專利名稱：指導華法林使用起始劑量快速基因分型的方法和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種能實現指導華法林使用起始劑量快速基因分型的方法，具體說是通過抽取人外周血DNA，通過PCR擴增后再進行高分辨率熔解曲線分析，對CYP2C9*3 (1061 A/C)和VKORCl (-1639 G/A)兩個多態性位點進行快速基因分型。該方法可以用于臨床需要服用華法林的各類患者的輔助診斷、治療，屬于生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術。
背景技術：
華法林是目前廣泛應用的香豆素類口服抗凝藥，用于預防和治療血栓栓塞性疾病如人工瓣膜置換、靜脈血栓形成(肺栓塞)、房顫等的口服抗凝治療，以及降低心肌梗死復發及心肌梗死后血栓栓塞死亡的危險。但是華法林的劑量很難掌握，因為不同病人的所需用量可以相差十倍以上。目前，CYP2C9和維生素K環氧化物還原酶(VKOR)基因多態性對華法林代謝的影響逐漸被認識，其中CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORCl (-1639 G/A)與華法林關系最為密切，都與代謝酶的損傷有關，從而導致個體間和民族間華法林用量的差異。因此，臨床上一種快速準確的基因分型方法的應用將對需華法林治療的患者提供個體化的醫療方案。現在已經證實有30多種基因相互作用決定華法林代謝、轉運和藥理作用。患者不同的藥物基因組學信息是導致華法林劑量差異的重要因素。與遺傳因素相關的低凝血酶原患者最常見的原因是CYP2C9代謝活性降低和藥物靶標VKORCl (vitamin K epoxide reductase complex I)低表達。這兩種基因的遺傳多態性在全世界范圍內可解釋15%和 25%的華法林劑量變異。因此美國FDA在2007年修改了華法林的使用說明，建議在使用華法林前進行基因分型。而且CYP2C9、VK0RC1基因多態性分析已經成為國內外有條件的臨床實驗室重要檢測項目。目前檢測CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORCl (-1639 G/A)遺傳多態性的最簡單的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通過應用特異性限制性內切酶消化PCR擴增產物，并根據消化位點是否消失來判斷其變異存在與否。但該方法操作復雜，樣本量多時易造成PCR產物的交叉污染且容易出現酶切不充分或酶切過度而出現假陰性或假陽性結果，可靠性低。探針法操作過程簡單，PCR擴增的特異性高但訂購探針的成本太高，并且探針在反復凍融后容易失效，臨床應用的可行性低。DNA測序法雖然是目前進行基因診斷的金標準，但步驟繁瑣， 過程復雜，試劑價格昂貴，容易出現樣本間的交叉污染而導致測序失敗；另外測序儀的裝備也超出了一般臨床檢驗實驗室的承受范圍。因此，急需要尋找簡單易行的基因分型方法。通過實驗我們證實了高分辨率熔解曲線的方法是一種快速，簡便，經濟，實用的分型方法，并且我們通過對其敏感性和特異性的檢測發現均在98%以上，結果可靠性高。有望在臨床快速基因分型中得到廣泛的應用
發明內容
本發明要解決的首要技術問題是提供一種能指導華法林使用起始劑量快速基因分型的方法。本發明要解決的另一個技術問題是提供一種能指導華法林使用起始劑量快速基因分型的試劑盒。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案一種能指導華法林使用起始劑量快速基因分型的方法，該方法通過提取人的外周血白細胞基因組DNA，采用快速準確的基因分型方法測定受試者的CYP2C9*3(1061 A/C)和 VKORCl (-1639 G/A)兩個位點的基因型。一組能指導華法林使用起始劑量快速基因分型的引物和高分辨率熔解曲線，能特異性的擴增出CYP2C9*3 (1061 A/C)和VKORCl (-1639 G/A)位點的擴增產物，隨著溫度逐漸升高，使擴增產物的DNA解鏈，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，通過檢測熒光信號隨溫度的變化即可得到擴增產物的熔解曲線，根據熔解曲線的形狀從而可以判斷是否存在突變位點以及突變位點的基因型。具有序列表SEQ ID 2和5所不的喊基序列其中SEQ ID 2和3所不序列為 CYP2C9*3(1061 A/C)位點 F 和 R 引物序列，SEQ ID 4 和 5 所示序列為 VKORCl (-1639 G/A) 位點F和R引物序列。一種能指導華法林使用起始劑量快速基因分型的試劑盒(10人份)，由以下試劑組成125 μ I 2 X GC Buffer I 緩沖液(TaKaRa) ,40 μ I dNTP 混合液，50 μ I 超純水，各 10 μ I 10 μ M/L的正向引物和反向引物，5 μ I的熱啟動酶，5 μ I飽和熒光染料SYT09 (美國 Invitrogen公司)。F和R引物是序列表SEQ ID 2-5所示的堿基序列。試劑盒保存溫度為-20度。本發明具有以下優點使用了目前國際上流行的高分辨率熔解曲線技術對 CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORCl (-1639 G/A)進行基因分型，其原理主要是，其原理是在PCR 擴增體系中加入可與雙鏈DNA結合產生熒光的特殊飽和染料，隨著溫度逐漸升高，使擴增產物的DNA解鏈，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，通過檢測熒光信號隨溫度的變化即可得到擴增產物的熔解曲線，從而可以判斷是否存在突變位點。該方法操作簡便，成本低廉，靈敏度和特異度非常高，適合于基層醫療或研究單位。
圖1CYP2C9*3(1061 A/C)和 VKORCl (-1639 G/A)各基因型 HRM 基因分型結果和各
基因型的測序驗證結果。a圖為VKORCl (-1639 G/A)位點的熔解曲線圖，b圖為以VKORCl (-1639 G/A)為基準的熔解曲線轉換圖；c圖為CYP2C9*l/*3熔解曲線圖，d圖為以CYP2C9*l/*3為基準的熔解曲線轉換圖。A，B, C分別為以上各基因型的堿基序列圖，灰色所框堿基為測序證實的單核苷酸多態性位點。A =VKORCl (-1639 A/A) ；B =VKORCl (-1639 G/G) ；C VK0RC1 (-1639 G/A).下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，并非對發明的限定，依照本領域公知的現有技術，本發明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內容所作出的本領域的等同替換，均屬于本發明的保護范圍。
具體實施例方式
實施例I檢測一種能指導華法林使用起始劑量快速基因分型的試劑盒二、試劑盒成分 I. PCR擴增試劑
權利要求
1.一種指導華法林使用起始劑量快速基因分型的方法，該方法通過提取受試者外周血細胞的基因組DNA特異性的擴增出CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORCl (-1639 G/A)位點的擴增產物，擴增產物在進行熔解曲線分析過程中隨著溫度逐漸升高，使擴增產物的DNA解鏈， 熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，通過檢測熒光信號隨溫度的變化即可得到擴增產物的熔解曲線，根據熔解曲線的形狀從而可以判斷是否存在突變位點以及突變位點的基因型，所米用的引物具有序列表SEQ ID 2和5所不的喊基序列其中SEQ ID 2和3所不序列為CYP2C9*3(1061 A/C)位點F和R引物序列，SEQ ID 4和5所示序列為VKORCl (-1639 G/ A)位點F和R引物序列。
2.一種指導華法林使用起始劑量快速基因分型的試劑盒(10人份)，其特征在于由以下試劑組成125 μ I 2 X GC Buffer I緩沖液(TaKaRa)，40 μ I dNTP混合液，50 μ I超純水， 各10 μ I 10 μ M/L的正向引物和反向引物，5 μ I的熱啟動酶，5 μ I飽和熒光染料SYT09 (美國Invitrogen公司)。F和R引物是序列表SEQ ID 2-5所示的堿基序列。試劑盒保存溫度為-20度。
3.根據權利要求I或2的所述方法，其中外周血為靜脈EDTA抗凝血。
4.根據權利要求I或2的所述方法，其中DNA為人基因組DNA。
全文摘要
本發明公開了指導華法林使用起始劑量快速基因分型的方法和試劑盒，屬于生物醫學領域臨床檢測技術中的基因檢測技術。一種快速基因分型的方法，通過提取宿主細胞基因組DNA，測定受試者的CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)的基因型。本發明中CYP2C9*3(1061 A/C)和VKORC1(-1639 G/A)基因的具有SEQ ID 1所示的核酸序列位點，是與華法林代謝相關的最主要的兩個位點之一。本發明的優點是提供了一種能快速準確的基因分型方法及相關試劑盒，該方法快速，操作簡單，成本低廉可用于血栓性相關疾病的預防、輔助診斷和治療，便于基層醫療機構的開展及普及應用。
文檔編號C12Q1/68GK102605076SQ201210082350
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月26日 優先權日2012年3月26日
發明者丁虎, 崔廣林, 汪道文 申請人:汪道文