專利名稱：小金海棠MxHA5蛋白及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及ー種小金海棠MxHA5蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
鐵是人體所必需的礦質元素。因為植物是世界人ロ主要的食用鐵來源，所以植物含鐵量低了直接會影響人類的身體健康。據世界衛生組織調查顯示，近20億人口遭受著貧血的折磨。早產、先天性缺陷病、智力發育遲緩和健康指數下降主要是由貧血引起的。研究表明，植物只能吸收土壤中的可溶性鐵-Fe (II)，但在堿性土壤(pH7. 4 8.5)中，可溶性鐵的濃度不到I(TltW)I *L-1，導致許多植物表現出缺鐵脅迫癥狀。植物輕度缺鐵會導致葉綠素合成減少和光合速率降低，嚴重缺鐵導致葉綠素合成停止，新葉變黃， 生物量大幅度下降。弄清鐵吸收和自動調節機能的分子機理，對改善植物和人類的營養失衡具有重大意義。為了有效地吸收和利用土壌中的鐵，植物在長期的進化過程中對缺鐵形成了廣泛的適應性。Romheld和Marschner教授在總結前人研究工作的基礎上首先提出了高等植物在長期適應缺鐵脅迫過程中所形成的兩種適應性機理——機制I和機制II。機理I植物指雙子葉植物和非禾本科單子葉植物。它們對缺鐵的適應性反應分為形態學變化和生理學變化。形態學上的變化包括形成大量的側根和特異的轉運細胞， 這兩種變化都可以增加植株發生氧化還原反應的表面積，并提高植株對鐵的轉運效率。 生理學上的變化由三個部分組成一個狗(111)還原酶系統、一個強有力的質子外泌泵 (H+-ATPase)和有機物質的分泌系統。這三個部分都位于形態上特化的根尖表皮細胞的細胞質膜上，并有效地對缺鐵脅迫發生反應。機理I植物必須先將狗(III)還原為!^e(II) 才能被吸收利用。在供鐵充足的條件下，植物的根部先將狗(III)-螯合物還原，把還原得到的 ^(ΙΙ)通過細胞質膜進行轉運；在缺鐵脅迫條件下，機理I植物通過激活一種特異的 H+-ATPase使土壌酸化，從而增加鐵的可溶性；同時分泌一些有機酸(鐵的鰲合劑)，將土壤中的!7e(III)以狗(111)-螯合物的形式溶解；然后通過細胞質膜上一種特異的根部還原酶將!^e(III)-螯合物還原。這種還原酶催化電子從胞質中還原態的吡啶核苷酸(NADH)跨膜傳遞給胞外作為電子受體的狗(III)-螯合物，使其還原成為狗(II)，然后再由質膜上的 Fe(II)轉運蛋白轉運進入根細胞。機理II植物僅指禾本科植物。禾本科植物在堿性土壤中生長時與雙子葉植物和非禾本科植物相比發生的缺鐵失綠癥狀很少，原因是禾本科植物分泌和釋放高鐵載體，高鐵載體與鐵結合形成載體復合物，并在質膜上產生ー種對植物鐵載體復合物具有高度親和力的吸收轉運系統，從而使禾本科植物可以有效地吸收和利用三價鐵來對抗環境中的鐵脅迫。高鐵載體為麥根酸類(MAs或!^)，這是ー類低分子量的非蛋白質氨基酸，對狗(111)有著強烈的親和能力井能形成穩定的、八面體的三價鐵鰲合物，并在質膜上產生ー種對む或 MAs具有高度親和カ的轉運蛋白YSL，由YSL將狗(III) -Ps轉運進胞質中，從而使禾本科植物可以有效地吸收和利用三價鐵來對抗環境中的鐵脅迫。
植物細胞質膜H+-ATPase屬P型ATPase，是質膜上的插入蛋白，具有利用水解ATP 產生的能量，將細胞質膜內側的H+泵到質膜外側的特征，簡稱為質子泵。它對植物細胞營養物質的吸收、細胞內的PH的調節、氣孔運動的調節、細胞伸長生長的調節和環境脅迫的調節等生理過程有重要的調節作用。此外，植物質膜H+-ATPase還參與種子萌發、細胞極性生長等生理過程的調節。植物細胞質膜H+-ATPaSe是植物生命活動的“主宰酶”。自從Hodges 等在離體質膜中證實AIPase活性以來，質膜H+-ATPase的研究受到了廣泛的重視。有研究表明，缺鐵條件下，黃瓜根系H+-AIPase活性升高，也會誘導黃瓜根系頂端細胞H+-AIPase蛋白和H+-ATPase的mRNA的增加。并且研究得出在缺鐵黃瓜的根部CsHAl 基因的轉錄水平提高了，而給缺鐵植株在重新供鐵以后CsHAl基因的轉錄水平會下降。目前，已經從擬南芥中發現了 12個H+-AIPase基因家族(AHA1 AHA12)。研究發現其中有5 個基因的表達受缺鐵脅迫的影響。在缺鐵脅迫下，其中AHA2和AHA7的表達量上調分別為 3. 3和4. O倍，AHA3和AHA4的表達量上調約2倍，AHAll的表達量下調約2倍。小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是ー個蘋果鐵高效基因型，屬于機理I植物。雖然已經有很多研究證明H+-AIPase基因對提高植物的耐性有很大作用， 但還未見關于小金海棠中質膜H+-ATPase基因的報導。
發明內容
本發明的目的是提供ー種小金海棠MxHA5蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白質，獲自小金海棠，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物中P型H+-ATPase酶活性相關的由(a)衍生的蛋白質。為了使(a)中的蛋白質便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
權利要求
1.ー種蛋白質，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過ー個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物中P型H+-ATPase酶活性相關的由(a)衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白的基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因為如下1)-4)中任一所述的DNA 分子1)序列表中序列2自5’末端第1至觀62位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2、所示的DNA分子雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；4)與1)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在干所述重組表達載體是如下(I) 或(II)(I)在PEZS-NL載體的多克隆位點間插入權利要求2或3所述基因得到的重組表達載體；(II)在PYES2.0質粒的多克隆位點間插入權利要求2或3所述基因得到的重組表達載體。
6.根據權利要求4所述的重組菌，其特征在于所述重組菌為將權利要求5的(II)所述重組表達載體導入酵母中得到的重組菌。
7.ー種獲得轉基因生物的方法，為如下①或②或③①將權利要求2或3所述基因導入出發生物中，得到P型H+-AIPase酶活性増加的轉基因生物；②將權利要求2或3所述基因導入出發生物中，得到對金屬離子脅迫的耐逆性増加的轉基因生物；③將權利要求2或3所述基因導入出發生物中，得到對金屬離子缺乏的耐逆性増加的轉基因生物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述生物為酵母，權利要求2或3所述基因通過權利要求5的(II)所述重組表達載體導入所述出發生物。
9.權利要求1所述蛋白，或權利要求2或3所述基因在培育轉基因生物中的應用；所述轉基因生物的P型H+-ATPase酶活性和/或對金屬離子脅迫的耐逆性和/或對金屬離子缺乏的耐逆性高于出發生物。
全文摘要
本發明公開了一種小金海棠MxHA5蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白質，獲自小金海棠，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物中P型H+-ATPase酶活性相關的由(a)衍生的蛋白質。本發明所提供的MxHA5基因對于缺鐵脅迫的植株具有很重要的調節作用，本發明為進一步研究小金海棠的耐缺鐵性提供了很好的理論依據。本發明對于培育耐逆植物具有重大價值。
文檔編號C12N9/14GK102559631SQ201210012499
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者張倩, 張新忠, 槐心體, 王憶, 許雪峰, 韓振海 申請人:中國農業大學