一步對所培養的病原菌進行藥物敏感性試驗則花費近一周時間，所以并沒有成為充分有助于治療選擇的檢查方法。對于需要入住重癥監護病室(ICU)的重癥肺炎來說，迅速且正確地確定病原菌對于治療選擇是極其重要的，有報道指出適當的初期治療可以切實地提高肺炎患者的救命幾率。但是實際上由于替代培養法的病原菌鑒定技術依然沒有確立，所以現狀是，不得不在病原菌不明的狀態下進行治療，不得不根據經驗治療使用抗生素，由此有可能會導致出現耐藥菌。對于成為肺炎病因的病原菌，發生頻率高的菌株占全體的近50%，包含病毒在內的主要病原菌為2(Γ30種左右。其中也存在不能利用通常的方法來培養的病原菌，此外也存在難以通過培養來確定病原菌的情況。特別是對于需要根據菌株 菌量適當選擇抗生素來進行治療的肺炎來說，同時檢出多種肺炎病原菌以及對檢出的信號進行定量性的解析是非常重要的。此外，雖然最優的治療藥根據病原菌的種類不同而不同，但是實際情況是，在醫療道德上不得不在確定病原菌之前開始治療。為了解決這些問題，有待于開發可以從多種菌株中迅速且定量性地檢出特定菌的方法。例如，提出了使用引物集來同時檢出4種的呼吸系統感染癥病原菌的方法(如參照專利文獻I)，所述引物集添加有分別來自編碼肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的自溶素(LytA)的LytA基因、編碼流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)的16SrRNA的基因、編碼化膿鏈球菌的16SrRNA的基因、編碼肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的16SrRNA的基因的引物,或進一步添加有來自編碼嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的16SrRNA的基因以及編碼嗜肺軍團菌(Legionella pneumophila)的病原因子MIP蛋白的mip基因的引物。此外，提出了與呼吸系統疾病相關的10種細菌特異性的引物集以及探針寡核苷 酸集(如參照專利文獻2和3)，其由下述構成作為與呼吸系統疾病相關的10種細菌特異性的引物集的，以從含有細菌的試樣中分離得到的核酸作為模板，使含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的百日咳桿菌、肺炎嗜衣原體、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎克雷伯菌、嗜肺軍團菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌中存在的靶序列特異性地擴增的引物集，和特異性地檢出上述菌中存在的靶核酸的探針。此外，提出了可以使選自含有10個以上的連續堿基片段的寡核苷酸中的5種以上的引起呼吸系統疾病的病毒的靶序列同時擴增的核酸引物集，還提出了用于檢出麻疹病毒、腸病毒、鼻病毒、嚴重急性呼吸綜合癥相關的冠狀病毒(SARS-COV)、水痘一帶狀皰疫病毒(VZV)、腺病毒、人類副流感病毒I型(HPIVl)、人類副流感病毒2(HPIV2)、人副流感病毒
3(HPIV3)、流感病毒A(IVA)、流感病毒B(IVB)、呼吸道合胞病毒(RSVA)和呼吸道合胞病毒B (RSVB)中一種以上病毒的探針寡核苷酸,其含有選自含有10個以上的連續堿基片段的寡 核苷酸以及與其互補的寡核苷酸中的長度為IObp IOObp的一種以上的寡核苷酸，記載了含有由試樣得到核酸的步驟、利用上述核酸引物集來使上述核酸擴增的步驟、和檢出上述擴增產物的步驟的要點，記載了從試樣得到核酸的步驟含有從試樣分離RNA的步驟、從分離的RNA得到cDNA的步驟，得到cDNA的步驟例如利用逆轉錄酶進行，利用逆轉錄酶的逆轉錄酶反應可以使用RT-PCR，上述擴增的步驟通過PCR進行的要點(如參照專利文獻4)。另一方面，提出了諾如病毒的簡易高靈敏度檢出法(如參照專利文獻5)，該方法為用于使試樣中微量存在的大致區分的諾如病毒的基因組的基因組I (G I)和基因組
II(G II)的基因特異性地擴增的方法，其特征在于，由包含下述步驟的步驟構成由從試樣中抽提的RNA，利用在規定溫度下可以擴增核酸的NASBA法，得到互補的單鏈核酸步驟，和對于利用該NASBA法得到的擴增產物，利用在規定溫度下可以擴增核酸的RT-LAMP法，進一步擴增核酸的步驟。本發明人提出了引物集(如參照專利文獻6)，其為用于多種肺炎病原菌的檢出的弓I物集，除了使用通常的PCR，還使用多重PCR、實時PCR、RT-PCR等，可以同時檢出肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體以及肺炎嗜衣原體，本發明人還提出了靶RNA的檢出·定量方法(如參照專利文獻7)，該方法含有由16SrRNA中的細菌特異性的RNA鏈，制備在相當于靶RNA的特異性序列的DNA序列和標簽序列的5’末端附加了 RNA聚合酶啟動子序列的液相通用引物，本發明人還提出了病原微生物的檢出方法(如參照專利文獻8)，其中，為從選自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)屬細菌、鏈球菌(Streptococcus)屬細菌、克雷伯菌(Klebsiella)屬細菌、埃希氏菌(Escherichia)屬細菌、分枝桿菌(Mycobacterium)屬細菌、軍團菌(Legionella)屬細菌、弧菌(Vibrio)屬細菌、芽孢桿菌(Bacillus)屬細菌、奈瑟氏菌(Neisseria)屬細菌、彎曲桿菌(Campylobacter)屬細菌、衣原體(Chlamydia)屬菌、嗜衣體(Chlamydophila)屬菌、支原體(Mycoplasma)屬菌、李斯特氏菌(Listeria)屬細菌、沙門氏菌(Salmonella)屬細菌以及耶爾森氏菌(Yersinia)屬細菌中的I種或2種以上的細菌中選擇的2種以上，具有使用具有標簽序列和對上述病原微生物保持的DnaJ基因上的靶核酸選擇性退火而得到的堿基序列的至少I種的第I引物集，和具有與上述標簽序列實質上相同的標簽序列的至少I種的第2引物集，實施聚合酶鏈反應的聚合酶鏈反應步驟，和檢出含有上述靶核酸的擴增產物的步驟。此外，已經開發了下述核酸的檢出或者定量方法，該方法為用于特異性地檢出或者定量試樣中的靶核酸的方法，含有由試樣中任意抽提的靶核酸，使用未結合半抗原或者肽的引物，作為單鏈核酸進行擴增的步驟，與將該擴增產物結合于膜的與擴增產物互補的第I寡核苷酸探針以及用著色高分子載體標記的互補的第2寡核苷酸探針進行雜交而檢出的步驟，和通過目視判定對該檢出圖像進行評價的步驟，例如確立了以從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的培養菌株中抽提的全RNA作為模板進行NASBA擴增反應，通過核酸色譜條檢出擴增產物的方法(如參照專利文獻9)。雖然報道了組合NASBA法和核酸色譜法，用于檢出諾如病毒基因的2種基因類型的試劑(X 7卜夕一>諾如病毒G I / G II “力4 7 >”)，但是上述試劑大致區分并判定遺傳性多樣的15種以上的基因型所屬G I類型和18種以上基因型所屬G II類型，不具有用于鑒定肺炎病原菌的精度。現有技術文獻專利文獻I :日本特開2005-110545號公報專利文獻2 :日本特開2006-174837號公報
專利文獻3 :日本專利第4235645號公報專利文獻4 :日本特開2006-180878號公報專利文獻5 :日本特開2009-240207號公報專利文獻6 日本特開2009-39046號公報專利文獻7 :國際公開2009/057330號小冊子專利文獻8 :國際公開2008/041354號小冊子專利文獻9 日本專利4268944號公報

發明內容
本發明的目的是，提供在診斷肺炎患者時，迅速且正確地檢出肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌(這些單獨的細菌以下有時稱為“檢出對象肺炎菌”、或簡稱為“肺炎菌”、總稱為“10種檢出對象肺炎菌”)的方法、用于此的檢出試劑盒。本發明人為了實現臨床上的實用化，對于進一步提高肺炎病原菌檢出精度的方法進行研究，以DnaJ基因具有16SrRNA序列的約10倍的基因多態性的發現為基礎，以DnaJ區域為主，以各種肺炎菌特異性的基因區域為中心，設計對于10種各肺炎病原菌的DnaJ基因等中含有的10種檢出對象肺炎菌的各靶區域的引物對集，發現使用該引物對集，通過NASBA法擴增基因產物，定性·定量作為擴增產物的靶核酸，可以高精度地檢出多種肺炎病原菌。進一步設計將該擴增產物雜交到與引物對集不同的10種檢出對象肺炎菌的各靶區域內的序列而得到的各種肺炎菌固有的探針對集，發現通過使用上述探針對集進行核酸色譜法，用一次操作就可以高精度地檢出多種甚至10種的檢出對象肺炎菌，從而完成了本發明。S卩，本發明涉及(1) 一種檢出方法，該檢出方法為以選自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌中的至少3種肺炎菌類作為檢出對象的肺炎病原菌的檢出方法，其特征在于，該檢出方法具有I)由從試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸，利用引物，作為單鏈核酸擴增的步驟(a)，2)制備選自與擴增產物互補的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種探針對的步驟(b)，3)使至少3種各肺炎菌的第I探針結合到標記高分子載體上，制備第I探針結合標記高分子載體的步驟(C)，4)制備使與第I探針成對的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識別的規定位置固相化而成的第2探針負載展開支持體的步驟(d)，5)將上述擴增產物雜交到負載在展開支持體上的第2探針以及結合在標記高分子載體上的第I探針而進行檢出的步驟(e)，6)通過判定檢出圖像來進行評價的步驟(f)的各步驟；(2)根據上述⑴記載的檢出方法，其特征在于，引物為選自由序列號21表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號31表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號22表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號23表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號24表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號34表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號25表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號26表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列 號36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號27表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號37表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號28表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號38表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號29表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號30表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對；(3)根據上述(I)或者(2)記載的檢出方法，其中，至少3種的各肺炎菌的第I探針由選自序列號I 10表示的核苷酸序列中的至少3種DNA構成，與第I探針成對的至少3種的各肺炎菌的第2探針為選自序列號11 20表不的核苷酸序列中的至少3種DNA。此外，本發明涉及(4) 一種試劑盒，該試劑盒為以選自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌中的至少3種肺炎菌類作為檢出對象的肺炎病原菌的檢出試劑盒，其特征在于，該試劑盒具有選自可以擴增由試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸的、由序列號21表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號22表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號23表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號24表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號34表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號25表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號26表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號27表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號28表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號38表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號29表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號30表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對；(5)根據上述(4)記載的試劑盒，其特征在于，該試劑盒進一步具有I)選自與擴增產物互補的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種各肺炎菌的第I探針結合在標記高分子載體而成的第I探針結合標記高分子載體，2)與第I探針成對的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識別的規定位置固相化而成的第2探針負載展開支持體；(6)根據上述(5)記載的試劑盒，其特征在于，至少3種的各肺炎菌的第I探針由選自序列號I 10表示的核苷酸序列中的至少3種DNA構成，與第I探針成對的至少3種的各肺炎菌的第2探針為選自序列號11 20表不的核苷酸序列中的至少3種DNA。
通過本發明，在診斷肺炎患者時，可以利用簡便的方法迅速且正確地鑒定肺炎病原菌。


圖I為表示以8株卡他莫拉菌為對象，利用引物對的驗證數據的圖。圖2為表示利用本發明中所用的肺炎菌特異性的引物對，肺炎鏈球菌的利用NASBA法擴增靶基因的RNA的數據的圖。圖3為表示利用本發明中所用的肺炎菌特異性的引物，嗜肺軍團菌的利用NASBA法擴增靶基因的RNA的數據的圖。圖4為表示利用本發明中所用的肺炎菌特異性的引物對，肺炎克雷伯菌的利用NASBA法擴增靶基因的RNA的數據的圖。圖5為表示利用本發明中所用的肺炎菌特異性的引物對，卡他莫拉菌的利用NASBA法擴增靶基因的RNA的數據的圖。圖6為表示利用本發明中所用的肺炎菌特異性的引物對，金黃色葡萄球菌的利用NASBA法擴增靶基因的RNA的數據的圖。圖7為表示利用本發明中所用的肺炎菌特異性的引物對，肺炎支原體的利用NASBA法擴增靶基因的RNA的數據的圖。圖8為表示利用本發明中所用的肺炎菌特異性的引物對，肺炎嗜衣原體的利用NASBA法擴增靶基因的RNA的數據的圖。圖9為表示實施本發明所用的10對引物的多重化時，各引物對與靶菌以外的對象菌有無非特異性反應的驗證結果的圖。圖10為表示對于嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血桿菌，通過使用多重引物的NASBA法檢出靶RNA擴增產物的圖。圖11為表示對于金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體，使用對應于各菌的引物對，通過使用多重引物的NASBA法進行RNA擴增時，檢出靶RNA擴增產物的圖。圖12為表示對于卡他莫拉菌，通過實時PCR確認利用NASBA擴增的RNA為目的的靶NASBA產物的圖。圖13為表示本發明的核酸色譜法的一個具體例子的示意圖。圖14為表示對各肺炎菌專用探針間的非特異結合進行研究的圖。圖15為表示對于嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體，使用對應于各菌的引物對，分別利用NASBA法進行RNA擴增時，通過核酸色譜檢出靶RNA擴增產物的圖。圖16為表示各探針與靶菌以外的對象菌有無非特異性反應的驗證結果的圖。
圖17為表示對于嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體，使用對應于各菌的引物對，通過使用多重引物的NASBA法進行RNA擴增時，通過核酸色譜檢出靶RNA擴增產物的圖。圖18為將肺炎病原菌5菌株用于本發明的核酸色譜測定用試驗片的圖。
具體實施例方式作為本發明的檢出肺炎病原菌的方法，若為具有I)由從試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸，利用引物，作為單鏈核酸擴增的步驟(a)，2)制備選自與擴增產物互補的序列號I 20表示的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種探針對的步驟(b)，3)使選自序列號I 10表示的核苷酸序列中的至少3種各肺炎菌的第I探針結合到標記高分子載體上，制備第I探針結合標記高分子載體的步驟(c)，4)制備使選自序列號11 20表示的核苷酸序列中的、與第I探針成對的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識別的規定位置固相化而成的負載固相化第2探針的展開支持體的步驟(d)，5)將上述擴增產物雜交到負載在展開支持體上的固相化第2探針以及結合在標記高分子載體上的第I探針而檢出的步驟(e)，6)通過判定檢出圖像來進行評價的步驟(f)的，以選自10種檢出對象肺炎菌中的至少3種檢出對象肺炎菌作為檢出對象的方法，則不特別限定，但是作為檢出對象肺炎菌，優選檢出至少5種，即5 10種。作為本發明的檢出肺炎病原菌的方法，也可以使用具有1)制備選自可以擴增由試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸的由序列號21表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號22表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號23表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號33表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號24表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號34表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號25表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號26表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號27表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號28表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號38表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號29表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號39表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號30表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對的步驟(a’)，2)使有可能含有檢出對象的肺炎菌類的核酸的被檢試樣與至少3種嵌合引物對接觸，利用RNA擴增法擴增基因產物的步驟(b’)，3)定性·定量作為擴展產物的靶核酸的步驟(c’ )的，以選自10種檢出對象肺炎病原菌中的至少3種檢出對象肺炎病原菌作為檢出對象的方法。該方法中，作為檢出對象肺炎菌，優選檢出至少5種，即5 10種。上述檢出對象肺炎菌為3種時，可以舉出由下述構成的120組的3種肺炎菌類的組合多在外來患者中檢出的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌以及肺炎嗜衣原體(以下也稱為“外來患者用檢出對象肺炎菌”)中，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及肺炎支原體，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及嗜肺軍團菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及肺炎嗜衣原體等3種組合，由于醫院內感染多在住院患者中檢出的銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、MRSA、卡他莫拉菌(以下也稱為“住院患者用檢出對象肺炎菌”)中，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌以及金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌以及MRSA，銅綠假單胞菌、MRSA以及卡他莫拉菌，金黃色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌 等3種組合，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及銅綠假單胞菌等3種組合等。上述檢出對象肺炎菌為4種時，可以舉出由下述構成的210組的4種肺炎菌類的組合在外來患者用檢出對象肺炎菌中，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體以及嗜肺軍團菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體以及肺炎嗜衣原體，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌以及肺炎嗜衣原體，肺炎鏈球菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌以及肺炎嗜衣原體，流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌以及肺炎嗜衣原體等4種組合，在住院患者用檢出對象肺炎菌中，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌以及MRSA，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA以及卡他莫拉菌，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌等4種組合，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌以及MRSA等4種組合等。上述檢出對象肺炎菌為5種時，可以舉出除了外來患者用檢出對象肺炎菌5種、住院患者用檢出對象肺炎菌5種之外，還有由下述構成的252組的5種肺炎菌類的組合肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、MRSA以及金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、銅綠假單胞菌以及肺炎嗜衣原體，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、MRSA以及卡他莫拉菌等。上述檢出對象肺炎菌為6種時，可以舉出由下述構成的210組的6種肺炎菌類的組合外來患者用檢出對象肺炎菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌、肺炎嗜衣原體以及銅綠假單胞菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、銅綠假單胞菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。上述檢出對象肺炎菌為7種時，可以舉出由下述構成的120組的7種肺炎菌類的組合外來患者用檢出對象肺炎菌、MRSA以及金黃色葡萄球菌，外來患者用檢出對象肺炎菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、銅綠假單胞菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。 上述檢出對象肺炎菌為8種時，可以舉出由下述構成的90組的8種肺炎菌類的組合外來患者用檢出對象肺炎菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，外來患者用檢出對象肺炎菌、銅綠假單胞菌、MRSA以及金黃色葡萄球菌，外來患者用檢出對象肺炎菌、銅綠假單胞菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、銅綠假單胞菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。上述檢出對象肺炎菌為9種時，可以舉出由下述構成的10組的9種肺炎菌類的組合外來患者用檢出對象肺炎菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌以及肺炎克雷伯菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。作為上述步驟(a)中的制備擴增產物的方法，若為將從有可能含有檢出對象肺炎菌的試樣中任意抽提的上述各檢出對象肺炎菌特異性靶核酸，利用可以擴增該靶核酸的引物，作為單鏈核酸進行擴增的方法則不特別限定。作為上述各肺炎菌特異性的靶核酸，可以舉出肺炎鏈球菌的lytA、流感嗜血桿菌的dnaj、肺炎支原體的dnajl、肺炎嗜衣原體的dnaj、金黃色葡萄球菌的spaA、MRSA的mecA、嗜肺軍團菌的dnaj、卡他莫拉菌的dnaj、銅綠假單胞菌的dnaj、肺炎克雷伯菌的dnaj中所含區域的核酸。上述步驟(a)或者(a’)中所用引物對是可以擴增10種檢出對象肺炎菌中的各肺炎菌特異性的靶核酸的引物對，是含有選自序列號21 40表示的核苷酸序列中的因各檢出對象肺炎菌而不同的靶序列的引物對。更具體的說，對于肺炎鏈球菌來說，使用含有5’-CAATCTAGCAGATGAAGCAGG-3，(序列號 21)和 5’ -GGTTGTTTGGTTGGTTATTCG-3，(序列號31)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于流感嗜血桿菌來說，使用含有5’ -TCAATACTCTTGCACATTGTGAT-3’ (序列號22)和5，-ATACGAAGAAACCTTGCTGAC-3’(序列號32)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于肺炎支原體來說，使用含有5’ -CCGGGATGGTTAGCTGTAACAG-3’(序列號 2 和 5’ -TACCTTCTTGTACTTACTTCC-3 ’ (序列號33)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于肺炎嗜衣原體來說，使用含有5’ -CATGGTGTTGAGAAGGAACTTGTAGT-3’ (序列號24)和5，-TCCACGACTCTGTACCACTTG-3’(序列號34)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于嗜肺軍團菌來說，使用含有5’ -CGTCAATCACGTGGACAAAGAG-3’(序列號 25)和 5’ -AGTACCATGTCTTGGAACGGT-3 ’ (序列號35)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于克雷伯菌來說，使用含有5’ -GAAGTTCCGATCAACTTCAC-3’(序列號26)和5’ -AAGCTCTCCTGAAGCTCTTT-3’(序列號36)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于銅綠假單胞菌來說，使用含有 5’ -ACAGGGATCGGAAATCAT-3’(序列號 27)和 5’ -CGCGGACCTGCGCTACACCCTGGACC-3 ’(序列號37)表不的祀核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于卡他莫拉菌來說，使用含有5’ -CAAAGGCTTGCCCAAAGATA-3’ (序列號28)和5’ -GAAGCCGAAGAAAAGCTCAA-3’(序列號38)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于MRSA來說，使用含有 5’ -GTATGTGGAAGTTAGATTGGG-3’(序列號 29)和 5’ -GATACATTCTTTGGAACGAT-3 ’ (序列號39)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于金黃色葡萄球菌來說，使用含有5’ -GAGTACATGTCGTTAAACCTGGTG-3 ’(序列號30)和5’-TACAGTTGTACCGATGAATGG-3’(序列號40)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合。此外，取代上述序列，對于肺炎克雷伯菌來說，也可以使用含有 5’ -AGCGTATGAAATCCTGACTGAT-3’ (序列號 54)和 5’ -CAAAGATATCGCTGAAGTCG-3 ’ (序列號56)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的引物對的組合，對于銅綠假單胞菌來說，也可以使用含有5’ -GCGAGGTGTCGCTCTGCAAC-3’ (序列號55)和5’-GATGTGCAAGGTGGTGGTGGA-3’(序列號57)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構成的弓I物對的組合。作為上述正向引物，使用由序列號21 30、54或55表不的核苷酸序列構成的引物。對于這些因各檢出對象肺炎菌而不同的10種各靶序列的5’末端側可以附加標簽序列。作為上述標簽序列，可以舉出5’-TAGCAGGATCCCTCTAAG-3’ (序列號41)。作為上述反向引物，使用由序列號40、56或57表示的核苷酸序列以及附加于這些因各檢出對象肺炎菌而不同的10種各靶序列的5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的引物。作為上述RNA聚合酶啟動子序列，可以舉出T7RNA聚合酶的啟動子序列、T3RNA聚合酶的啟動子序列、SP6RNA聚合酶的啟動子序列等，但是其中T7RNA聚合酶的啟動子序列由于高的RNA擴增效率而優選。作為T7RNA聚合酶的啟動子序列，可以舉出例如5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG-3’ (序列號 42)、5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGAG-3’ (序列號 43)。上述序列號 21 40 或者54^57表示的核苷酸序列中，即使I個堿基或者幾個(例如Γ5個，優選Γ3個，更優選f 2個，進ー步優選I個)堿基缺失、置換或者附加，只要可以擴增各肺炎菌特異性的靶核酸，則也可以用作本發明中的引物。上述正向引物、反向引物，可以使用DNA合成裝置通過常規方法合成。作為上述步驟(a)或者(b’ )中的有可能含有檢出對象的肺炎菌類的核酸的被檢試樣，可以舉出肺炎患者的唾液、咳痰、外周血、支氣管肺泡洗滌液、鼻腔洗滌液、漱ロ液、鼻咽拭子以及它們中含有的微生物、上述微生物培養物的細胞溶解液等。作為用于從上述被檢試樣抽提核酸的方法，除了使用硫氰酸胍的RNA抽提法、使用EDTA-SDS-苯酚-こ醇的核酸抽提法等公知的方法之外，還可以使用Extragen II (東ソー社制)、Mora-Extract (Advanced Microorganism Research 公司制)等市售品。可以將抽提的 RNA、DNA適當進行斷裂處理，制備含有I個或者多個的靶RNAJE DNA的5’側序列和3’側靶特異性序列的RNA、DNA。靶核酸為靶RNA時，為了擴增上述步驟(a)或者(b’ )中所用的靶核酸，可以使用NASBA法、轉錄介導擴增法(TMA法)、利用轉錄酶和逆轉錄酶的協同反應的RNA擴增 檢出法(Transcription Reverse Transcription Concerted Reaction, TRC 法)等公知的 RNA擴增法，但是可以有利地利用NASBA法、特別是國際公開2009/057330號小冊子中記載的NASBA法。該NASBA法是通過RNA聚合酶、逆轉錄酶擴增試樣中的靶RNA的方法，例如國際公開2009/057330號小冊子中記載的NASBA法中公開了由下述步驟構成的方法(A)將含有相當于靶RNA的5’側靶特異性序列的DNA序列的序列號f 10表示的嵌合引物的5’末 端固定于基板表面上，制備固相DNA( + )引物的步驟；(B)制備在含有與靶RNA的3’側序列互補的cDNA序列的引物的5’末端側附加了 T7RNA聚合酶啟動子序列的、序列號If 20表示的液相cDNA(-)引物的步驟；(B’)根據需要，制備在標簽序列的5’末端附加了 RNA聚合酶啟動子序列的液相通用引物的步驟；(C)制備含有靶RNA的3’側序列和5’側靶特異性序列的試樣RNA的步驟；(D)使步驟(B)中制備的液相cDNA(-)引物與步驟(C)中制備的試樣RNA鏈在液相中接觸，使液相cDNA (-)引物與試樣RNA雜交，然后通過逆轉錄酶延伸DNA㈠鏈，制備cDNA鏈-RNA鏈復合體的步驟；(E)使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于步驟⑶中制備的cDNA鏈-RNA鏈復合體，制備單鏈DNA (-)的步驟；(F)使步驟(E)中制備的單鏈DNA(-)與步驟(A)中制備的固相DNA(+)引物在液相中接觸，使單鏈DNA (-)與固相DNA⑴引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚合酶活性能的酶延伸DNA⑴鏈，制備雙鏈DNA的步驟；(G)使RNA聚合酶作用于步驟(F)中制備的雙鏈DNA，利用來自DNA(-)鏈的RNA聚合酶啟動子序列，擴增單鏈RNA(-)的步驟。靶核酸為靶DNA時，為了擴增上述步驟(a)或者(b’ )中所用靶核酸，可以使用NASBA法、PCR法、鏈置換擴增法(SDA法)、連接酶鏈反應法(LCR法)等。作為正向引物，使用選自序列號21 30、54或55表不的核苷酸序列中的引物,作為反向引物,使用含有序列號31 40、56或57表不的核苷酸序列的引物。上述步驟(b)中使用的探針對，為選自與上述擴增產物互補的核苷酸序列中的因各肺炎菌而不同的探針對，例如為選自序列號廣20表示的核苷酸序列中的因各肺炎菌而不同的探針對，序列表中為了方便以DNA序列表示，但是可以為由DNA的核苷酸序列構成的探針對，或由RNA的核苷酸序列構成的探針。但是由于作為探針的穩定性優異，優選為由DNA的核苷酸序列構成的探針對。作為成為上述檢出對象的因各肺炎菌而不同的探針對，可以具體地表示為肺炎鏈球菌的 5’ -ACGCACGAGTATTGCACGAATAACC-3’(序列號 I)和 5’ -TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGT-3’(序列號 11),流感嗜血桿菌的 5’ -AAACTTGTCCGCATTGCCACGGTTC-3’(序列號 2)和5’ -CTCTGGGGCTGAAAAAGGTTCTAAAG-3’ (序列號 12)，肺炎支原體的 5’ -AGGCCAAACACAAGTGTAAGACTTG-3’ (序列號 3)和 5’ -AGAATCAACGCTCCATCTTTGGTAC-3 ’ (序列號 13)，肺炎嗜衣原體的 5’ -ATCTTGTGAAACCTGTTCTGGTCAA-3’ (序列號 4)和 5’ -TCAAGGGATTAAATCCTGCGAACGT-3’ (序列號 14)，嗜肺軍團菌的 5’ -GAAGTTGAAATTACCGTTCCAAGAC-3’ (序列號 5)和 5’-CAATTGACCCTTGAAGAAGCAGCTA-3’ (序列號 15)，肺炎克雷伯菌的 5’-GTGGTGGAGACGCCGGTGGGGCTGA-3’ (序列號 6)和 5 ’ -TGAAACCCAGACCGGCAAGCTGTTC-3 ’ (序列號 16)，銅綠假單胞菌的 5’ -GGTGACCGGTGTGGTGCCGG-3’ (序列號 7)和 5’ -GTCTTGCAACCGACCAGGGTCGGCA-3’ (序列號 17)，卡他莫拉菌的 5’ -GGTTGCGCGTTTTTCAGGATCACTG-3’ (序列號 8)和 5’ -CCACCAGAGCCCATGCCTTGTTCAT-3’ (序列號 I8) ,MRSA 的 5’ -AGACCGAAACAATGTGGAATTGGC-3’ (序列號9)和 5’ -ATGCAGAAAGACCAAAGCATACATAT-3’ (序列號 19)，以及金黃色葡萄球菌的 5’ -CATGATCAAACCTGGTCAAGAACTTG-3’(序列號 10)和 5’-CGGCACTACTGCTGACAAAATTGCT-3’(序列號20)的組合。此外，作為探針對，也可以使用流感嗜血桿菌的5’-AACTTGTCCGCATTGCCACGGTTCT-3’ (序列號 44)和 5’ -TGTGATAGCTGTGGTGGCTCTGGGG-3’ (序列號 49)，肺炎嗜衣原體的 5’ -TCAAGGGATTAAATCCTGCGAACGT-3’ (序列號 45)和 5’ -ATCTTGTGAAACCTGTTCTGGTCAA-3’ (序列號 50)，嗜肺軍團菌的 5’ -AAGAAGCAGCTATAGGAAAAGAAGT-3’ (序列號 46)和 5’ -GGGGCGCTGATTTGCAATTTAATGT-3 (序列號 51)，肺炎克雷伯菌的 5’-TCGAACAGGGCGGCATGGGCGG CGG-3’ (序列號 47)和 5’ -CAGAAGCGTGCGGCCTACGATCAGT-3’ (序列號 52)，銅綠假單胞菌的5’-TCCAGGTTCACCGGGGITTCCACC-3’ (序列號 48)和 5 ’-GCTCTGCAACGACTTGCGGAACTC-3 ’ (序列號53)的組合。可以將上述10種探針對中的任意ー種作成步驟(C)中的第I探針或者步驟(d)中的第2探針，或根據預想其存在的檢出對象肺炎菌等適當選擇 確定。此外，上述序列號1^20或者44 53表示的核苷酸序列中，即使I個堿基或者幾個(例如I、個,優選為3個，更優選為Γ2個，進ー步優選為I個)堿基缺失、置換或者附加，只要可以檢出各肺炎菌特異性的靶核酸，則可以用作本發明中的探針。作為上述步驟(C)中的第I探針，可以舉出與上述第2探針成對的至少3種探針，例如選自序列號I 10表不的核苷酸序列中的與第2探針成對的至少3種、優選至少5種的各肺炎菌的第I探針，例如，可以同時使用2組的5種各肺炎菌的第I探針結合在標記高分子載體上而成的第I探針結合標記高分子載體。作為將上述多種第I探針結合到標記高分子載體上的方法，可以舉出將具有在5’或者3’末端引入了附加基團的序列號I 10表示的核苷酸序列的DNA，結合到引入了附加基團的標記高分子載體上的方法。作為上述附加基團，可以舉出氣基、竣基、輕基、疏基等。例如，標記聞分子載體被竣基修飾時優選為氣基。此外，由于將多個第I探針結合在一個標記高分子載體上，這種情況，在檢出吋，由于沒有必要像以往那樣將ー個第I探針結合在一個標記高分子載體而成的第I探針結合標記高分子載體多種混合，所以不僅檢出操作簡便，而且可以將標記膠乳等下述的標記高分子載體濃度設定到最優濃度，所以優選。本發明的ー個具體例以示意圖方式如圖13所示。作為上述標記高分子載體中的高分子載體，可以舉出羧基甲基纖維素(CMC)、具有羧基的聚丙烯酸鹽等親水性樹脂，丙烯酸類膠乳、聚酯類膠乳、聚苯こ烯類膠乳、聚氨酯類膠乳、聚こ酸こ烯酯類膠乳、SBR樹脂、NBR樹脂、聚酰胺類膠乳、羧基改性聚苯こ烯類膠乳等膠乳等，而向上述序列號I 10表示的核苷酸序列中引入氨基時，利用通過氨基和羧基產生共價鍵的反應，容易將選自序列號I 10表示的核苷酸序列中的至少3種、優選至少5種各肺炎菌的第I探針結合到標記高分子載體上，所以優選為在聚苯こ烯類膠乳中引入羧基而成的羧基改性聚苯こ烯類膠乳，具體地說，可以使用含羧基的聚苯こ烯膠乳(固體成分4%(w/w)) (Duke Scientific公司制)、含羧基的聚苯こ烯膠乳(固體成分10%(w/w))(Bangs公司制)ο作為具體的結合了多個第I探針的標記高分子載體的第I探針結合標記高分子載體的制備方法，可以舉出例如將在選自序列號I 10表示的核苷酸序列中的至少3種各肺炎菌的5’末端引入了氨基的第I探針、和含羧基的聚苯こ烯膠乳(Bangs公司制)、和水溶性碳化ニ亞胺在 50mM 的 MES (2-嗎啉こ橫酸一水合物，2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate)(同仁化學研究所社制)緩沖液中混合，使膠乳中的羧基與第I探針的氨基結合后，添加單こ醇胺(和光純藥エ業社制)，進ー步進行反應，將上述反應液離心分離后除去上清液，對得到的沉淀用含有非離子性表面活性劑的HEPES (2-[4-(2-羥基こ基)-1-哌嗪基]こ橫酸，2_[4_ (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonicacid)(埼京化成社制)緩沖液洗滌以及再懸浮來制備的方法。此外，高分子載體的粒徑尺寸可以適當選擇，但是，優選從比膜孔徑小的粒徑中選擇，例如可以選擇直徑500nm以下的粒子尺寸。 此外，作為上述標記高分子載體，可以使用呈現出可以與展開支持體的顔色區別的顔色的高分子載體，也可以使用用顔料等著色的高分子載體，除此之外還可以使用熒光標記高分子載體。作為上述步驟(d)中的第2探針，可以舉出與上述第I探針成對的至少3種探針，例如選自序列號11^20表不的核苷酸序列中的與第I探針成對的至少3種,優選至少5種的各肺炎菌的第2探針。上述第2探針固相化在支持體上，可以使ー個第2探針在支持體的規定位置固相化(專用)，也可以使多個第2探針在支持體的規定位置固相化(共用)。作為制備負載展開第2探針的支持體的方法，可以舉出在各肺炎菌展開支持體上可以識別的規定位置固相化第2探針的方法。可以舉出例如將在5’或者3’末端引入了附加基團的具有序列號If 20表示的核苷酸序列的探針在展開支持體上固相化的方法。作為上述附加基團，可以舉出氨基、羧基、羥基、巰基等，但是例如展開支持體被羧基修飾時優選為氨基，無論有無附加上述附加基團，都可以利用化學合成法等公知的方法制備第2探針。作為上述展開支持體，可以舉出尼龍膜或羧基修飾尼龍膜等尼龍膜衍生物、纖維素膜或硝酸纖維素膜等纖維素膜衍生物等。但是，在上述序列號If 20表示的核苷酸序列中引入氨基時，利用通過氨基和羧基產生共價鍵的反應，容易將選自序列號1廣20表示的核苷酸序列中的至少3種、優選至少5種的各肺炎菌的第2探針在展開支持體上的可以識別的規定位置上固相化，所以優選為羧基修飾尼龍膜。作為負載第2探針的展開支持體的具體的制備方法，可以舉出例如將羧基修飾尼龍膜用水溶性碳化ニ亞胺處理，用去離子水洗滌使其活化，在上述活化的羧基修飾尼龍膜上，將具有第2探針序列的核苷酸適當在所分配的規定位置固相化以對于各肺炎菌可以識另O，風干15分鐘，之后對固相化了具有第2探針序列的核苷酸的羧基修飾尼龍膜用Tris基礎緩沖液處理，由此除去活性基團，將固相化了核苷酸的膜用去離子水洗滌來制備的方法。作為具有第2探針序列的核苷酸的固相化的方式不特別限定，可以為線狀或圓形點狀。作為步驟(e)中的檢出上述擴增產物的方法，若為將所擴增的單鏈核酸雜交到負載在展開支持體上的第2探針以及結合在標記高分子載體上的第I探針而檢出的方法則不特別限定，但是優選預先將多個第I探針結合在標記高分子載體上而成的第I探針結合標記高分子載體保持在保持部，作為上述保持部，可以合適地舉出ADVANTEC制的吸收墊。通過將由保持了上述第I探針結合標記高分子載體的吸收墊等構成的保持部與上述負載第2探針的展開支持體的另一端依次連接，可以形成可以有利地用于本發明的檢出方法的核酸色譜用試驗片。作為保持部的制造方法，可以舉出將結合多個具有第I探針序列的核苷酸的標記聞分子載體涂布在保持部，并進行干燥的方法。步驟(e)中，作為將上述步驟(a)中的擴增產物雜交到負載在展開支持體的第2探針以及結合在標記高分子載體上的第I探針而檢出的方法，例如可以將上述核酸色譜用試驗片浸潰在含擴增產物的溶液中，由此將上述第I探針結合標記高分子載體從上述保持部浸出到展開支持體，到達展開支持體上的與第I探針成對的各檢出對象肺炎菌的第2探針固相化的規定位置時，在上述規定位置上，使上述擴增產物三明治雜交，由此捕捉。即使擴增產物中存在多種靶單鏈核酸時，也會依次在規定位置被各第2探針捕捉。然后，在步驟(f)中，通過結合了具有第I探針序列的核苷酸的標記高分子載體在 到達具有第2探針序列的核苷酸在展開支持體上固相化的位置的規定位置蓄積，將出現在規定位置的著色線或者著色點等的有無作為檢出圖像，直接或者用熒光可視化裝置進行判定，由此可以進行評價，通過上述評價可以檢出檢出對象肺炎菌(肺炎病原菌)。而且，從簡便性的觀點考慮，上述判定優選為目視判定。此外，對于由序列號廣10表示的序列構成的第I探針可以替代或者追加使用由序列號44 48表不的序列構成的核苷酸,對于由序列號11 20表不的序列構成的第2探針可以替代或者追加使用由序列號49 53表示的序列構成的核苷酸。作為步驟(c’ )中的定性·定量靶核酸的方法，可以舉出電泳、雜交法、測序法。作為電泳法，可以舉出通過利用瓊脂糖凝膠的分子篩效果進行擴增產物的分子量解析的方法，利用毛細管電泳的ァジレン卜テクノロジー株式會社的解析系統。作為雜交法，可以舉出像實時PCR那樣，利用實時監控用試劑實時監控擴增產物的生成過程并進行解析的方法。作為實時監控試劑，可以舉出例如TaqMan(注冊■商標Applied Biosystems公司制)探針等。雜交法中也可以含有Northern印跡法。作為測序法，可以舉出利用雙脫氧核苷酸堿基特異性終止DNA聚合酶的合成的雙脫氧法等。作為本發明的肺炎病原菌的檢出試劑盒，可以用于上述本發明的肺炎病原菌的檢出方法，可以舉出具有選自可以擴增由試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸的由序列號21表的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號31表的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號22表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號32表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號23表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號33表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號24表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號34表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號25表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號26表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號27表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號37表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號28表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號29表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號39表不的核苷酸序列及附加于其5 ’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號30表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物，由序列號54表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號56表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物，由序列號55表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號57表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種，優選至少5種，即5 10種引物對的試劑盒，上述試劑盒，除了上述引物對之外，還可以具有上述步驟(b’ )中的RNA擴增法中使用的各種試劑類、上述步驟(c’ )中的為了定性·定量靶核酸而使用的各種試劑類。此外，也可以為具有由從試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸、使用引物作為單鏈核酸擴增的擴增集，選自與擴增產物互補的核苷酸序列、例如序列號I 10或者44^48表示的核苷酸序列中的至少3種各肺炎菌的第I探針結合在標記高分子載體上而成的第I探針結合標記高分子載體，和與第I探針成對的第2探針、例如選自序列號11 20或者49 53表示的核苷酸序列中的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識別的規定位置固相化而成的各肺炎菌專用的或者多個肺炎菌共用的第2探針負載展開支持體的試劑盒，可以合適地舉出具有上述擴增集和上述核酸色譜用試驗片的試劑盒。上述試劑盒可以合適地用于上述本發明的肺炎病原菌的檢出方法中。以下舉出實施例對本發明進行更具體的說明，但是本發明的范圍不被這些例子所限定。
實施例[卡他莫拉菌dnaj引物的設計]迄今，卡他莫拉菌的基因組信息未得到解讀，雖然基于近緣屬種的dnaj基因序列進行了設計，但是難以設計本菌特異性的引物。另ー方面，近年僅清楚本菌的基因組序列信息，因此基于該序列，通過ORF抽提，利用ァライメン卜ソフトDNASISpro (HitachiSoftware公司制)實施dnaj基因的注釋，由該序列嘗試新的引物的設計。利用8株卡他莫拉菌菌株實施新的引物的驗證，作為試劑盒，根據記載的協議，利用TaKaRaPCR ThermalCyclerGP，作為儀器，利用 EX Taq Hot start (TaKaRa bio 公司制)，在 95°C、3min，(95°C、IOsec, 65 °C > IOsec, 72 °C > IOsec) X40個循環的條件下實施PCR。所得的PCR產物，用MultiNA通過電泳解析。電泳結果如圖I所示。任意一種菌株中，所得到的PCR產物都擴增，因此可知新設計的引物對對于卡他莫拉菌的檢出是有用的。[多重化的研究](成為模板的RNA的制備)由于難以培養肺炎支原體以及肺炎嗜衣原體，通過利用質粒載體的DNA克隆，制備成為模板的RNA。克隆靶基因區域制備重組體。首先，將肺炎支原體或者肺炎嗜衣原體的靶基因dnaj的各DNA片段插入到質粒載體中后，分別將成為宿主的大腸桿菌轉化。由大腸桿菌抽提質粒后，通過PCR進行靶基因的DNA擴增，由所得到的PCR產物，利用RiboMAX(注冊商標)T7Express系統(Promega公司制)，根據協議擴增RNA，所得到的RNA作為NASBA法的模板。肺炎支原體及肺炎嗜衣原體以外的檢出對象肺炎菌的RNA通過常規方法制備。(通過NASBA法進行的RNA靶基因的擴增)作為正向引物，使用在選自序列號40表示的核苷酸序列中的各檢出對象肺炎菌10種各靶序列的5’末端側附加TAGCAGGATCCCTCTAAG(序列號41)而成的引物。作為反向引物，使用在各檢出對象肺炎菌不同的10種各靶序列的5’末端側附加作為T7RNA聚合酶的啟動子序列的CTAATACGACTCACTATAGGGAG(序列號43)的啟動子而成啟動子。從上述肺炎鏈球菌、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體7種標準菌株抽提得到的RNA作為模板，對每I種菌株實施NASBA法，表示擴增靶基因的 RNA 的數據。RNA 抽提利用 MORA-EXTRACT (Advanced Microorganism Research 公司制)、根據隨附協議實施，NASBA法利用NASBA Amplification試劑盒(力イノス制)、根據隨附協議實施。作為肺炎鏈球菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、 卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌的各模板的RNA試樣分別使用稀釋到I、1/10、1/100、1/1000倍的稀釋物，利用Bio Analyzer、Agilent RNA Pico 6000進行。作為對照，制備未添加酶的反應液，實施同樣的步驟。結果如圖21所示。確認對于全部靶檢出對象肺炎菌，通過NASBA法RNA都擴增。(各引物間的特異性的驗證)實施本案引物10對的多重化時，驗證各引物是否與靶菌以外的對象菌產生非特異反應。結果如圖9所示。本案引物10對的全部引物中都未發現非特異反應。(通過利用多重引物的NASBA法擴增靶RNA)對于嗜肺軍團菌、銅綠假單胞菌、肺炎嗜衣原體、MRSA、流感嗜血桿菌，利用本案引物對進行多重化的研究結果如圖10所示。此外同樣地，對于金黃色葡萄桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體，利用本案引物對進行多重化的研究結果如圖11所示。確認全部靶檢出對象肺炎病原菌菌株的RNA都通過NASBA法擴增。(NASBA產物的確認)需要判斷通過NASBA法擴增的RNA是否具有靶序列。以作為NASBA反應的副產物合成的DNA作為靶，實施實時PCR，測定NASBA產物和NASBA未反應樣品的対照的Ct值，通過比較其差間接地確認祀NASBA產物。利用SYBR premixEX Taq Hot start (TaKaRa bio公司制)，根據協議,PCR 在 95°C、3min，(95°C、IOsec，65。。、IOsec，72°C、IOsec) X 40 個循環的條件下進行。在全部菌株中，間接地確認通過NASBA法擴增的RNA為目的的靶NASBA產物。卡他莫拉菌的例子如圖12所示。[探針對的確定]嘗試制備對于成為檢出對象的各檢出對象肺炎菌的下表I表示的基因區域的核酸的靶序列具有互補的序列的含有I對氨基的的寡核苷酸探針。[表 I]
菌株名基因區域
月帀炎鏈球(Streptococcus pneumoniaeノLytA
權利要求
1.一種檢出方法，該檢出方法為以選自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌中的至少3種肺炎菌類作為檢出對象的肺炎病原菌的檢出方法，其特征在于，該檢出方法具有以下的步驟(a) 步驟(f) 1)由從試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸，利用引物，作為單鏈核酸擴增的步驟(a), 2)制備選自與擴增產物互補的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種探針對的步驟(b)， 3)使至少3種各肺炎菌的第I探針結合到標記高分子載體上，制備第I探針結合標記高分子載體的步驟(c)， 4)制備使與第I探針成對的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識別的規定位置固相化而成的第2探針負載展開支持體的步驟(d)， 5)將所述擴增產物雜交到負載在展開支持體上的第2探針以及結合在標記高分子載體上的第I探針而進行檢出的步驟(e)， 6)通過判定檢出圖像來進行評價的步驟(f)。
2.根據權利要求I所述的檢出方法，其特征在于，引物為選自由序列號21表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號31表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號22表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號23表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號33表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號24表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號34表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號25表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號26表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號27表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號28表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號29表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號39表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號30表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對。
3.根據權利要求I或2所述的檢出方法，其特征在于，至少3種的各肺炎菌的第I探針由選自序列號I 10表示的核苷酸序列中的至少3種DNA構成，與第I探針成對的至少3種的各肺炎菌的第2探針為選自序列號11 20表示的核苷酸序列中的至少3種DNA。
4.一種試劑盒，該試劑盒為以選自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌中的至少3種肺炎菌類作為檢出對象的肺炎病原菌的檢出試劑盒，其特征在于，該試劑盒具有選自可以擴增由試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸的、由序列號21表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號22表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號23表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號24表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號34表不的核苷酸序列及附加于其5 ’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號25表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號26表不的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號27表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號28表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號38表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號29表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物、由序列號30表示的核苷酸序列構成的正向引物和由序列號40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側的RNA聚合酶啟動子序列構成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒進一步具有 1)選自與擴增產物互補的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種各肺炎菌的第I探針結合在標記高分子載體而成的第I探針結合標記高分子載體， 2)與第I探針成對的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識別的規定位置固相化而成的第2探針負載展開支持體。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，至少3種的各肺炎菌的第I探針由選自序列號I 10表示的核苷酸序列中的至少3種DNA構成，與第I探針成對的至少3種的各肺炎菌的第2探針為選自序列號11 20表示的核苷酸序列中的至少3種DNA。
全文摘要
本發明提供肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌的10種檢出對象肺炎菌的迅速且正確的檢出方法、檢出試劑盒。設計對于10種各肺炎病原菌的DnaJ基因等中含有的10菌種的各靶區域的引物對集，使用上述引物對集擴增基因產物。進一步設計將上述擴增產物雜交到與引物對集不同的10菌種的各靶區域內的序列的各菌株固有的探針對集。作為上述探針對集，使用結合了多個肺炎菌的第1探針的第1探針結合標記高分子載體、和固相化的第2探針負載展開支持體，進行核酸色譜法。
文檔編號C12N15/09GK102822352SQ20118001618
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月30日 優先權日2010年3月31日
發明者白井睦訓, 江崎孝行, 林司, 宇治家武史, 我那覇誠, 山本茂一 申請人:有限會社山口技術特許機構