BudAB基因過表達的產酸克雷伯氏菌基因工程菌株的構建方法及其發酵方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種BudAB基因過表達的基因工程菌株的構建方法及其發酵方法。
【背景技術】
[0002] 基因表達受到一個啟動單位的控制，我們稱之為啟動子。啟動子主要控制基因在 適當的時候進行適量的表達。在研究工作中，常采用過表達技術，用一個強啟動子，讓其過 量表達，從而研究基因的功能。
[0003] 目前困擾人們大規模生物法生產2,3-下二醇的原因主要還是產量，雖然人們不斷 嘗試使用發酵條件優化、菌種誘變育種、菌種代謝調控等手段，但是效果并不是特別明顯。 我們在分析了2,3-下二醇代謝網絡之后發現，在產酸克雷伯氏菌化Iebsiella O巧toca) HD79中屯、碳代謝產2,3-下二醇合成途徑中，有S個關鍵酶起到了非常重要的作用，即a-乙 酷乳酸脫簇酶、a-乙酷乳酸合成酶和2,3-下二醇脫氨酶分別由BudA、BiulB和BudC基因編碼 蛋白。如果通過對運=個關鍵酶進行過量表達，使更多的碳源流向2，3-下二醇代謝途徑，為 今后基因過表達及2,3-下二醇的生產提供理論依據。
【發明內容】
[0004] 本發明是為了解決現有產酸克雷伯氏菌2,3-下二醇產量低的問題，提供一種產酸 克雷伯氏菌基因工程菌株的構建方法及其發酵方法，該基因工程菌株可高產2,3-下二醇。
[0005] 本發明BudAB基因過表達的產酸克雷伯氏菌基因工程菌株的構建方法，按W下步 驟進行：
[0006] 一、從產酸克雷伯氏菌皿79中分別擴增BudA基因和BudB基因，構建克隆載體 pMDl S-T-BudA 和 pMD18-T-Bu 地；
[0007] 二、W表達質粒pRSFDuet-1為骨架，向質粒上的多克隆位點插入目的基因biulB，構 建重組過表達質粒9315胖-扣地，^91?15胖-扣地為骨架，插入目的基因扣(^構建重組過表達 質粒 pRS 抑 uet-1-BudAB;
[000引 S、將重組過表達質粒pRSFDuet-1-BudAB電轉化K.0巧toca HD79感受態細胞，即 得到重組菌株Klebsiella O巧toca皿79-budAB。
[0009] 上述方法構建的產酸克雷伯氏菌基因工程菌株的發酵方法，按W下步驟進行：
[0010] -、將重組菌株Klebsiella oxytoca皿79-budAB單菌落接種到種子培養基中，30 °C，150r/min培養至對數生長期，得種子液；
[0011] 二、然后將種子液W5%接種量接種到裝液量為150mL/500mL發酵培養基中，底物 葡萄糖150g/L，于30 °C，150r/min發酵120h后結束。
[001^ 步驟一中所述種子液培養基配方：（NH4)2S04 lg/L、K2HP04.3H20 3.4g/L、 K也P041.3g/L、MgS04 0.2g/L、酵母提取物Ig/L、微量元素2mL/L和鐵溶液ImL/L，其中鐵溶液 濃度為5mg/mL，調pH值至7.0，12rC高壓滅菌15min，之后向每IOOmL種子培養基中加入經 108°C高壓滅菌20min的5g葡萄糖粉末。
[OOU] 步驟二中所述發酵培養基的配方為：（NH4)2S04 6.6g/L，K2冊〇4*3出O 5.25g/L， K此P〇4 9.5g/L，MgS〇4 0.25g/L，酵母提取物5g/L，微量元素ImL/L，鐵溶液ImL/L調pH值至 6.8，121°(：高壓滅菌15111111;其中鐵溶液濃度為5111肖/1111^。
[0014] 本發明的有益效果：
[0015] 本發明構建了含有BudAB基因過表達重組質粒，利用電轉化方法轉入感受態細胞 中，通過巧光定量PCR方法測定突變株BudAB基因的mRNA表達水平時發現，BudAB基因過表達 基因工程菌株均比原始菌株的基因表達量高;BudA、BiulB基因過表達量為原始菌株相關基 因表達量的39.43倍和51.25倍。利用SDS-PAGE檢測過表達基因工程菌株相應基因蛋白的表 達時發現，分別在29kDa和60kDa處出現目的條帶，并且兩種蛋白的表達量均高于原始菌株。
[0016] 本發明構建的重組菌株Klebsiella O巧toca HD79-budAB的2,3-下二醇最高產量 可達33.3565g/L，比原始菌株提高了34.80%。重組菌株的ODsQQnm值要低于原始菌株，可見單 一的從OD值上并不能表明菌株產2，3-下二醇的能力;一般來說，當發酵液的pH值偏堿性時， 易產生有機酸；當pH值偏酸性時，有機酸產量會下降，同時2,3-下二醇的產量有所提高，所 W本發明的重組菌株產2,3-抓的能力要高于原始菌株。
[0017] 本發明關于基因過表達菌株的構建的研究為今后基因功能的研究和2,3-下二醇 生產提供理論了依據。
【附圖說明】
[0018] 圖1為budA基因PCR擴增產物電泳圖；其中M為DNA Marker DL2000,泳道1和2為 budA基因PCR產物；
[0019] 圖2為budB基因PCR擴增產物電泳圖；其中M為DNA Marker DL2000,泳道1和2為 bu地基因PCR產物；
[0020] 圖3為budA基因陽性克隆菌液PCR驗證結果;其中M為DNA Marker DL2000;泳道1為 陽性克隆菌液PCR擴增產物；
[0021] 圖4為bu地基因陽性克隆菌液PCR驗證結果；其中M為DNA Marker DL2000;泳道1和 2為陽性克隆菌液PCR擴增產物；
[0022] 圖5為BglII和趾〇1雙酶切重組T質粒驗證結果；其中化為DNA Marker DL15000，M2 為DNA Marker DL2000,泳道I為重組T質粒雙酶切產物；
[0023] 圖6為BamH巧日AscI雙酶切重組T質粒驗證結果；其中M為DNA Marker化15000;泳 道1為重組T質粒雙酶切產物；
[0024] 圖7為BamHI和AscI雙酶切重組過表達質粒驗證結果；其中Mi為DNA Marker 化15000，M2為DNAMarker DL2000，泳道1為雙酶切重組過表達質粒產物；
[0025] 圖8為BamH巧PAscI雙酶切質粒pRS抑uet-1結果；其中M為DNA Marker DL15000;泳 道1為BamH巧日AscI雙酶切質粒pRS抑uet-1產物；
[0026] 圖9為重組過表達質粒PCR擴增biulB結果;其中M為DNA Marker DL2000;泳道1、2為 PCR擴增產物bu地；
[0027] 圖 10為Bgin和化〇1 雙酶切pRlSW-budA結果，其中Mi為DNA Marker DL15000;泳道 1 為Bgin和化〇1 雙酶切質粒pRlSW-budA產物;M2為DNAMarker DL2000
[002引 圖 11 BglI巧肋hoi雙酶切pRlSW-bu地結果，其中M:DNA Marker DL15000;l:BglII 和化oI雙酶切質粒pRlSW-bu地產物；
[0029] 圖12為BglII和XhoI雙酶切重組過表達質粒驗證結果；其中M:DNA Marker DLl 5000; I:雙酶切產物；
[0030] 圖13為AscI單酶切重組過表達質粒驗證結果；其中M:DNA Marker化15000; 1:單 酶切產物；
[0031] 圖14為重組過表達質粒PCR擴增budA和biulB結果；其中M:DNA Marker DL2000，1、 2: PCR擴增產物budA; 3、4: PCR擴增產物bu地；
[0032] 圖15為Kan抗性篩選工程菌株；
[0033] 圖16為SDS-PAGE鑒定BudA、BiulB蛋白的表達;其中M:蛋白Marker; 1:原始菌株提取 蛋白；2:工程菌株提取蛋白。
[0034] 圖17為出發菌株和重組菌株的葡萄糖消耗及2,3-下二醇產量對比，其中O表示出 發菌株K.oxytoca皿79的葡萄糖消耗，□表示重組菌的葡萄糖消耗，?表示出發菌株 K.O巧toca皿79的2，3-下二醇產量，表示重組菌的2，3-下二醇產量。
【具體實施方式】
[0035] 本發明技術方案不局限于W下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
【具體實施方式】 [0036] 一:本實施方式BudAB基因過表達的產酸克雷伯氏菌基因工程菌株 的構建方法，按W下步驟進行：
[0037] 一、從產酸克雷伯氏菌皿79中分別擴增BudA基因和BudB基因，構建克隆載體 pMDl S-T-BudA 和 pMD18-T-Bu 地；
[003引二、W表達質粒pRSFDuet-1為骨架，向質粒上的多克隆位點插入目的基因biulB，構 建重組過表達質粒pRlSW-biKlB，WpRlSW-biKlB為骨架，插入目的基因budA構建重組過表達 質粒 pRS 抑 uet-1-BudAB;
[0039] S、將重組過表達質粒pRSFDuet-1-BudAB電轉化K.0巧toca皿79感受態細胞；
[0040] 四、BudAB基因過表達基因工程菌株的篩選和鑒定。
[0041] 本實施方式利用過表達技術，結合2,3-下二醇代謝網絡W及對克隆載體PMD18-T 和表達質粒pRSFDuet-1圖譜分析，構建含有高效表達乙酷乳酸脫簇酶、乙酷乳酸合成酶的 重組過表達質粒BudAB,利用電轉化方法將重組表達質粒轉入產酸克雷伯氏菌化Iebsiella oxytoca)HD79菌株中，使底物能夠更多的流向2,3-下二醇代謝途徑，從而提高2,3-下二醇 產量及底物轉化率。最終選育出利用葡萄糖為碳源高產2,3-下二醇的產酸克雷伯氏菌工程 困株。
[0042] 步驟一所述產酸克雷伯氏菌HD79已在文獻《Klebisella O巧toca HD79乙酸激酶 部分基因（ack)的克隆與序列分析》（中國農學通報，2015。31 (14): 83-88)中公開。
[0043] 本實施方式中每個步驟的具體內容及結果如下：
[0044] 1、克隆質粒 pMD18-T-budA 和 pMD18-T-bu 地的構建
[0045] WKlebsiella O巧toca 皿79基因組DNA為模板，WbudA-叫、budA-down和bu地-UP、biulB-down為引物對budA和biulB進行PCR擴增，引物序列如表1所示，反應體系組分如表2 所示，反應程序如表3所示，結果如圖I，圖2所示。由圖可知，PCR產物與目的片段budA和bu地 大小相同，分別為78化P和1680bp，與設計結果相符。
[0046] PCR產物加"A"，72°C水浴中反應lOmin，用于膠回收的目的片段與PMD18-T進行"T-A"克隆。將目的基因片段進行回收，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段是否準確回收。回收 片段分別命名為"BudA" "BiKlB"。將驗證正確的膠回收片段連接到克隆載體PMD18-T上，反應 體系如表4所示。反應條件：16°C水浴連接過夜。再將連接產物轉化至E. COli D冊a感受態細 胞中，重組質粒命名為"pTSW-budA" "pTSW-bu地"，進行陽性克隆菌液PCR驗證，驗證體系如 表5所示，反應程序如表6所示，結果如圖3、4所示。選用Bgin和趾〇1對克隆質粒pTSW-budA 進行雙酶切，用83抽11和43(31對克隆質粒9了5￥-1311地進行雙酶切酶，反應條件為37°(：水浴地， 反應體系見表7、表8，結果見圖5、6。由圖5可知，酶切產生兩條清晰條帶，大小分別與pMD 18-T和budA基因片段相符。說明budA基因片段與克隆質粒PMD18-T連接成功。由圖6可知，酶切 產生兩條清晰的條帶，其大小分別與質粒PMD18-T和bu地片段相符，說明目的基因bu地已與 PMD18-T連接成功。
[0047] 表1引物序列 [004引
[0化2] 表3budA/bu地基因克隆的反應程序 I 1
[0062] 表8重組克隆質粒biulB酶切反應體系
[0063]
[0064] 2、過表達質粒pRS抑uet-1-budAB的構建
[0065] W表達質粒pRSFDuet-1為骨架，向質粒上的多克隆位點插入目的基因bu地，構建 重組過表達質粒9315胖-扣地，^91?15胖-扣地為骨架，插入目的基因扣(^構建重組過表達質 粒pRS抑uet-1-budAB。
[0066] (1)重組過表達質粒pRS抑uet-1-bu地構建
[0067] 用限制性內