專利名稱：一種紅樹林克雷伯氏菌及其在生產1,3-丙二醇中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種紅樹林克雷伯氏菌及其在生產1， 3-丙二醇中的應用。
背景技術：
1，3-丙二醇(roo)是一種重要的化工原料，可作為有機溶劑，應用于耐壓高潤滑劑、染料、油墨、防凍劑等行業。PDO可用來合成雜環、藥物中間體、聚酯和聚氨酯，尤其是可作為聚酯PTT的單體。PTT是繼50年代聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、70年代聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)之后實現工業規模的新的可成纖聚酯高分子材料，是一種極有發展前途的新型聚酯材料。1998年PTT被美國評為六大石化新產品之一。PTT與PET、PBT相比除具有聚酯的耐化學性外，還具有其它一些更優良的特性。如尼龍的彈性恢復性；在全范圍無需添加特殊化學藥品即能呈現良好的連續印染特性；抗紫外、臭氧和氮氧化合物的著色性；抗內應力；低水吸附、低靜電以及良好的可生物降解性；可循還利用性等。由于PTT的具有以上優良特性，它在地毯工業、服裝材料、工程熱塑料以及其它眾多領域有著很廣泛的應用。生產PTT纖維的關鍵在于單體原料PDO的來源。PTT占領市場的關鍵在于價格， 而PTT的價格主要取決于PDO的價格。由于不能廉價制得roo，制約了 PTT的研制和市場開拓。直到90年代中期PDO實現了工業化生產，使得PDO價格大大降低，PTT才開始工業化
生產和應用。Dupont和Shell兩家跨國公司曾采用化學合成路線，以環氧乙烷或丙烯為原料生產roo。化學合成法生產roo的缺點是副產物多，選擇性和產率較低，操作條件需要高溫高壓，設備投資巨大，原料不可再生；同時由于產量有限，長期以來PDO售價偏高。目前1，3-丙二醇的生產方法主要是微生物發酵法。與化學合成法相比，微生物發酵法生產1，3_丙二醇具有顯著的優點1、利用成本較低的可再生資源(如甘油、玉米、淀粉)為原料；2、生產條件溫和，操作簡便，不需貴重金屬催化劑；3、選擇性好，副產物較少， 易于分離純化；4、環境污染小。微生物發酵法是以生物技術為特征的“綠色工業”向傳統石油化工提出的強有力的挑戰，具有重要的現實意義，因而越來越受到重視。生物合成法生產1，3-丙二醇是利用微生物歧化甘油產生。至今所有被發現的1， 3-丙二醇生產菌種均為細菌,其中克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、弗氏朽1檬酸桿菌 (Citrobacter freudii)和丁酸梭菌(Clostridium butyricum)具有較高的 I, 3-丙二醇轉化率和1，3-丙二醇生產強度，具有較高的開發前景，從而得到了較多關注。目前被用來生產1，3_丙二醇的克雷伯氏菌主要分離自陸地土壤中。克雷伯氏菌發酵甘油生產1，3-丙二醇的同時會生產多種副產物如乙酸、乳酸、丁二酸、乙醇、2，3-丁二醇等，其中乙酸、乳酸對發酵存在較強的抑制作用；由于發酵過程中自動控制pH需要流加堿液，會形成乙酸鈉、乳酸鈉等有機酸鹽，對發酵過程也存在抑制作用；隨著副產物有機酸與有機酸鹽的積累，抑制了 1，3_丙二醇的生產，到發酵后期，1，3_丙二醇增長緩慢。如果菌種對有機酸或有機酸鹽耐受性增強，那么菌種發酵生產1，3_丙二醇的能力可以得到進一步提聞。紅樹林是海洋與陸地過渡的特殊生態環境，兼具有陸地和海洋的特征。紅樹林土壤的PH值低，呈酸性；由于海水的周期浸潰以及紅樹林與土壤間元素的循環作用，紅樹林土壤的含鹽量較高，具有鹽潰化特征；紅樹林土壤的有機質含量較高，其生態系統中具有豐富多樣的微生物。如果能從紅樹林底泥中分離出克雷伯氏菌，其對有機酸和有機酸鹽的耐受性可能較陸地分離株更強，該特征對工業生產存在潛在的利用價值。目前還沒有利用來源于海洋或海洋與陸地過渡生境的克雷伯氏菌發酵生產1， 3-丙二醇的報導。
發明內容
本發明的第一個目的是提供一種從海洋紅樹林生態系統中分離、篩選的具有生產 I，3-丙二醇優良性能的克雷伯氏菌新菌株肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HSL4，該菌種已于2011年3月21日保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，保藏編號CCTCC NO M 2011075。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4的分離、篩選和鑒定采集廣東省深圳市紅樹林公園潮水退后的紅樹林間表層底泥，進行細菌富集、選擇性培養，挑選菌落再進行純培養，得到一系列不同的菌株。然后采用搖瓶發酵，初步測試所挑選的菌株發酵甘油產1，3_丙二醇的能力；挑選發酵能力最強的菌株HSL4，進行菌種鑒定。采用API 20E試劑條進行生理生化反應鑒定，API 20E試劑條鑒定結果表明所分離到的菌株HSL4屬于腸桿菌科克雷伯氏菌屬。常規提取菌株HSL4的基因組DNA，PCR其16S rDNA， 并序列測定，其16S rDNA序列如SEQ ID NO. I所示,將16S rDNA序列通過GenBank中的 BLAST軟件與GenBank數據庫中的序列進行比對，發現與數據庫中已測序的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的16S rDNA相似性最高,超過99% ;鑒定結果表明所分離的菌株HSL4為肺炎克雷伯氏菌的新菌株，命名為肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HSL4，該菌種已于2011年3月21日保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，保藏編號CCTCC NO M 2011075。采用流加補料批式發酵的方法，用分離的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4發酵甘油生產I, 3-丙二醇,發酵36小時,發酵液中1，3_丙二醇濃度達到 80.08g/l，生產強度達2. 22g/lh，質量轉化率達0.446g/g。表明該菌種具有較強的1，3_丙二醇生產能力，具備工業開發的潛力。因此本發明的第二個目的是提供肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) HSL4 在生產I，3-丙二醇中的應用。本發明從海洋紅樹林生態系統中分離、篩選的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4是肺炎克雷伯氏菌的一個新株,其具有較強的1，3_丙二醇生產能力；該菌株分離自海洋紅樹林生態系統，其對有機酸的耐受性較強。本發明的肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumoniae)HSL4對工業生產存在潛在的利用價值。本發明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4于2011年3月21日保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，保藏編號=CCTCC NO M 2011075。
圖I是肺炎克雷伯氏菌HSL4發酵甘油生產1，3_丙二醇隨發酵時間的變化圖，其中PDO表示I，3-丙二醇，BDO表示2、3-丁二醇，SUC表示丁二酸，LAC表示乳酸，ACE表示乙酸，ETH表示乙醇。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例I :一、菌種的分離鑒定 I、采樣樣品采自廣東省深圳市紅樹林公園潮水退后的紅樹林間表層底泥,樣品采集后裝入滅菌的聚乙烯管中，帶回實驗室立即處理。2、菌種分離、篩選(I)細菌分離將樣本與磷酸鹽緩沖液PBS以質量比I : 50的比例混勻，靜置 30min,棄去下層沉淀,收集上層清液，5000g離心IOmin,取沉淀,用Iml PBS重懸沉淀。取 IOOu I液體涂布于一種高效的克雷伯氏菌分離培養基MIAC，37 °C培養18 24h。MIAC培養基的制備方法如下蛋白胨20. 0g、肌醇5. 0g、阿東醇5. 0g、氯化鈉5. 0g、豬膽鹽5. 0g、瓊脂15. 0g、蒸餾水1000. 0ml，將各成分加入蒸餾水中，加熱溶解，調節pH至7. 0±0. 2，加入
0.I %結晶紫水溶液1ml，I %中性紅水溶液5ml，分裝適當容器，115°C高壓滅菌15min，溫度降至60°C左右,加入100mg/ml羧節青霉素(經0. 22 y m濾膜過濾除菌)Iml,充分混勻，制成平板。選擇培養18 24h后，挑選單個光滑、濕潤、邊緣整齊的紅色菌落，直經為2 4m m，典型菌落突起、黏稠，相鄰菌落會發生融合現象，從平板的背面觀察，菌落具深紅色心。將挑選的菌落再次進行平板劃線，培養，挑選大克隆保存并進行進一步篩選。(2)菌種篩選將挑選的克隆進行搖瓶發酵，篩選生產1，3_丙二醇能力強的菌種進行進一步鑒定。篩選所用培養基如下LB 培養基(g.L—1):酵母粉 Sg.L—1，蛋白胨 IOg .L^NaCl IOg L—1，瓊脂 IOg L—1， 調節至PH 7.0。用于克雷伯氏菌菌種的短期保藏及活化。種子及發酵培養基見表I :表I :培養基組成表(L
權利要求
1.肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HSL4,其保藏編號CCTCC NO M 2011075。
2.權利要求I所述的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HSL4在生產I, 3_丙二醇中的應用。
全文摘要
本發明公開一種紅樹林克雷伯氏菌及其在生產1，3-丙二醇中的應用。肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)HSL4，該菌種已于2011年3月21日保存在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址中國武漢市武漢大學，保藏編號CCTCC NOM 2011075。本發明從海洋紅樹林生態系統中分離、篩選的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4是肺炎克雷伯氏菌的一個新株，其具有較強的1，3-丙二醇生產能力；并且該菌株分離自海洋紅樹林生態系統，其對有機酸的耐受性較強。因此本發明的肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)HSL4對工業生產存在潛在的利用價值。
文檔編號C12N1/20GK102604863SQ20121005323
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月1日 優先權日2012年3月1日
發明者付靜, 周勝, 李莉莉, 秦啟偉, 魏京廣 申請人:中國科學院南海海洋研究所