專利名稱：一種植物乳桿菌ccfm8724及其用途的制作方法
一種植物乳桿菌CCFM8724及其用途
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域。更具體地，本發明涉及一種植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)CCFM8724，還涉及所述植物乳桿菌 CCFM8724 的用途。
背景技術：
空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)是彎曲桿菌屬成員之一，屬革蘭氏陰性菌，是全球范圍內感染性腹瀉常見的病原菌，世界衛生組織(WHO)在1980年將空腸彎曲桿菌病列為常見的食源性疾病。C. jejuni是一種人獸共同感染的病原菌，廣泛存在于環境中， C. jejuni能定植在各種野生禽類和家禽、家畜的腸道內，如雞、鴨、鵝等家禽，貓、狗等寵物， 牛、豬等家畜，鴿子、麻雀等鳥類以及野生動物等為常見的動物宿主。人類通過與這些動物的接觸而可能受到感染，此外，生的、欠火候的或受污染的雞肉、牛肉，未徹底殺菌的牛奶以及污染的水都可以引起人類感染空腸彎曲桿菌。20世紀90年代以來，C. jejuni感染率呈逐年上升的趨勢。在歐美等發達國家， C. jejuni是造成腹瀉的主要病原體，有時甚至超過沙門氏菌和志賀氏菌而居首位。最近數十年，在發達國家中空腸彎曲桿菌病的發病數逐年增長，僅在美國每年的發病例數就高達 250萬人次，我國和其它發展中國家的患者多集中在兒童。急性自限性胃腸炎是C. jejuni 感染的典型癥狀，免疫力極低下者還會進一步導致心內膜炎、關節炎、骨髓炎、腦炎、敗血癥等全身性疾病，最嚴重的并發癥是某些血清型C. jejuni感染引起的周圍神經自身免疫性疾病-格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome, GBS)。C. jejuni的致病機理是復雜的，主要是通過粘附、定植、侵入、產毒素等機制感染機體而導致疾病。鞭毛、外膜蛋白、脂多糖或脂寡糖、莢膜多糖等在C. jejuni附著和定植于宿主腸道上皮細胞的過程中起重要作用。所有C. jejuni都能產生細胞致死性膨脹毒素 (Cytolethal distending toxin，CDT)，CDT有多方面致病性，能直接破壞宿主細胞DNA ；能通過阻止細胞分裂關鍵調節因子CDC2蛋白的去磷酸化等作用，使宿主細胞周期不可逆地阻斷在G2期而不再進入M期，細胞不能增殖分化，致宿主腸道細胞失去調節形態和容量的能力，使細胞進行性擴張，最終破裂死亡；能激發宿主產生細胞因子IL-8，導致局部炎癥的發生。C. jejuni的廣泛分布、較高發病率以及相關疾病的危害已經引起了人們的廣泛關注。近年來抗菌藥物的使用已經使細菌耐藥性日趨嚴重，反而推動了這類食源性病原菌的流行。加強對C. jejuni的預防是控制彎曲桿菌病的重要手段之一，而且在公共衛生、食品安全、畜牧獸醫中都有重要的意義。益生菌被定義為活的微生物，適量攝入益生菌對人體具有有益的功效，通過益生菌來預防和治療腸道細菌性感染已經成為相關領域研究的一個重要課題。乳酸菌具有抑制各種革蘭氏陽性和陰性病原菌的功能，其抑制機制可能是由于產生有機酸，如乳酸和乙酸、 過氧化氫、細菌素及類似細菌素的物質，還包括競爭排斥作用、促進腸道微生態平衡以及增強宿主的防御能力。此外，某些益生菌能在胃腸道環境中存活并定植于腸道，這些微生物治療可以作為治療腸道菌群失調的一種方法。目前國內外對乳酸菌干預病原菌感染進行了很多研究。CN1796540公開了一種具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌；CN1982437公開了一種抗腸道致病菌和抗氧化能力的鼠李糖乳桿菌，用于制備抑制幽門螺桿菌、大腸桿菌或其他致病菌的食品或藥品。但鮮有針對空腸彎曲桿菌的乳酸菌和益生菌的報道。目前針對空腸彎曲桿菌的專利中多集中于空腸彎曲桿菌的培養、檢測等方面，例如CN1011825688公開一種空腸彎曲桿菌的檢測方法；CN1013922^涉及空腸彎曲桿菌的微需氧分離培養方法。因此，篩選出一種具有抑制空腸彎曲桿菌功能的乳酸菌，并且證明在體外具有良好的抗空腸彎曲桿菌的效果，同時研制這些乳酸菌的實際用途就顯得十分必要。為此，本發明人在總結現有技術的基礎上，經過大量實驗研究，終于完成了本發明。
發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種植物乳桿菌(LactcAacillus plantarum) CCFM8724。本發明的另一個目的是提供所述植物乳桿菌CCFM8724的用途。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8724，該菌株已于 2011年11月四日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. M92。所述的植物乳桿菌CCFM87M具有下述性質(1)體外抑制空腸彎曲桿菌生長；(2)具有耐酸性，在pH2. 0時存活良好；(3)具有耐膽鹽能力，能耐受的膽鹽水平達0. 3% ；(4)對腸道上皮細胞具有較好的粘附能力；(5)體外抑制空腸彎曲桿菌粘附腸道上皮細胞；(6)抑制空腸彎曲桿菌在雞肉中的生長。本發明涉及所述的植物乳桿菌CCFM87M在制備抑制空腸彎曲桿菌的藥物組合物或發酵食品中的用途。根據本發明的一種優選實施方式，所述的藥物組合物是由植物乳桿菌CCFM8724 菌劑與在藥學上可接受的載體組成的。根據本發明的另一種優選實施方式，所述的植物乳桿菌CCFM87M菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM8724的菌液通過常規冷凍干燥工藝或其它類似工藝制備所得到的粉齊U，它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM8724。根據本發明的另一種優選實施方式，所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、片劑、 丸劑或口服液劑型。根據本發明的另一種優選實施方式，所述的發酵食品是使用含有植物乳桿菌 CCFM8724的發酵劑生產的乳制品、豆制品與果蔬制品。
根據本發明的另一種優選實施方式，所述的發酵劑是采用下述方法制備得到的制備具有下述組成的培養基以該培養基總重量計10%酶水解脫脂乳、0. 5%葡萄糖、1. 5%胰蛋白胨、0. 3%酵母浸膏和余量水，所制備培養基的pH是6. 8。制備具有下述組成的保護劑100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、 150g/L海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉和余量水。植物乳桿菌CCFM87M菌種按照以所述培養基的重量計2_4%接種量接種到在溫度110-120°C下滅菌8-12min的所述的培養基中，然后在溫度37°C下培養18h，用pH 7. 2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述的保護劑重懸使植物乳桿菌CCFM87M濃度達到109CFU/ml ； 接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預培養60min，再采用冷凍干燥方法制成所述的發酵劑。根據本發明的另一種優選實施方式，所述的發酵劑含有109CFU/g以上活性植物乳桿菌 CCFM87M。根據本發明的另一種優選實施方式，所述的發酵乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪； 所述的發酵豆制品是酸豆乳、豆豉、豆醬或醬油；所述的發酵果蔬制品是發酵的黃瓜、胡蘿
卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。下面將更詳細地描述本發明。本發明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8724，該菌株已于 2011年11月四日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. M92。下面將詳細地描述所述植物乳桿菌CCFM8724的篩選方法與它具有的性質。首先，從傳統發酵食品中篩選乳酸菌。原始樣品取自于內蒙、新疆等地牧民自制的發酵奶酒。將5ml發酵奶酒注入帶玻璃珠的45ml滅菌生理鹽水中，振蕩30min，然后用滅菌生理鹽水將其奶酒稀釋至不同的濃度。采用本技術領域的技術人員熟知的涂布平板法，將這些稀釋菌液涂布在添加了酸堿指示劑溴甲酚紫的MRS培養基(青島海博生物技術有限公司產品)平板上，分別在溫度37°C 下進行普通培養和厭氧培養48h，觀察菌落生長情況，挑取能使培養基中溴甲酚紫變黃的典型單菌落，并對單菌落進行革蘭氏染色，挑取革蘭氏陽性菌作為初步目的菌株，然后轉接至 MRS平板劃線分離純化，直至得到純乳酸菌株，作為實驗菌株并在溫度4°C下保存。用接種環在平板上刮一環新鮮培養的菌苔，均勻涂抹在載玻片上，往其上滴加一滴3% H2O2溶液， 觀察是否有氣泡產生。若無氣泡產生則表明該菌株不產過氧化氫酶，為接觸酶陰性菌。然后，采用牛津杯法篩選具有抑制空腸彎曲桿菌生長功能的乳酸菌。將上述步驟獲得的純乳酸菌按照以MRS液體培養基體積計2%接種于MRS液體培養基中，于溫度37°C下培養18-20h，按照同樣的方式連續培養三代，然后將乳酸菌菌懸液在8000r/min與溫度4°C的條件下離心20min，吸取上清液，使用0. 22 μ m濾膜進行過濾去除菌體，得到一種乳酸菌發酵上清液。空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)NCTCl 1168菌株(購自美國典型培養物保藏中心ATCC)在哥倫比亞血瓊脂平板(Oxoid公司培養基)上在溫度37°C與以體積計5% 02、10%0)2和85(%隊的環境下培養4811，按照同樣的方式傳代培養三代后，往其平板中加入腦心浸液肉湯培養基(Oxoid公司培養基)，用無菌涂布棒刮下表面的細菌，在5000r/min條件下離心20min，使用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH = 7. 2)洗滌后，調整該菌濃度至108CFU/mL。然后，吸取250μ 1空腸彎曲桿菌菌液，均勻涂布于CCDA平板培養基(青島海博生物技術有限公司)上，待菌液自然干后，在平板上放置牛津杯，然后向牛津杯中加入100μ 1 上述的乳酸菌發酵上清液，以PH = 3. 8MRS作為對照，在溫度4°C下擴散2小時，再放入培養箱中在溫度37°C與以體積計5% 02U0% CO2和85% N2的環境下培養48h，接著采用常規方法測量抑菌圈的直徑，從中篩選得到一株能有效抑制空腸彎曲桿菌生長的乳酸菌，即乳酸菌CCFM8724，其測量結果列于下表1中。表1 抑菌圈直徑的測量結果
權利要求
1.一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) CCFM8724，該菌株已于 2011 年 11 月 29日在北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No. M92。
2.根據權利要求1所述的植物乳桿菌CCFM8724，其特征在于它具有下述性質(1)體外抑制空腸彎曲桿菌的生長；(2)具有耐酸性，在pH2.0時存活良好；(3)具有耐膽鹽能力，能耐受的膽鹽水平達0.3%；(4)對腸道上皮細胞具有較好的粘附能力；(5)體外抑制空腸彎曲桿菌粘附腸道上皮細胞；(6)抑制空腸彎曲桿菌在雞肉中的生長。
3.根據權利要求1所述的植物乳桿菌CCFM87M在制備抑制空腸彎曲桿菌的藥物組合物或發酵食品中的用途。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述的藥物組合物是由植物乳桿菌 CCFM8724菌劑與在藥學上可接受的載體組成的。
5.根據權利要求4所述的用途，其特征在于所述的植物乳桿菌CCFM87M菌劑是將含有所述植物乳桿菌CCFM8724的菌液通過常規冷凍干燥工藝或其它類似工藝制備所得到的粉齊U，它含有106CFU/g以上的活性植物乳桿菌CCFM8724。
6.根據權利要求3或4所述的用途，其特征在于所述的藥物組合物是顆粒劑、膠囊劑、 片劑、丸劑或口服液劑型。
7.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述的發酵食品是使用含有植物乳桿菌 CCFM8724的發酵劑生產的乳制品、豆制品與果蔬制品。
8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述的發酵劑是采用下述方法制備得到的制備具有下述組成的培養基以該培養基總重量計10%酶水解脫脂乳、0.5%葡萄糖、1. 5%胰蛋白胨、0. 3%酵母浸膏和余量水，所制備培養基的pH是6. 8 ；制備具有下述組成的保護劑100g/L脫脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麥芽糊精、150g/L 海藻糖、10g/L L-谷氨酸鈉和余量水。將植物乳桿菌CCFM87M菌種按照以所述培養基重量計2-4%接種量接種于在溫度 110-120°C下滅菌8-12min的所述的培養基中，然后在溫度37°C下培養18h，用pH 7. 2磷酸鹽緩沖液清洗2-4次，用所述的保護劑重懸使植物乳桿菌CCFM87M濃度達到109CFU/ml ；接著，讓該懸浮液在溫度37°C下預培養60min，再采用冷凍干燥方法制成所述的發酵劑。
9.根據權利要求7或8所述的用途，其特征在于所述的發酵劑含有109CFU/g以上活性植物乳桿菌CCFM8724。
10.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述的發酵乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪；所述的發酵豆制品是酸豆乳、豆豉、豆醬或醬油；所述的發酵果蔬制品是發酵的黃瓜、 胡蘿卜、甜菜、芹菜或圓白菜制品。
全文摘要
本發明涉及一種植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)CCFM8724及其用途。該植物乳桿菌CCFM8724具有體外抑制空腸彎曲桿菌生長的能力，耐酸性與耐膽鹽性能良好，對腸道上皮細胞具有良好的粘附能力，能抑制空腸彎曲桿菌粘附于腸道上皮細胞，抑制空腸彎曲桿菌在雞肉中生長。所述植物乳桿菌CCFM8724可以用于制備抑制空腸彎曲桿菌的藥物組合物，可以使用含有植物乳桿菌CCFM8724菌種的發酵劑生產發酵乳制品、發酵豆制品、發酵果蔬制品以及青貯飼料，該發酵劑賦予這些產品具有一定的酸度和特定的香味，同時延長了產品保藏時間，改善了營養價值和消化性以及產品的安全性。
文檔編號A23L1/20GK102533618SQ201210046430
公開日2012年7月4日 申請日期2012年2月28日 優先權日2012年2月28日
發明者宋元達, 張灝, 張秋香, 王剛, 田豐偉, 趙建新, 趙煜, 郭敏, 陳衛 申請人:江南大學