靶向pcsk9基因的脂質配制的dsrna的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2010年06月15日和發明名稱為"靶向PCSK9基因的脂質配制 的DSRNA"的201080032102. 1號發明專利申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及包含靶向PCSK9基因的脂質配制的dsRNA的組合物和治療由PCSK9基 因表達引起的疾病的方法。
[0003] 相關申請的奪叉引用
[0004]本申請要求于2009年6月15日提交的美國臨時申請第61/187, 169號、于2009年 6月18日提交的美國臨時申請第61/218, 350號、于2009年9月22日提交的美國臨時申 請第61/244, 790號、于2009年12月11日提交的美國臨時申請第61/285, 598號、于2010 年1月8日提交的美國臨時申請第61/293, 474號和于2010年3月12日提交的美國臨時 申請第61/313, 578號的優先權，所有這些臨時申請的內容均為了所有目的通過引用整體 并入本文。
[0005] 序列表引用
[0006] 本申請包括以2010年X月XX日創建的、大小為XXX，XXX字節、名稱為16733US_ sequencelisting,txt的文本文件形式電子提交的序列表。該序列表通過引用并入本文。
【背景技術】
[0007]枯草溶菌素前蛋白轉化酶 9(Proproteinconvertasesubtilisinkexin 9，PCSK9)是枯草溶菌素絲氨酸蛋白酶家族的成員。其它8個哺乳動物枯草溶菌素蛋 白酶PCSK1-PCSK8(也被稱為PC1/3、PC2、弗林蛋白酶、PC4、PC5/6、PACE4、PC7 和S1P/ SKI-1)是加工分泌通路中的多種蛋白質并在多種生物進程中發揮作用的前蛋白轉化 酶（Bergeron,F. (2000)J.Mol.Endocrinol. 24, 1 - 22,Gensberg，K.，（1998)Semin.Cell Dev.Biol. 9, 11 - 17,Seidah,N.G. (1999)BrainRes. 848, 45 - 62,Taylor,N.A. , (2003) FASEBJ. 17, 1215 - 1227,和Zhou,A. , (1999)J.Biol.Chem. 274, 20745 - 20748)。現已提 出PCSK9在膽固醇代謝中發揮作用。PCSK9mRNA的表達在小鼠中由于膽固醇膳食飼養而 下調（Maxwell,K.N., (2003)J.LipidRes. 44, 2109-2119)，在H印G2 細胞中被他汀類藥物 上調（Dubuc,G.，（2004)Arterioscler.Thromb.Vase.Biol. 24, 1454-1459)，而在固醇調節 元件結合蛋白（SREBP)轉基因小鼠中上調（Horton,J.D.，（2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100, 12027-12032)，這類似于膽固醇生物合成酶以及低密度脂蛋白受體（LDLR)。此外，現已 發現PCSK9錯義突變與常染色體顯性高膽固醇血癥形式（Hchola3)相關（Abifadel，M.等 人（2003)Nat.Genet. 34, 154-156,Timms,K.M. , (2004)Hum.Genet. 114, 349-353,Leren,T. P. (2004)C1in.Genet. 65, 419-422)。因為現已在日本人群體中發現單核苷酸多態性 (SNP)與膽固醇水平相關，因此PCSK9可能還在決定普通人群的LDL膽固醇水平中起作用 (Shioji，K.，（2004)J.Hum.Genet. 49, 109-114)。
[0008] 常染色體顯性高膽固醇血癥（ADH)是單基因疾病，其患者表現為升高的總膽固醇 水平和LDL膽固醇水平、肌腱黃色瘤和過早的動脈粥樣硬化（Rader，D.J.，（2003)J.Clin.Invest. 111，1795-1803)oADH及隱性形式--常染色體隱性高膽固醇血癥仏冊）（(：〇11611，了. C.，（2003)Curr.Opin.Lipidol. 14, 121-127)的發病機理是由于肝臟對LDL吸收的缺陷。阻 礙LDL吸收的LDLR突變或LDL上與LDLR結合的載脂蛋白B的突變均可導致ADH。ARH是 由ARH蛋白質中的突變造成的，ARH蛋白質是通過與網格蛋白相互作用而胞吞LDLR-LDL復 合物所必需的。因此，如果PCSK9突變是Hchola3家族病的病因，那么PCSK9很可能在受體 介導的LDL吸收中起作用。
[0009] 過表達研究指出PCSK9在控制LDLR水平并因此在控制肝臟對LDL的吸收中的作用 (Maxwell,K.N. (2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101，7100-7105,Benjannet，S?等人（2004) J.Biol.Chem. 279, 48865-48875,Park,S.ff. , (2004)J.Biol.Chem. 279, 50630-50638) 〇 小 鼠中由腺病毒介導的小鼠或人PCSK9過表達3或4天可導致總膽固醇水平和LDL膽固 醇水平的升高，而在LDLR敲除動物中則未發現此作用（Maxwell,K.N. (2004)Proc.Natl. Acad.Sci.USA101, 7100 - 7105,Benjannet,S.,etal. (2004)J.Biol.Chem. 279, 48865 -48875,Park,S.W. , (2004)J.Biol.Chem. 279, 50630 - 50638)。此外，PCSK9 過表達造成肝臟 LDLR蛋白質的大量減少，但不影響LDLRmRNA水平、SREBP蛋白質水平或SREBP蛋白的細胞 核/細胞質比例。
[0010]PCSK9功能缺失突變已在小鼠模型中設計出來（Rashid等人，（2005) PNAS，102, 5374-5379)，并在人類個體中得到鑒定（Cohen等人，（2005)，Nature Genetics.，37, 161-165)。在這兩種情況下，PCSK9功能缺失均導致總膽固醇水平和 LDLc膽固醇水平的降低。回顧過去15年的研究成果發現，缺失一個拷貝的PCSK9可 降低LDLc水平，并導致對抗心血管疾病風險的能力提高（Cohen等人，2006N.Engl. J.Med.，354.，1264-1272)。
[0011] 最近已發現雙鏈RNA分子（dsRNA)通過被稱為RNA干擾（RNAi)的高度保守的 調控機制來阻斷基因表達。W0 99/32619 (Fire等人）公開了長度為至少25個核苷酸 的dsRNA在抑制秀麗隱桿線蟲（C.elegans)基因表達中的應用。現還發現dsRNA在其它 生物體中降解靶RNA，其中所述生物體包括植物（參見，例如W0 99/53050,Waterhouse 等人和W099/61631,Heifetz等人）、果蠅（參見，例如Yang,D.等人，Curr.Biol. (2000) 10:1191-1200)和哺乳動物（參見TO00/44895,Li_er和DE101 00 586. 5,Kreutzer等人）。這種天然機制現已成為開發用于治療因基因異常或有害調控而引 發的疾病的新型藥物的研發熱點。
[0012] 關于靶向？051(9的811?隱的說明可見美國專利7,605,251和恥2007/134161。其 他公開內容可見美國專利申請公開第2010/0010066和W0 2009/134487。
【發明內容】
[0013] 如以下詳述，本文公開了包含靶向PCSK9的脂質配制的siRNA(例如靶向PCSK9的 MC3配制的siRNA)的組合物。還公開了使用該組合物抑制PCSK9表達和治療與PCSK9表達 相關的疾病例如高脂血癥的方法。
[0014] 因此，本發明的一個方面是包含核酸脂質顆粒的組合物，該核酸脂質顆粒包含用 于抑制細胞中人PCSK9基因表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA)，其中該核酸脂質顆粒包含脂質 制齊U，該脂質制劑包含45-65mol%的陽離子脂質、5mol%至大約lOmol%的非陽離子脂質、 25-40mol%的固醇和0? 5-5mol%的PEG或PEG修飾的脂質，所述dsRNA由有義鏈和反義鏈 組成，并且有義鏈包含第一序列且反義鏈包含與SEQIDN0:1523(5'-UUCUAGACCUGUUUUGC UU-3'）的至少15個連續核苷酸互補的第二序列，其中所述第一序列與第二序列互補，并且 其中所述dsRNA的長度為15-30個堿基對。
[0015] 如本文所述，所述組合物包含陽離子脂質。在一個實施方案中，陽離子脂質包含 MC3 (((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6, 9, 28, 31-四烯-19-基 4-(二甲基氨基）丁酸酯。例 如，脂質制劑可選自下組：
【主權項】
1. 一種包含核酸脂質顆粒的組合物，所述核酸脂質顆粒包含用于抑制細胞中人PCSK9 基因表達的雙鏈核糖核酸（dsRNA)，其中 ： 所述核酸脂質顆粒包含脂質制劑，該脂質制劑包含45-65mol %的陽離子脂質、5mol % 至大約10mol%的非陽離子脂質、25-40mol%的固醇和0·5-5mol%的PEG或PEG修飾的脂 質， 所述dsRNA由有義鏈和反義鏈組成，并且有義鏈包含第一序列且反義鏈包含與SEQ ID N0:1523(5' -UUCUAGACCUGUUUUGCUU-3'）的至少15個連續核苷酸互補的第二序列， 其中所述第一序列與所述第二序列互補，并且其中所述dsRNA的長度為15-30個堿基 對。
2. 如權利要求1所述的組合物，其中所述陽離子脂質包含 MC3 (((6Z，9Z，28Z，31Z)-三十七碳-6, 9, 28, 31-四烯-19-基 4-(二甲基氨基）丁酸酯。
3. 如權利要求2所述的組合物，其中所述陽離子脂質包含MC3,并且所述脂質制劑選自 下組：
〇
4. 如權利要求1所述的組合物，其中所述陽離子脂質包含式A，其中式A為
其中RJP R 2獨立為烷基、烯基或炔基，各自可以任選地被取代，且R 3和R 4獨立為低級 烷基，或者馬和R 4可以一起形成任選取代的雜環。
5. 如權利要求4所述的組合物，其中所述陽離子脂質包含XTC(2, 2-二亞油基-4-二甲 基氨基乙基-[1，3]-二氧戊環）。
6. 如權利要求4所述的組合物，其中所述陽離子脂質包含XTC，所述非陽離子脂質包含 DSPC，所述固醇包含膽固醇，且所述PEG脂質包含PEG-DMG。
7. 如權利要求4所述的組合物，其中所述陽離子脂質包含XTC并且所述制劑選自下 組：
O
8. 如權利要求1所述的組合物，其中所述陽離子脂質包含 ALNY-IOO ((3aR, 5s, 6aS) -N, N-二甲基-2, 2-二（(9Z, 12Z)-十八碳-9, 12-二烯基）四 氫-3aH-環戊二烯并[d] [1，3]二氧雜環戊烯-5-胺））。
9. 如權利要求8所述的組合物，其中所述陽離子脂質包含ALNY-100并且所述制劑由以 下組成：
〇
10. 如權利要求1所述的組合物，其中所述有義鏈包含SEQ ID NO: 1227且所述反義鏈 包含 SEQ ID NO: 1228。
【專利摘要】本發明涉及使用靶向PCSK9基因的脂質配制的siRNA的組合物和方法。
【IPC分類】A61P3-06, A61P35-00, A61K31-713, A61K48-00, C12N15-88, A61K9-127, A61P9-10, C12N15-113
【公開號】CN104651408
【申請號】CN201510020286
【發明人】K·菲吉拉德, G·辛克爾, A·阿金克, S·米爾斯泰恩
【申請人】阿爾尼拉姆醫藥品有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2010年6月15日
【公告號】CA2764832A1, CN102458366A, CN102458366B, EP2442792A2, US8273869, US8598139, US20110015252, US20130035371, US20140121263, WO2010148013A2, WO2010148013A3