專利名稱：牦牛源性纖維成分熒光定量pcr定性檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物工程的技術領域，具體的說，是牦牛源性纖維成分熒光定量PCR定性檢測方法。
背景技術：
牦牛是一種能在高原高寒的惡劣環境下生存的哺乳動物，也是牛科動物唯一有紡織利用價值的成員。牦牛分為野牦牛和家牦牛，野牦牛又叫野牛，學名Bosmutus (Poephagrt mutrs),英文名wild yak,藏名音譯亞歸。牦牛生長在海拔3000米 5000米的高寒地區，能耐零下30°C 40°C的嚴寒，牦牛厚厚長長的毛層下聚集著細密的絨毛，這些絨毛為牦牛在高寒的天氣狀況下生存提供了可能。全世界現有牦牛1400多萬頭，大都分布在中國青藏高原及其周圍海拔3000m以上的高寒地區。我國是世界上牦牛數目最多的國家，約占全世界總數的90%。牦牛絨與紫山羊絨在外表形態上很相似，如圖I所示，圖I為顯微鏡下的紫山羊絨(左)和牦牛絨(右)的照片。兩者都在顯微鏡下均存在色素團，給鑒別工作帶來了困難。由于本身帶有色素，紫山羊和牦牛絨通常會被制成深色的織物，這就進一步給檢測鑒別工作增加了難度。一些不法分子利用這一相似性，將牦牛絨充作紫山羊絨坑害給消費者，從中牟利。我國現行的標準GB/T 16988-1997《特種動物纖維與綿羊毛混合物含量的測定》對牦牛絨的描述牦牛絨纖維鱗片張角較小，鱗片密度為100-130個/_，毛色為黑色、棕褐色。而在一般的光學顯微鏡下，鱗片并不是很清晰，檢測起來費時費力。電鏡法成本高，且制樣比較煩索。
發明內容
本發明是一種基于DNA檢測技術的牦牛絨纖維的定性鑒別方法，克服了現有光學顯微鏡檢下鱗片不清晰、費時費力缺點和；以及克服了電鏡檢成本高，且制樣繁瑣的不足。本發明的目的在于，提供一種牦牛源性纖維成分熒光定量PCR定性檢測方法。本發明的另一目的在于，提供一種牦牛源性纖維成分的檢測試劑盒，以及試劑盒的用途。本發明的再一目的在于，提供一種牦牛源性纖維成分熒光定量PCR的引物和探針。本發明所需要解決的技術問題，可以通過以下技術方案來實現作為本發明的第一方面，一種牦牛源性纖維成分熒光定量PCR定性檢測方法，包括以下步驟步驟一、以牦牛絨的DNA為模板，進行PCR擴增；步驟二、檢測擴增產物的熒光信號；其特征在于，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增牦牛源性纖維成分特異性引物對和牦牛源性纖維成分特異性探針。其中，所述擴增牦牛源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO :1和SEQ IDNO 2所示。其中，所述牦牛源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述方法還包括步驟在聚合酶鏈式反應過程中或之后，檢測牦牛源性纖維成分特異性探針發出的熒光信號。其中，所述PCR擴增的條件如下反應體系ABITaqman u niversal PCR master 1111叉(2\)1(^1,0嫩模板44 1,弓|物 O. 6 μ 1，探針 2. 5 μ 1，CldH2O 4. 9 μ I ；反應條件95°C,5min;95°C，15s，60°C，45s，40 個循環。引物的濃度為O. 3 μ M，探針的濃度為O. 25 μ M0作為本發明的第二方面，一種牦牛源性纖維成分的檢測試劑盒，含有以下試劑(a)擴增牦牛源性纖維成分特異性引物對；(b)牦牛源性纖維成分特異性探針。進一步，所述試劑盒還包括(C)標準參照物。其中，所述標準參照物是牦牛源性纖維成分DNA，或含有牦牛源性纖維成分擴增目的片段的質粒DNA，或牦牛絨。其中，所述特異性引物對的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。其中，所述特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。其中，所述牦牛源性纖維成分特異性探針發出的熒光信號。作為本發明的第三方面，一種牦牛源性纖維成分的檢測試劑盒的應用，用于檢測在紡織品中是否存在牦牛源性纖維成分。作為本發明的第四方面，一種如權利要求I所述的牦牛源性纖維成分熒光定量PCR的特異性引物和特異性探針，其特征在于所述特異性引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示；所述特異性探針的序列如SEQ ID NO 3所示。作為本發明的第五方面，一種牦牛源性纖維成分熒光定量PCR的特異性引物和特異性探針的用途，所述特異性引物和特異性探針用于制備檢測紡織品中是否存在牦牛源性纖維成分的試劑盒。本發明的有益效果I、可簡便、快速的檢測和鑒定紡織品中是否存在牦牛源性纖維成分。2、本發明基于牦牛線粒體12SrRNA基因的序列，設計特異性引物和特異性探針的特異性好。3、檢測方法靈敏度佳，可檢測到配比為1% (Wt)的牦牛絨。
圖I :顯微鏡下的紫山羊絨(左)和牦牛絨(右)。圖2 :反應體系優化結果。
圖3 :牦牛引物探針序列與山羊序列的blast結果。圖4 :牦牛引物探針序列與綿羊序列的blast結果。圖5 :牦牛成分的實時熒光PCR結果。圖6 :10倍梯度稀釋后的檢測情況。圖7 :10倍梯度稀釋的線性關系。圖8 :不同配比的牦牛絨檢測情況。圖9 :疑似含有牦牛絨的山羊絨樣品。圖10 :樣品A的檢測結果。 圖11 :樣品B的檢測結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發明而非用于限定本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆實驗室手冊》(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件或廠商提供的條件進行。以下實施例中所涉及的“％”，除特別說明外，均為重量百分比。實施例II、牦牛成分實時熒光PCR擴增的引物和探針設計比較山羊、綿羊、牦牛線粒體12SrRNA基因的序列，選取合適的序列進行引物設計。牦牛源性纖維成分特異性引物擴增產物大小為65bp。特異性引物和探針的序列如下YakF :5’ -AAGCATCTACACCCCAGTGAGAAT-3’ (SEQ ID NO 1)YakR :5’ -GCTTGATGCCAGCTCCTCTT-3’ (SEQ ID NO 2)Pyak :FAM-CCCTCTAGGTTGTTAAAAT-MGB(SEQ ID NO 3)同時設計了牦牛、山羊、綿羊共有的通用引物，通用引物擴增產物大小為88bp，通用引物和探針的序列如下GsyF :5，-GGGTTTACGACCTCGATGTTG-3，(SEQ ID NO 4)GsyR :5，-ACGTAGGACTTTAATCGTTGAACAAA-3’ (SEQ ID NO 5)Pgsy FAM-ACCGCTATCAAAGGTT-MGB (SEQ ID NO :6)其中，FAM表示熒光報告基團，MGB表示淬滅基團。本發明采用熒光探針法，其檢測原理是利用熒光標記特異性探針來識別模板。與現有技術中SYBR染料法相比，本發明熒光標記特異性探針的特異性更強。2、牦牛成分的反應體系的優化取牦牛絨5mg使用Progema毛發抽提試劑盒抽提DNA，50 μ I洗脫液洗脫DNA，取4μ I樣品檢測。反應體系除ABI Taqman universal PCR master mix (2X) 10 μ I,DNA 模板 4 μ I以外，其他成分如表I所示。引物的濃度為O. 3 μ Μ，探針的濃度為O. 25 μ M0
反應的條件為95°C，5min;95°C，15s，60°C，45s，40 個循環。表I、優化反應體系中其他成分的用量
體系引物探針ddH20
~ 04 θΓθ~
~204 2δΓθ~ 306 &Λ~
~0 6 25Λ~
506 2 54 9~優化結果如圖2所示。綜合考慮熒光信號強度，Ct值等因素，選體系5為擴增牦牛成分的實時突光PCR反應體系，即反應體系5 (成分用量ABITaqman universal PCR mastermix (2 X) 10 μ 1，DNA 模板 4 μ 1，引物 O. 6 μ 1，探針 2. 5μ I, ddH20 4· 9 μ I)。3、牦牛成分實時熒光PCR擴增的引物和探針特異性比對與驗證3. I、牦牛成分實時熒光PCR擴增的引物和探針特異性比對牦牛的線粒體12SrRNA與山羊的相似性為89%，與綿羊的相似性為87%。引物和探針與相應位置的比對情況如圖3和圖4 :牦牛引物探針序列與山羊序列的blast結果，見圖3。牦牛引物探針序列與綿羊序列的blast結果，見圖4。3. 2、牦牛成分實時熒光PCR擴增的引物和探針特異性實驗驗證分別取牦牛絨、山羊絨、綿山毛5mg,用progema毛發抽提試劑盒抽提DNA,70y I洗脫液洗脫DNA。引物的濃度為10 μ M，探針的濃度為2 μ M。分別以ddH20，牦牛絨、山羊絨、綿山毛DNA為模板進行實行熒光PCR擴增。退火溫度為60°C 45s。反應體系如下，參見表2 表2、牦牛引物探針特異性驗證實驗反應體系
總量
心Mix 引物探針 DNA ddH20
Total(pl)
1__20__\0__06__2 4(yak) 3.4
220__\0__06__2 4(goat) 3.4
320__\_0__06__2 4(sheep) 3.4
4I 20 I 10 I 0.6 I 2 4(ddH20) 3.4牦牛成分的實時熒光PCR結果，見圖5。4、靈敏度檢測
用優化好的反應體系進行靈敏度的測定。將抽提所得的DNA 10倍梯度稀釋，可以檢測到IO4倍稀釋的牦牛DNA。同時將易混淆，顯微鏡法難分辨的牦牛絨和紫山羊絨以不同的配比混合，其中牦牛絨的含量(重量百分比)分別為100%、10%、1%，實驗證明該方法可以檢測到配比為1%的牦牛絨。結果如圖6-圖8，圖6為10倍梯度稀釋后的檢測情況，圖7為10倍梯度稀釋的線性關系，圖8為不同配比的牦牛絨檢測情況。圖7表明，在重量百分比水平上，Ct值與模板拷貝數之間的線性關系良好，可檢測牦牛源性纖維成分DNA濃度。5、實物的檢測有兩塊疑似含有牦牛絨的山羊絨樣品中。A樣品為深灰淺灰兩層毛呢料，客戶報驗為100%羊絨制品。經顯微鏡法檢測，A樣含羊絨86. 8 %，牦牛絨9.0%，羊毛4. 2 %。B樣品含羊絨78. 1%，牦牛絨19. 1%，羊毛2.8%。樣品表觀見下圖9。
各取A樣、B樣一小塊，剪碎混勻，精確稱量5mg使用Progema試劑盒抽提DNA。每個樣品兩個平行樣。因樣品顏色較深，多次洗脫DNA。取4μ I樣品檢測，同時作Gsy檢測，作為陽性對照。如圖10和表3所示，A樣的Yak的檢測值分別為25. 55，24. 97，相應量的DNA的Gsy 檢測為 22. 65 和 22. 11。如圖11和表4所示，黑色樣B的檢測值均偏大。黑色樣B可能受染料的影響。可以肯定的是樣品A含有牦牛絨，推測樣品B也含有牦牛絨。表3、樣品A的檢測結果
權利要求
1.一種牦牛源性纖維成分熒光定量PCR定性檢測方法，包括以下步驟 步驟一、以牦牛絨的DNA為模板，進行PCR擴增； 步驟二、檢測擴增產物的熒光信號； 其特征在于，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增牦牛源性纖維成分特異性引物對和牦牛源性纖維成分特異性探針。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述擴增牦牛源性纖維成分特異性引物對的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述牦牛源性纖維成分特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的條件如下反應體系ABI Taqman universal PCR master mix (2X) 10 u I, DNA 模板 4 u I,引物.0. 6u 1，探針 2. 5u I, ddH20 4. 9 u I ； 反應條件95°C,5min ；95°C, 15s,60°C,45s,40 個循環。
5.—種牦牛源性纖維成分的檢測試劑盒,含有以下試劑 (a)擴增牦牛源性纖維成分特異性引物對； (b)牦牛源性纖維成分特異性探針。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括 (C)標準參照物。
7.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性引物對的序列如SEQID NO:I 和 SEQ ID NO 2 所示。
8.如權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述特異性探針的核苷酸序列如SEQIDNO 3所示。
9.如權利要求5 8中任一項所述的試劑盒的應用，其特征在于，用于檢測在紡織品中是否存在牦牛源性纖維成分。
10.一種如權利要求I所述的牦牛源性纖維成分熒光定量PCR的特異性引物和特異性探針，其特征在于， 所述特異性引物的序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示； 所述特異性探針的序列如SEQ ID NO 3所示。
全文摘要
本發明公開了一種牦牛源性纖維成分熒光定量PCR定性檢測方法，包括步驟一、以牦牛絨的DNA為模板，進行PCR擴增；步驟二、檢測擴增產物的熒光信號；其中，用于PCR擴增的反應體系中含有擴增牦牛源性纖維成分特異性引物對和牦牛源性纖維成分特異性探針。本發明的方法可簡便、快速的檢測和鑒定紡織品中是否存在牦牛源性纖維成分，設計的特異性引物和特異性探針的特異性好，靈敏度佳，可檢測到配比為1％(wt)的牦牛絨。
文檔編號C12Q1/68GK102634581SQ201210096730
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月5日 優先權日2012年4月5日
發明者葉江, 吳海珍, 唐敏峰, 張小明, 楊娟, 王衛華, 董正廉, 費靜 申請人:上海出入境檢驗檢疫局工業品與原材料檢測技術中心, 華東理工大學