專利名稱：利用鳥苷發酵廢液生產高蛋白飼料的方法
技術領域：
本發明屬于環境工程和生物工程領域，具體來說是一種利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法。
背景技術：
鳥苷又名鳥嘌呤核苷或9-(0-D-呋喃核糖基)鳥嘌呤。鳥苷的用途十分廣泛，可用于合成食品增鮮劑一 5'-鳥苷酸二鈉、呈味核苷酸二鈉以及作為醫藥產品的重要中間體， 可形成一系列的下游醫藥產品，包括核苷類抗病毒藥物如利巴韋林、阿昔洛韋等，也是用于制造無環鳥苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鳥苷鈉(GTP)等藥物的主要原料。目前，國內市場鳥苷需求量大約在3 500噸/年，且以每年10%的速度增長。鳥苷生產采用發酵法，該法會產生大量發酵廢水。鳥苷發酵廢水中殘糖量約為3%， 總氮含量約為0. 6%，氨氮含量約為0. 5%，無機鹽含量約為4. 0%-5. 0%，廢液pH7. 0，是一種高 B0D、高氨氮營養豐富的有機廢水，直接排放會造成水體生物因缺氧而大量死亡，處理后達標排放不僅增加生產成本，而且廢水中的營養成分不能充分利用，造成資源浪費。
發明內容
本發明的目的就是解決鳥苷發酵廢液直接排放對環境的污染問題，另一目的就是提供一種利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法，其特征在于包括有以下步驟
1)在IL鳥苷發酵廢水中補加鹿糖0. 5 g-2. 0 g,蛋白胨0.1 g -0. 5 g，酵母膏0.5 g -1.0 g，得到生產蛋白飼料的發酵培養基；
2)菌種活化，分別挑取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌接種于相應的斜面培養基上，于30°C -37°C，培養10 hr-20 hr,分別得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的斜面種子；
3)搖瓶種子培養，將步驟2)得到的活化好的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的斜面種子分別接種至三角搖瓶中進行培養，得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的搖瓶種子；
4)發酵種子培養，將步驟3)中培養的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的搖瓶種子按體積百分比5%-10%的接種量分別接種于種子罐中，于30°C -37°C，培養20 hr-40 hr，得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的種子液；
5)混合發酵培養，將步驟4)中培養的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的種子液， 采用步驟I)所述的發酵培養基，按5%-10%的總接種量接種于發酵罐中，于34°C _36°C，通風比為0. 13-0. 15，培養40 hr-48 hr，得到混合培養液；
6)噴霧干燥，將步驟5)的混合培養液進行噴霧干燥、粉碎，即得蛋白飼料。按上述方案，步驟2)所用的用于菌種活化的斜面培養基為枯草芽孢桿菌的斜面培養基組成為葡萄糖0. 5 g,蛋白胨0.6 g，酵母膏0.7 g,氯化鈉0.5 g,瓊脂2.0 g,去離子水100 mL ;地衣芽孢桿菌的斜面培養基組成為葡萄糖0.5 g，蛋白胨0.7 g，酵母膏0.8 g，氯化鈉0.5 g,瓊脂2.0 g,去離子水100 mL ;酵母菌的斜面培養基組成為鹿糖2.0 g,酵母膏0. 8 g，氯化鈉0. 5 g，瓊脂2. 0 g，去離子水100 mL。按上述方案，步驟3)中搖瓶種子培養條件為，枯草芽孢桿菌采用如下培養基在 100 mL鳥苷發酵廢水中補加酵母膏1.0 g-3.0 g，培養基pH7. 0，于35°c-37°c，200 rpm振搖培養20 hr-24 hr ;地衣芽孢桿菌采用如下培養基在100 mL鳥苷發酵廢水中補加蛋白胨 0.5 g-1.5 g、酵母膏 1.0 g-2. 0 g，培養基 pH7.0，于 35°C-37°C，180 rpm 振搖培養 26 hr-30 hr ;酵母菌采用如下培養基在100 mL鳥苷發酵廢水中補加酵母膏0. 5 g-1. 0 g、鹿糖 0.5 g-2. 0 g，于 28°C-32°C，150 rpm 振搖培養 40 hr-48 hr。按上述方案，步驟4)中發酵種子培養條件為枯草芽孢桿菌采用如下培養基 在I L鳥苷發酵廢水中補加酵母膏5 g-30 g，調pH7.0，接種量為體積百分比5%-7%，于 35°C-37°C，通風比為0. 13-0. 15，培養20 hr-24 hr，取樣，稀釋10倍，于650 nm測菌體密度，使之達I. 46-1. 52 ;地衣芽孢桿菌采用如下培養基在I L鳥苷發酵廢水中補加蛋白胨
5.0 g-15.0 g、酵母膏 10. 0 g -20. 0 g，調pH7.0。接種量為 7%-10%，于 35°C-37°C，通風比為
0.13-0. 15，培養26 hr-30 hr,取樣，稀釋10倍，于650 nm測菌體密度，使之達I. 48-1. 52 ； 酵母菌采用如下培養基在I L鳥苷發酵廢水中補加酵母膏5. 0 g-10. 0 g、鹿糖5.0 g-20. 0 g，接種量為7%-10%，于28°C-32°C，通風比為0. 10-0. 12，培養40 hr -48 hr，取樣，稀釋10 倍，于650 nm測菌體密度，使之達I. 44-1. 53。按上述方案，步驟5)中混合發酵的接種量為按枯草芽孢桿菌接種量I. 0%-3. 0%、 地衣芽孢桿菌接種量2. 0%-4. 0%、酵母菌接種量2. 0%-3. 0%。按上述方案，所述的蛋白飼料為淡黃色粉末，菌群總數6. 83X IO8-L 47X IO9 CFU / g，粗蛋白含量為48%-51%。富含礦質和維生素，是一種優質的禽畜蛋白飼料。本發明利用鳥苷廢水為原料，發酵生產蛋白飼料，其中菌群總數為
6.83 X IO8-L 47 X IO9 CFU / g，粗蛋白含量為48%_51%，富含礦質和維生素，是一優質的蛋白禽畜飼料。本發明不僅解決了鳥苷發酵產生的廢水排放對環境的污染，而且降低了蛋白飼料的生產成本，做到資源的最大化利用。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步詳細的說明，但是不會構成對本發明的限制
實施例I一種以鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料法方法如下
步驟一，菌種活化，挑取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌接種于相應的斜面培養基上，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌于37°C分別培養10 hr和16 hr ;酵母菌于30°C，培養 20 hr o枯草芽孢桿菌的斜面培養基組成為葡萄糖0. 5 g，蛋白胨0. 6 g，酵母膏0. 7 g，氯化鈉0. 5 g，瓊脂2. 0 g，去離子水100 mL ;地衣芽孢桿菌的斜面培養基組成為葡萄糖0. 5 g，蛋白胨0.7 g，酵母膏0.8 g,氯化鈉0.5 g,瓊脂2.0 g,去離子水100 mL ;酵母菌的斜面培養基組成為蔗糖2.0 g，酵母膏0.8 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂2.0 g，去離子水100 mL。
步驟二，搖瓶種子培養，將步驟一中活化好的枯草芽孢桿菌接種于已滅菌含酵母膏2. 0 g、鳥苷發酵廢水100 mL, pH 7. 0的搖瓶中，于37°C，200 rpm振搖培養20 hr ;將步驟二中活化好的地衣芽孢桿菌接種于已滅菌含蛋白胨1.0 g、酵母膏I. 5 g、鳥苷發酵廢水 100 mL、pH7. 0的搖瓶中，于35°C，180 rpm振搖培養24 hr ;將步驟二中活化好的酵母菌接種于已滅菌含鹿糖1.0 g，酵母膏0.7 g，鳥苷發酵廢水100 mL的搖瓶中，于30°C, 150 rpm 振搖培養48 hr o步驟三，發酵種子培養。將步驟二中搖瓶培養的菌液分別接種于種子罐中進行種子培養。枯草芽孢桿菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加體積質量比為
2.0%的酵母膏，調pH7. 0，121°C滅菌30 min，冷卻。以5%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，37°C，通風比0. 13，培養20 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為1.46。然后壓入500 L的種子罐中，于37°C，通風比0. 12，培養20 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為I. 48。地衣芽孢桿菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加體積質量比為 1.0%的蛋白胨、I. 5%的酵母膏，調pH7. O。121°C滅菌30 min，冷卻。以7%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，35°C，通風比0. 14，培養26 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為1.49。然后壓入500 L的種子罐中，于35°C，通風比0. 14，培養 26 hr,使稀釋10倍的菌體密度在650 nm處達I. 48。酵母菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加補加體積質量比為I. 0% 的蔗糖、0. 7%的酵母膏，pH自然。121°C滅菌30 min，冷卻。以10%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，30°C，通風比0. 10，培養48 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為1.53。然后壓入500 L的種子罐中，30°C，通風比0. 10，培養48 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為I. 54。步驟四，混合發酵培養。取蔗糖18 kg，蛋白胨12 kg，酵母膏18 kg，鳥苷發酵廢水 36 m3，混合溶解后加入50 m3的發酵罐中，121 °C滅菌30 min。冷卻，接種枯草芽孢桿菌I. 2 m3、地衣芽孢桿菌I. 4 m3、酵母菌I. 4 m3 (總接種量10%)，36°C，通風比為0. 13，培養40 hr,放罐。步驟五，噴霧干燥。將步驟四中混合發酵液進行噴霧干燥、粉碎，得菌體蛋白(為淡黃色粉末)，其中菌群總數為為I. 07X IO9CFU / g，粗蛋白含量為50.6%。實施例2 —種以鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料法方法如下
步驟一，同實施例I進行菌種活化。步驟二，搖瓶種子培養，將步驟一中活化好的枯草芽孢桿菌接種于已滅菌含酵母膏I. 0 g、鳥苷發酵廢水100 mL, pH7. 0的搖瓶中，于35°C，200 rpm振搖培養24 hr ;將步驟二中活化好的地衣芽孢桿菌接種于已滅菌含蛋白胨0.5 g、酵母膏2.0 g、鳥苷發酵廢水 100 mL、pH7. 0的搖瓶中，于36°C，180 rpm振搖培養30 hr ;將步驟二中活化好的酵母菌接種于已滅菌含鹿糖0.5 g，酵母膏1.0 g，鳥苷發酵廢水100 mL的搖瓶中，于28°C, 150 rpm 振搖培養44 hr o步驟三，發酵種子培養。將步驟二中搖瓶培養的菌液分別接種于種子罐中進行種子培養。
枯草芽孢桿菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加體積質量比為 1.0%的酵母膏，調pH7. 0，121°C滅菌30 min，冷卻。以6%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，35°C，通風比0. 15，培養24 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為I. 51。然后壓入500 L的種子罐中，于35°C，通風比0. 15，培養24 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為I. 49。地衣芽孢桿菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加體積質量比為
0.5%的蛋白胨、2. 0%的酵母膏，調pH7. O。121°C滅菌30 min，冷卻。以9%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，36°C，通風比0. 13，培養30 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為1.48。然后壓入500 L的種子罐中，于36°C，通風比0. 13，培養 30 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為I. 49。酵母菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加體積質量比為0. 5%的蔗糖、1.0%的酵母膏，pH自然。121°C滅菌30 min，冷卻。以7%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，28°C，通風比0. 12，培養44 hr，稀釋10倍的菌體密度在 650 nm處為1.44。然后壓入500 L的種子罐中，28°C，通風比0. 12，培養44 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為I. 46。步驟四，混合發酵培養。取蔗糖40 kg，蛋白胨18 kg，酵母膏24 kg，鳥苷發酵廢水 36 m3，混合溶解后加入50 m3的發酵罐中，121 °C滅菌30 min。冷卻，接種枯草芽孢桿菌0. 8 m3、地衣芽孢桿菌I. I m3、酵母菌0.9 m3 (總接種量7%)，34°C，通風比為0. 14，培養45 hr,放罐。步驟五，噴霧干燥。將步驟四中混合發酵液進行噴霧干燥、粉碎，得菌體蛋白(為淡黃色粉末)，其中菌群總數9. 26 X IO8CFU / g，粗蛋白含量為51.0%。實施例3 —種以鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料法方法如下
步驟一，同實施例I進行菌種活化。步驟二，搖瓶種子培養，將步驟二中活化好的枯草芽孢桿菌接種于已滅菌含酵母膏3.0 g、鳥苷發酵廢水100 mL，pH7. 0的搖瓶中，于36°C，200 rpm振搖培養22 hr ;將步驟一中活化好的地衣芽孢桿菌接種于已滅菌含蛋白胨I. 5 g、酵母膏0.5 g、鳥苷發酵廢水 100 mL、pH7. 0的搖瓶中，于37°C，180 rpm振搖培養28 hr ;將步驟二中活化好的酵母菌接種于已滅菌含鹿糖2.0 g，酵母膏0.5 g，鳥苷發酵廢水100 mL的搖瓶中，于32°C, 150 rpm 振搖培養40 hr o步驟三，發酵種子培養。將步驟二中搖瓶培養的菌液分別接種于種子罐中進行種子培養。枯草芽孢桿菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加體積質量比為
3.0%的酵母膏，調pH7. 0，121°C滅菌30 min，冷卻。以7%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，36°C，通風比0. 14，培養22 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為1.49。然后壓入500 L的種子罐中，于36°C，通風比0. 14，培養22 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為1.52。地衣芽孢桿菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加體積質量比為
1.5%的蛋白胨、0.5%的酵母膏，調pH7. O。121°C滅菌30 min，冷卻。以10%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，37°C通風比0. 15，培養28 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 11111處為1.52。然后壓入500 L的種子罐中，于37°C，通風比0. 15，培養28 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為1.51。酵母菌種子液培養。培養基制備在鳥苷發酵廢水中補加體積質量比為2. 0%的蔗糖、0.5%的酵母膏，pH自然。121°C滅菌30 min，冷卻。以9%接種量，將步驟二中培養的搖瓶種子，接種于10 L的種子罐中，32°C，150 rpm，通風比0. 11，培養40 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為1.45。然后壓入500 L的種子罐中，32°C，150 rpm，通風比0. 11，培養40 hr，稀釋10倍的菌體密度在650 nm處為I. 46。步驟四，混合發酵培養。取蔗糖72 1^，蛋白胨3.6 kg，酵母膏36 kg，鳥苷發酵廢水36 m3，混合溶解后加入50 m3的發酵罐中，121 °C滅菌30 min。冷卻，接種枯草芽孢桿菌 0.5 m3、地衣芽孢桿菌0.8 m3、酵母菌0.7 m3 (總接種量5%)，35°C，通風比為0. 15，培養48 hr，放罐。步驟五，噴霧干燥。將步驟四中混合發酵液進行噴霧干燥、粉碎，得菌體蛋白(為淡黃色粉末)，其中菌群總數6. 97 X IO8CFU / g，粗蛋白含量為48.6%。
權利要求
1.利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法，其特征在于包括有以下步驟1)在IL鳥苷發酵廢水中補加鹿糖O. 5 g-2. O g,蛋白胨O. I g -O. 5 g，酵母膏O. 5 g -I. O g，得到生產蛋白飼料的發酵培養基；2)菌種活化，分別挑取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌接種于相應的斜面培養基上，于30°C -37°C，培養10 hr-20 hr,分別得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的斜面種子；3)搖瓶種子培養，將步驟2)得到的活化好的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的斜面種子分別接種至三角搖瓶中進行培養，得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的搖瓶種子；4)發酵種子培養，將步驟3)中培養的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的搖瓶種子按體積百分比5%-10%的接種量分別接種于種子罐中，于30°C -37°C，培養20 hr-40 hr，得到枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的種子液；5)混合發酵培養，將步驟4)中培養的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌的種子液， 采用步驟I)所述的發酵培養基，按5%-10%的總接種量接種于發酵罐中，于34°C _36°C，通風比為O. 13-0. 15，培養40 hr-48 hr，得到混合培養液；6)噴霧干燥，將步驟5)的混合培養液進行噴霧干燥、粉碎，即得蛋白飼料。
2.根據權利I所述的利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法，其特征在于步驟2)所用的用于菌種活化的斜面培養基為枯草芽孢桿菌的斜面培養基組成為葡萄糖O. 5 g，蛋白胨O. 6 g，酵母膏O. 7 g,氯化鈉O. 5 g,瓊脂2. O g,去離子水100 mL ;地衣芽孢桿菌的斜面培養基組成為葡萄糖O. 5 g，蛋白胨O. 7 g，酵母膏O. 8 g，氯化鈉O. 5 8，瓊脂2.0 g，去離子水100 mL ;酵母菌的斜面培養基組成為蔗糖2.0 g，酵母膏0.8 g，氯化鈉0.5 g，瓊脂2.O g，去離子水100 mL。
3.根據權利I所述的利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法，其特征在于步驟3)中搖瓶種子培養條件為，枯草芽孢桿菌米用如下培養基在100 mL鳥苷發酵廢水中補加酵母膏I. O g-3. O g，培養基ρΗ7·0，于35°C_37°C，200 rpm振搖培養20 hr-24 hr ;地衣芽孢桿菌采用如下培養基在100 mL鳥苷發酵廢水中補加蛋白胨O. 5 g-1.5 g、酵母膏I. O g-2. O g，培養基pH7. 0，于35°C-37°C，180 rpm振搖培養26 hr-30 hr ;酵母菌采用如下培養基 在100 mL鳥苷發酵廢水中補加酵母膏O. 5 g-1.0 g、蔗糖O. 5 g-2. O g，于28°C _32°C，150 rpm 振搖培養 40 hr-48 hr。
4.根據權利I所述的利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法中，其特征在于步驟4)中發酵種子培養條件為枯草芽孢桿菌采用如下培養基在I L鳥苷發酵廢水中補加酵母膏5 g-30 g，調pH7. 0，接種量為體積百分比5%-7%，于35°C-37°C，通風比為O. 13-0. 15，培養20 hr-24 hr,取樣，稀釋10倍，于650 nm測菌體密度，使之達I. 46-1. 52 ;地衣芽孢桿菌采用如下培養基在I L鳥苷發酵廢水中補加蛋白胨5. O g-15. O g、酵母膏10. O g -20.0 g，調 ρΗ7· 0，接種量為 7%-10%，于 35°C _37°C，通風比為 O. 13-0. 15，培養 26 hr-30 hr，取樣，稀釋10倍，于650 nm測菌體密度，使之達I. 48-1. 52 ;酵母菌采用如下培養基在I L鳥苷發酵廢水中補加酵母膏5. O g-10. O 8、蔗糖5.0 g-20. O g，接種量為7%_10%，于28°C _32°C， 通風比為O. 10-0. 12，培養40 hr -48 hr，取樣，稀釋10倍，于650 nm測菌體密度，使之達 I. 44-1. 53。
5.根據權利I所述的利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法中，其特征在于步驟5)中混合發酵的接種量為按枯草芽孢桿菌接種量I. 0%-3. 0%、地衣芽孢桿菌接種量2.0%-4. 0%、酵母菌接種量2. 0%-3. 0%進行接種。
6.根據權利I所述的利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法中，其特征在于所述的蛋白飼料為淡黃色粉末，菌群總數6. 83 X IO8-L 47 X IO9 CFU / g，粗蛋白含量為48%_51%。
全文摘要
本發明屬于環境工程和生物工程領域，具體來說是一種利用鳥苷發酵廢水生產蛋白飼料的方法，包括以下幾個步驟第一，菌種活化；第二，搖瓶種子培養；第三，生產種子培養；第四，以鳥苷發酵廢水為原料，接種枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、酵母菌，進行混合發酵；第五，噴霧干燥、粉碎，得蛋白飼料。該蛋白飼料含菌群總數為6.83×108-1.47×109CFU／g，粗蛋白含量為49%-51%，富含礦質和維生素，是一優質的蛋白禽畜飼料。
文檔編號C12P21/00GK102578389SQ20121003318
公開日2012年7月18日 申請日期2012年2月15日 優先權日2012年2月15日
發明者戶業麗, 程波 申請人:武漢工程大學