專利名稱：一種神經干細胞培養瓶的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞生物學領域，具體涉及一種用于神經干細胞培養的容器。
背景技術：
神經干細胞(Neural Stem Cell，NSC)是存在于胚胎或成體腦、脊髓等組織中的一種干細胞，是一類具有分裂潛能和自我更新能力的母細胞，可通過不對等的分裂方式分化成神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞等神經組織的各類細胞，也可轉分化成血細胞和骨骼肌細胞。目前的科學技術已經可以在體外培養擴增神經干細胞，用于生命科學研究、藥物篩選測試、臨床應用研究等領域。神經干細胞在體外培養過程中大多呈懸浮狀態不貼壁，并有形成神經球 (Neurosphere)的特性。神經球是神經干細胞聚集起來形成的球狀物，根據生長進程的不同直徑在幾十微米至幾百微米不等。神經球的細胞組成與許多因素有關，主要包括供體動物的年齡、細胞接種的密度、培養技術條件、細胞傳代數等。神經球的形成有利于增強細胞之間的相互作用， 從而加快神經干細胞的增殖速度。目前市售的細胞培養瓶大多為聚苯乙烯材質(Polystyrene，PS)，雖然吸附較低， 但是對神經干細胞仍有一定的吸附性，培養神經干細胞需要購買經過專門處理的超低吸附表面的細胞培養瓶(一般是高分子水凝膠表面)。
發明內容
本發明的目的在于提供一種新的細胞培養瓶，具有由蛋白質構成的超低吸附表面附著層，不僅能阻止神經干細胞貼壁，還能為神經干細胞的生長提供營養物質。本發明的技術方案如下一種神經干細胞培養瓶，由高分子聚合物構成的瓶身( 和瓶蓋(1)組成，在所述瓶身內壁的細胞接觸面上還附有一層透明的白蛋白包被層(3)，白蛋白包被層以物理吸附或共價交聯的方式附著在容器內壁上。上述神經干細胞培養瓶在用于培養人類神經干細胞時，所述的白蛋白包被層優選使用人血白蛋白包被。上述神經干細胞培養瓶的瓶蓋和瓶身的基本材質可使用任何具有一定機械強度并對細胞無毒害的高分子材質，其中瓶身還需具有良好的透明度以便于觀察培養中的神經干細胞，優選使用聚苯乙烯材質。白蛋白(又稱清蛋白，Albumin)屬于球蛋白，是血漿中含量最多的蛋白質，具有維持血漿膠體滲透壓、血漿物質載運、保護血細胞、提供營養、結合重金屬離子和毒素等功能， 在生物學實驗中常添加于細胞培養液中。此外因其能夠與免疫反應板上的蛋白結合位點結合，也常在免疫實驗中用作封閉液，以阻止后續操作步驟中的抗原或抗體與反應板結合。人血白蛋白(Human Albumin)是人體產生的白蛋白，可從健康人的血液中提取，能CN 102533550 A夠直接靜脈注射到病人體內，主要用于失血創傷、燒傷引起的休克，腦水腫及損傷引起的顱壓升高，肝硬化及腎病引起的水腫或腹水，癌癥術后恢復等方面的治療，是一種臨床藥品， 國內多家生物醫藥企業有生產銷售。本發明中的白蛋白包被層可以通過物理吸附或化學交聯等多種方式附著在神經干細胞培養瓶的內壁上。本發明的有益效果是，通過在神經干細胞培養瓶內壁表面添加一層白蛋白包被層減少了神經干細胞在培養瓶內壁的吸附，有利于神經球的形成，并能為神經干細胞的生長提供營養物質，從而加快神經干細胞的生長增殖速度，同時成本又低于進口的超低吸附細胞培養瓶。
圖1 本發明一個實施例的縱切面。圖2 本發明另一個實施例的縱切面。圖3 本發明與進口超低吸附細胞培養瓶使用效果對比試驗的結果。
具體實施例方式本發明可以通過以下手段制造或實現(1)使用模具和高分子聚合物材料如聚苯乙烯制作瓶身和瓶蓋成所需形狀；(2)將用DPBS配制的白蛋白溶液灌入瓶內，在37°C 的溫箱中過夜使白蛋白充分附著在內壁上以形成包被層；C3)用超純水洗滌、晾干。本發明的一種使用方法如下(1)將神經干細胞懸液以1X10~5細胞/ml的密度接種到神經干細胞培養瓶，培養液成分為含有B27添加液、N2添加液以及EGF、bFGF、LIF 等生長因子的DMEM/F12細胞培養液(培養液各組分均可購自美國hvitrogen公司)；O) 放入CO2細胞培養箱中37°C培養；(3)監測神經球的生長情況，長到一定體積后將神經球挑出，酶消化、傳代。實施例一種神經干細胞培養瓶(圖1)，由聚苯乙烯構成的瓶身( 和瓶蓋(1)組成，在所述瓶身內壁的細胞接觸面上附有一層透明的人血白蛋白包被層(3)，人血白蛋白包被層以物理吸附的方式附著在容器內壁上。本實施例的制造方法如下(1)使用模具和高分子聚合物材料聚苯乙烯制作瓶身和瓶蓋成如圖1所示的形狀；(2)將用DPBS配制的人血白蛋白溶液灌入瓶內，在37°C 的溫箱中過夜使人血白蛋白充分附著在內壁上以形成包被層，然后用超純水洗滌、晾干。比較例本發明和一般的海外進口超低吸附培養容器同條件培養的神經干細胞培養后的增值倍數比較按照前述的使用方法，在神經干細胞P3至P7代有明顯增殖情況的代次中，應用本發明培養的神經干細胞增值率明顯高于一般的海外進口經特殊處理的低吸附培養容器 (數據結果見圖幻，并且經檢測每代細胞都保持了細胞干性(檢測方法免疫細胞化學方法檢測神經干細胞標志物巢蛋白nestin的表達)，說明本發明可促進神經干細胞所需營養底物能量的供給，提高增值率，其制作成本也明顯低于一般的海外進口經特殊處理的低吸附培養容器。
權利要求
1.一種神經干細胞培養瓶，由高分子聚合物構成的瓶身( 和瓶蓋(1)組成，其特征在于在所述瓶身內壁的細胞接觸面上還附有一層透明的白蛋白包被層(3)，白蛋白包被層以物理吸附或共價交聯的方式附著在容器內壁上。
2.權利要求1所述的一種神經干細胞培養容器，其特征在于，所述的白蛋白包被層(3) 為人血白蛋白包被層。
全文摘要
本發明公開了一種神經干細胞培養瓶，涉及細胞生物學領域。本發明在神經干細胞培養瓶的內壁添加了一層白蛋白包被層，特別是使用人血白蛋白包被，能夠大大減少神經干細胞在內壁的殘留，降低儲存過程中的損耗，延長神經干細胞在4℃儲存時間，提高神經干細胞儲存效果。
文檔編號C12M3/00GK102533550SQ201210034620
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月16日 優先權日2012年2月16日
發明者楊立敏, 鄭佳威, 金宜強, 黃倩瑩 申請人:上海安集協康生物技術有限公司