專利名稱：一種利用枯草桿菌高效生產重組脂肪氧合酶的方法
技術領域：
本發明屬于食品工業生物技術領域，涉及一種利用枯草桿菌高效生產重組脂肪氧合酶的方法。
背景技術：
脂肪氧合酶(Lipoxygenase，ECl. 13. 11. 12)，簡稱脂氧酶，屬氧化還原酶，可催化含順-順-1，4-戊二烯結構的不飽和脂肪酸(如亞油酸、亞麻酸等)及酯形成氫過氧化物， 生成的不穩定氫過氧化物能氧化面筋蛋白質形成二硫鍵，使蛋白質分子聚合，從而達到增強面筋的作用。脂氧酶還可以通過偶合反應破壞類胡蘿卜素的雙鍵結構，使得面粉漂白。因此，脂氧酶兼具面粉強筋和增白的功效，可以減少或替代化學強筋劑溴酸鉀及化學漂白劑過氧化苯甲酰的使用，降低其對人體健康的危害。但由于目前脂氧酶主要從動植物組織中分離提取獲得，產量低、純度不夠是制約其大規模應用的主要原因。脂氧酶的分離提取、結構分析和酶學性質研究是目前國內外學者的主要研究方向。對于如何實現脂氧酶的高效生產和工業化應用，目前國內相關研究甚少。食品用酶屬于大宗工業產品，下游一般采用低成本的分離提取手段，不能保證諸如大腸桿菌熱源物質完全去除；如果采用復雜的純化方法，則成本就成為應用的限制性因素。枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性細菌，是傳統的工業生產菌，分泌蛋白能力強，細胞壁結構簡單且不含內毒素，美國FDA將其列為GRAS (GeneralIy Recognized As Safe)級別的微生物。枯草桿菌表達系統已被成功地用于多種蛋白的表達，大部分是具有工業應用價值的酶， 尤其是蛋白酶和淀粉酶。雖然關于外源蛋白表達的研究枯草桿菌還遠遠落后于大腸桿菌， 但是在表達和分泌活性蛋白方面則明顯優于大腸桿菌，在食品基因工程研究中更具有大腸桿菌無法比擬的優越性。近年來關于枯草桿菌應用于食品基因工程的研究，越來越受到重視。隨著分子生物學和基因工程的飛速發展，有理由相信枯草桿菌表達系統將更加完善，成為原核蛋白表達的最佳宿主之一。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種利用枯草桿菌高效生產重組脂肪氧合酶的方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現一種利用枯草桿菌生產重組脂肪氧合酶的方法，包括如下步驟(1)構建含有魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌；(2)將所述的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌接種于裝液量為 58-63mL/250mL (表示每250ml三角瓶裝液58_63mL)的加入15_18g/L乳糖的LB培養基中， 27-300C、180rpm條件下培養85_90h，離心收集上清液。其中，步驟(1)構建含有魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌的方法為I.克隆魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX，其序列為SEQ ID NO. 1 ；II.魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX與分泌表達載體pHBSR連接得到 pHBSR-ana-LOX組成型重組表達載體；III. pHBSR-ana-LOX組成型重組表達載體電轉化枯草桿菌宿主WB800得到含有魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌。所述的分泌表達載體pHPSB通過如下方法構建i.構建載體 pHB-hc 合成一對引物 Pl :SEQ ID NO. 2/P2 =SEQ ID NO. 3，退火使之可以配對形成雙鏈，兩端形成Clal、XhoI的粘性末端；將退火雙鏈產物與PHB201先后經 ClaKHindIII酶切得到的5. 4kb大片段連接，得到載體pHB_hc ； 構建載體pHP43 以枯草芽孢桿菌168 (Invitrogen)基因組為模板，P43-F =SEQ ID NO. 4/P43-R =SEQ ID NO. 5為引物，PCR擴增獲得P43啟動子，P43啟動子經Xhol/Clal 雙酶切后插入經同樣雙酶切的載體pHB-hc中，得到載體pHP43 ；iii.構建載體pHP43R 以枯草桿菌168基因組為模板，P3 =SEQ ID NO. 6/P4 =SEQ ID NO. 7，為引物，PCR擴增獲得枯草桿菌淀粉酶E啟動子基因PamyE;以枯草桿菌168基因組為模板，P5 =SEQ ID NO. 8/P6 =SEQ ID NO. 9，為引物，PCR擴增獲得枯草桿菌分子伴侶 Sec分泌途徑分子伴侶I^rsA ；以P3為上游引物，以P6為下游引物，以PCR反應產物PamyE 和基因片段混合物為模板，利用PCR的方法擴增獲得啟動子PamyE介導的表達的表達框PamyE-PrsA ；載體pHP43用ClaI酶切后用去磷酸化酶處理，與經ClaI酶切的 PamyE-PrsA片段經T4連接酶連接獲得載體pHP43R ；iv.構建分泌表達載體pHBSR 以 SnprB-F :SEQ ID NO. 10/SnprB-R :SEQ ID NO. 11 為引物，以枯草桿菌168基因組DNA為模板PCR擴增SnprB信號肽，通過EcoRI/BamHI雙酶切反應獲得SnprB信號肽基因，與同樣雙酶切處理的pHP43R載體通過T4DNA酶連接獲得分泌表達載體pHBSR。步驟O)中加入的乳糖終濃度為16 17g/L，優選加入的乳糖終濃度為16. 9g/L。步驟O)中發酵溫度為28 30°C，優選發酵溫度為29. 71°C。步驟O)中發酵時間為87 89h，優選發酵時間為88. 49h。有益效果脂肪氧合酶在食品加工中，具有重要的應用價值，如強筋、漂白，此外可以應用于風味物質的合成過程。目前，脂肪氧合酶還未實現真正的商業化應用，這是由于從天然材料中分離純化成本過高，而基因工程菌研究也仍處于初期，且主要以大腸桿菌宿主為主。而大腸桿菌是一種不安全的宿主，不適合應用于食品領域。枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性細菌， 是傳統的工業生產菌，分泌蛋白能力強，細胞壁結構簡單且不含內毒素，美國FDA將其列為 GRAS (Generally Recognized As Safe)級別的微生物。然而目前還未見枯草芽孢桿菌表達脂肪氧合酶的報道。本發明構建了一種新型的枯草桿菌分泌表達載體，利用本發明構建的載體，將克隆獲得的魚腥藻基因組中的功能性LOX基因，實現了在枯草桿菌的高活性重組表達。在此基礎上，進一步利用高效分泌表達重組脂肪氧合酶的pHBSR-ana-LOX組成型重組表達載體構建魚腥藻脂肪氧合酶基因工程菌，采用Plackett-Burman設計法從影響重組菌發酵產脂氧酶的相關因素中篩選出顯著影響因子，并采用響應面中心組合設計法(Central Composite Design)研究顯著影響因子的交互作用并確定各因子的最佳組合，尋找到基因工程菌發酵產酶的最佳條件，在該最佳條件下，重組酶產量(酶活)達到167. 32U/mL，為其大規模的生產提供一定的指導。
圖1載體pHB-hc的獲得圖2載體pHP43的獲得圖3載體pHP43R的獲得圖4載體pHBSR的獲得圖5P1、P2退火雙鏈產物示意6重組魚腥藻脂肪氧合酶表達載體構建過程圖7影響重組枯草桿菌生產脂氧酶因素間交互作用的3D圖
具體實施例方式實施例1魚腥藻(Anabaena sp. PCC 7120)脂肪氧合酶基因克隆離心收集魚腥藻(Anabaena sp. PCC 7120)菌體，用上海生工基因組DNA提取試劑盒提取魚腥藻的基因組DNA。根據NCBI公布的基因組序列設計出兩個引物上游引物5，GGAGTGTCTGGTGCC3，(SEQ ID NO. 12)；下游引物5，CTAAATGTTGATACTCATCAT3，(SEQIDN0. 13)；在50 μ 1體系中，上、下游引物終濃度各為ΙμΜ，dNIPs終濃度為0. 2mM，魚腥藻基因組 DNA IOng, 2UPfu DNA 聚合酶。擴增程序為 94°C 3min ；30X (94°C 30s, 59°C 50s, 72°C 40s) ；72°C IOmin0瓊脂糖凝膠電泳，切膠，采用上海生工試劑盒回收，將回收的PCR產物與TaKaRapMD 19-T vector連接，轉化E. coli DH5a，涂于含有IPTG、Χ-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養13-14小時，挑白色菌落，振蕩培養，提取質粒，確定連接成功后送到上海生工測序。用計算機軟件DNAMAN分析測序結果，得到一個1368bp的0RF，即魚腥藻脂肪氧合酶基因ana-Lox，序列為SEQ ID N0. 1，編碼一個由455個氨基酸組成的蛋白質，序列為 SEQ IDN0. 16。實施例2分泌表達載體pHBSR的構建2. 1載體pHB-hc的獲得(圖1)為了構建可分泌外源蛋白產物的枯草桿菌表達載體，選取大腸桿菌/枯草桿菌穿梭載體PHB201為骨架，該載體是一個穩定的克隆載體，其骨架來源于枯草桿菌載體 PTA1060。多克隆位點位于融合基因cirt86::lacZa中，而由于其不適合表達，可將其啟動子 P59、cat86: :lacZa 區域切除(圖 1)。設計一對引物Pl (SEQ ID NO. 2)，P2(SEQ ID NO. 3)，使之可以配對形成雙鏈，兩端形成ClaI、B10I的粘性末端。反應體系如下在200 μ L PCR薄壁管中加入Pl 2 μL P2 2 μL
IOx退火 Buffer 6 μ ddH20 50 μL總體積 60 μL混勻后，置于水浴鍋94°C變性2分鐘，自然冷卻，使其退火，形成HindIILClaI的突出末端，如圖5。將pHB201先后用ClaKHindIII切斷，回收5. 4kb大片段。
5.4 kbpHB201 (Clal、HindIII)回收片段 3 μ PI、Ρ2退火雙鏈產物Ιμ
10 X Ligation Buffer1 μ
ddH204μL
Τ4 DNA LigaselμL
總體積ΙΟμ 16°C連接過夜，全部轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞。涂布于含氯霉素的LB平板， 37°C過夜培養。挑取單菌落到液體LB培養基，振蕩培養，提取質粒，酶切電泳，測序驗證。將此質粒命名為pHB-hc。2. 2載體pHP43的獲得(圖2)設計P43-F(SEQ ID NO. 4)，P43_R(SEQ ID NO. 5)為引物并且在下游引物引入多個酶切位點，構成多克隆位點(MSC)，以枯草芽孢桿菌168基因組為模板PCR擴增獲得P43啟
動子，反應體系如下
IOxPfu PCR buffer10μ1
10pMP43-F10μ1
10μΜΡ43-Κ10μ1
2.5mMdNTPs8μ1
枯草桿菌168基因組DNAIOng
ddH20up to 100μ1
Pfu DNA聚合酶5UPCR 程序為94°C 2min ；30 X (94°C 45s ；58°C 50s ；72°C 4min) ；72°C IOmin0將擴增獲得的PCR割膠回收后，連接入pMD19-T克隆載體，測序正確后命名為 PMD19-T-P43。Xhol/Clal雙酶切pMD19_T_P43獲得P43啟動子基因片段，與經過相同雙酶切pHB-hc載體用T4連接酶在16°C連接過夜，轉化大腸桿菌DH5ci感受態細胞，涂布于含氯霉素的平板，37°C培養過夜。挑單菌落振蕩培養，小量提取質粒，酶切電泳鑒定，命名為 PHP43，于_20°C條件下保存備用。2. 3載體pHP43R的獲得(圖3)設計引物P3 (SEQ ID NO. 6)、P4 (SEQ ID NO. 7)，以枯草桿菌168基因組為模板，利用PCR的方法擴增獲得枯草桿菌淀粉酶E啟動子基因PamyE，反應體系和條件與實施例2. 2 中PCR條件相同。設計引物P5 (SEQ ID NO. 8)、P6 (SEQ ID NO. 9)，以枯草桿菌168基因組為模板，利用PCR的方法擴增獲得枯草桿菌分子伴侶Sec分泌途徑分子伴侶ft~sA，反應體系和條件與實施例2. 2中PCR條件相同。以P3 (SEQ ID NO. 6)為上游引物，以P6 (SEQ ID N0. 9)為下游引物，以PCR反應產物PamyE和基因片段混合物為模板，利用PCR的方法擴增獲得啟動子PamyE介導的 PrsA表達的表達框PamyE-PrsA，反應體系和條件與實施例2. 2中PCR條件相同。將擴增獲得的PCR割膠回收后，連接入PMD19-T克隆載體，測序正確后命名為pMD 19-T-PamyE-PrsA,于_20°C條件下保存備用。PMD19-T-PamyE-PrsA用ClaI酶切，割膠回收后分別得到PamyE-PrsA基因片段。 PHP43載體用ClaI酶切后用去磷酸化酶處理，與PamyE-PrsA片段經T4連接酶連接獲得 PHP43R載體，于_20°C條件下保存備用。2. 4載體pHBSR的獲得(圖4)以 SnprB-F (SEQ ID NO. 10)/SnprB-R(SEQ ID NO. 11)為引物，以枯草桿菌 168基因組DNA為模板PCR擴增SnprB信號肽，反應體系和條件與實施例2. 2中PCR條件相同。PCR 產物連接入PMD19-T載體，測序正確后命名為pMD19-T-SnprB，于-20°C條件下保存備用。 pMD 19-T-SnprB通過EcoRI /BamHI雙酶切反應獲得SnprB信號肽基因，與同樣雙酶切處理的 PHP43R載體通過T4DNA酶連接獲得分泌表達載體pHBSR，并經過酶切電泳驗證，于_20°C條件下保存備用。實施例3魚腥藻(Anabaena sp. PCC 7120)脂肪氧合酶基因原核表達載體的構建根據獲得的脂肪氧合酶基因序列，設計兩個引物，上游引物加上^cI識別序列， 下游引物加上》ιοΙ識別序列上游引物5' -CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3‘ (SEQ ID N0. 14)下游引物5' -CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3' (SEQ ID N0. 15)按照下列PCR體系加入各成分，擴增LOX基因IOxPfu PCR bufferΙΟμΙΙΟμΜ上游引物10μ1ΙΟμΜ下游引物10μ12.5mMdNTPs8μ1魚腥藻基因組DNAIOngddH20up to 100μ1Pfu DNA聚合酶5UPCR 程序為 940C 2min ；30 X (94°C 45s ；58°C 50s ；72°C 4min) ；72°C IOmin0用上海生工PCR產物純化試劑盒純化PCR產物，加Mc I、Bio I雙酶切，滅活， 乙醇沉淀，ddH20重溶，與適量的用相同限制酶消化的載體pHBSR連接，轉化大腸桿菌 DH5 α。從轉化平板上隨機挑取幾個菌落，接入LB液體培養基，振蕩培養，小量提取質粒， 電泳，以電泳滯后的質粒為模板進行PCR驗證，確定連接成功后送到上海生工測序，得到 pHBSR-ana-LOX組成型重組表達載體。構建過程見圖6。實施例4 重組魚腥藻(Anabaena sp. PCC 7120)脂肪氧合酶表達載體轉化枯草桿菌 WB800將pHBSR-ana-LOX組成型重組表達載體電轉化入WB800感受態細胞，涂布于氯霉素/紅霉素的雙抗平板上進行篩選。將雙抗平板上長出的單菌落，接菌于氯霉素/紅霉素的LB培養基，37°C、180rpm條件下培養。離心收集上清液，以亞油酸為底測定LOX酶活。 pHBSR-ana-LOX重組工程菌的分泌表達量最高，酶活達到76U/mL。實施例5重組菌發酵產酶的關鍵因子確定前期單因素實驗主要考察了碳源(萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉和麩皮， 每種碳源的濃度分別為l、5、10、15、20g/L)，不同培養基pH(pH分別6、6· 5、7、7· 5、8)，不同裝液量O50ml三角瓶分別裝40ml、60ml、80ml、100ml、120ml培養基)和不同發酵溫度 (20°C、25°C、30°C、37°C )及發酵時間(24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h)對重組
菌(實施例4制備，下同)發酵產酶的影響。結果表明，不同碳源對影響重組菌發酵產酶存在很大的差異，其中乳糖對其產酶的促進作用最大，使酶產量(即酶活，下同)接近90U/mL， 而其他碳源促進作用不大。PH值影響結果顯示pH7. 5左右有利于重組菌發酵產酶，酸性和堿性條件下均不利于菌體的正常生長。裝液量在60ml時，單因素實驗結果最好，過低或過高的裝液量均不適合重組菌發酵產酶。該重組菌在溫度為30°C和發酵時間為時最適合其發酵產酶，酶活力達到114. 72U/ml。以LB培養基為基礎發酵培養基，采用Plackett-Burman設計法對影響重組菌發酵產酶的7個相關因素進行篩選，各因素及其代碼、編碼水平見表1，其中A D為培養基組分，E G為發酵條件，響應值為酶活力大小。試驗設計、數據分析和模型建立都采用JMP軟件(Version4. 0. 5, SAS Institute Inc.)。Plackett-Burman試驗結果及其預測值見表2，方差分析和各因素顯著性檢驗結果(見表幻表明，上述7個因子中對重組菌發酵產酶具有顯著影響的因子為乳糖(P = 0. 0007)、發酵溫度(P = 0. 0319)和發酵時間(P = 0. 0038)，其中乳糖(A)和發酵時間(G)為負效應(t值均為負)，說明二者在水平下限時更有利于重組菌產酶，這與前期單因素實驗中乳糖濃度在10g/L、發酵時間為產酶效果較好的實驗結果相似，在下一步中心組合設計時其中心點應適當下移。而發酵溫度(F)為正效應(t值為正)，也符合單因素篩選的實驗結果，中心點應適當上移。從Plackett-Burman試驗結果可以發現裝液量(E)并不是影響重組菌發酵產酶的顯著影響因子(P = 0. 6979)，這可能是由于此處Plackett-Burman 設計選擇的裝液量水平范圍過窄，并未能充分體現裝液量大小與酶產量的關系，在下一步的中心組合設計中仍將裝液量作為一個考察因子進行設計。
表1 Plackett-Burman設計試驗因素水平及編碼
權利要求
1.一種利用枯草桿菌生產重組脂肪氧合酶的方法，其特征在于包括如下步驟(1)構建含有魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-L0X的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌；(2)將所述的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌接種于裝液量為 58-63mL/250mL的加入15_18g/L乳糖的LB培養基中，27-30°C、180rpm條件下培養85_90h， 離心收集上清液。
2.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組脂肪氧合酶的方法，其特征在于步驟(1)構建含有魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌的方法為I.克隆魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX，其序列為SEQID NO. 1 ；II.魚腥藻PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX與分泌表達載體pHBSR連接得到 pHBSR-ana-LOX組成型重組表達載體；III.pHBSR-ana-LOX組成型重組表達載體電轉化枯草桿菌宿主WB800得到含有魚腥藻 PCC7120脂肪氧合酶基因ana-LOX的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌。
3.根據權利要求2所述的利用枯草桿菌生產重組脂肪氧合酶的方法，其特征在于所述的載體PHPSB通過如下方法構建i.構建載體pHB-hc 合成一對引物Pl =SEQ ID NO. 2/P2 =SEQ ID NO. 3，退火使之可以配對形成雙鏈，兩端形成ClaI、XhoI的粘性末端；將退火雙鏈產物與PHB201先后經ClaI、 HindIII酶切得到的5. 4kb大片段連接，得到載體pHB_hc ； 構建載體pHP43 以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，P43-F =SEQ ID NO. 4/P43-R SEQ IDN0. 5為引物，PCR擴增獲得P43啟動子，P43啟動子經Biol/Clal雙酶切后插入經同樣雙酶切的載體pHB-hc中，得到載體pHP43 ；iii.構建載體PHP43R:以枯草桿菌168基因組為模板，P3:SEQ ID NO. 6/P4 =SEQ ID NO. 7，為引物，PCR擴增獲得枯草桿菌淀粉酶E啟動子基因PamyE ；以枯草桿菌168基因組為模板，P5 =SEQ ID NO. 8/P6 =SEQ ID NO. 9，為引物，PCR擴增獲得枯草桿菌分子伴侶Sec分泌途徑分子伴侶I^rsA ；以P3為上游引物，以P6為下游引物，以PCR反應產物PamyE和I^rsA 基因片段混合物為模板，利用PCR的方法擴增獲得啟動子PamyE介導的表達的表達框 PamyE-PrsA ；載體pHP43用ClaI酶切后用去磷酸化酶處理，與經ClaI酶切的PamyE-PrsA 片段經T4連接酶連接獲得載體PHP43R ；iv.構建分泌表達載體pHBSR 以 SnprB-F :SEQ ID NO. 10/SnprB-R :SEQ ID NO. 11 為引物，以枯草桿菌168基因組DNA為模板PCR擴增SnprB信號肽，通過EcoRI/BamHI雙酶切反應獲得SnprB信號肽基因，與同樣雙酶切處理的pHP43R載體通過T4DNA酶連接獲得分泌表達載體pHBSR。
4.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組脂肪氧合酶的方法，其特征在于步驟(2)中裝液量為250ml的三角瓶裝60 62mL培養基，優選250ml的三角瓶裝61.31培養基。
5.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組脂肪氧合酶的方法，其特征在于步驟 (2)中加入的乳糖終濃度為16 17g/L，優選加入的乳糖終濃度為16. 9g/L。
6.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組脂肪氧合酶的方法，其特征在于步驟(2)中發酵溫度為28 30°C，優選發酵溫度為29. 71°C ·
7.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組脂肪氧合酶的方法，其特征在于步驟 (2)中發酵時間為87 89h，優選發酵時間為88. 49h。
全文摘要
本發明屬于食品工業生物技術領域，涉及一種利用枯草桿菌高效生產重組脂肪氧合酶的方法。該方法包括如下步驟(1)構建魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌；(2)將所述的魚腥藻脂肪氧合酶重組枯草桿菌基因工程菌接種于裝液量為58-63mL/250mL的加入15-18g/L乳糖的LB培養基中，27-30℃、180rpm條件下培養85-90h，離心收集上清液。在該最佳條件下，重組脂肪氧合酶活達到167.32U/mL，為其大規模的生產提供一定的指導。
文檔編號C12N9/02GK102559622SQ201210027230
公開日2012年7月11日 申請日期2012年2月8日 優先權日2012年2月8日
發明者別小妹, 呂鳳霞, 張充, 王昱灃, 章棟梁, 趙海珍, 陸兆新 申請人:南京農業大學