專利名稱：利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β _葡萄糖苷酶的方法。
背景技術：
β -葡萄糖苷酶可以催化水解多種β -葡萄糖苷鍵，具有底物廣譜性和多種生物功能，比如(I) β -葡萄糖苷酶用于纖維素的水解 纖維素是自然界最豐富的碳資源，從纖維素分解為葡萄糖需要3種酶協同作用。β -葡萄糖苷酶可以將纖維二糖水解為葡萄糖，而纖維素酶組分中β -葡萄糖苷酶含量少，活力低，因此成為纖維素酶解的瓶頸。因此篩選或者通過基因工程改造得到高活性的β-葡萄糖苷酶對纖維素有效降解具有重要意義。(2) β -葡萄糖苷酶制備高生物活性苷元的應用研究發現，自然界多種具有高生物活性的物質，由于大部分以糖苷形式存在而降低了其活性。利用葡萄糖苷酶水解掉葡萄糖后可以得到高活性的苷元。例如，人參皂甙是人參中的主要有效成分，含量約4%，但并非所有的人參皂甙都有很高的生物活性。如具有強烈抗癌作用的人參皂甙Rh2在人參中的質量比僅為10_5。而以低活性的人參二醇類皂甙Rg3為底物，β-葡萄糖苷酶可以水解掉一個葡萄糖后得到人參皂甙Rh2。例如，大豆異黃酮具有的很多重要的生理功能，研究發現大豆異黃酮苷元的生理活性遠比其相應糖苷的活性高。大豆異黃酮中97% 99%是以大豆異黃酮糖苷形式存在，苷元形式僅為大豆異黃酮總量的1% 3%。利用β_葡萄糖苷酶可以水解大豆異黃酮糖苷為高生物活性的大豆異黃酮苷兀。傳統的β -糖苷酶篩選，比如以纖維二糖為唯一碳源的篩選方法，主要是對β -糖苷酶產生菌的篩選，獲得β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列較慢，也就不能夠重組為具有高效、高適應性的工程菌。
發明內容
本發明目的是提供一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β -葡萄糖苷酶的方法，該方法篩選時間短，精度高，誤差少，且可以較快獲得β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氣基酸序列，進一步重組為具有聞效、聞適應性的工程菌。本發明采用的技術方案是本發明提供一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β -葡萄糖苷酶的方法，所述方法為(1)從富含纖維素資源的地點采集土樣，提取總DNA，構建fosmid文庫，獲得富集菌液；(2)將富集菌液于含七葉苷的基礎培養基中，20 40°C培養12 24h進行初篩，獲得菌落周圍呈現黑色的菌株；所述含七葉苷的基礎培養基的終濃度組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉10 20g/L，七葉苷O. I lg/L，檸檬酸鐵O. I 5g/L，氯霉素10 50mg/L，溶劑為水；(3)挑取步驟(2)獲得的菌落周圍呈現黑色的菌株接種至基礎培養平板上，20 40°C培養12 24h進行復篩，獲得復篩培養后的平板；所述基礎培養基終濃度組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉10 20g/L，氯霉素10 50mg/L，溶劑為水；(4)取3 IOml 4-甲基傘形酮-β -D-葡萄糖苷(4-MUG)的低熔點瓊脂糖溶液均勻平鋪在步驟(3)獲得平板的上層，待瓊脂糖溶液凝固后，20 40°C培養O. I lh，紫外燈下觀察菌落，菌落周圍顯熒光的，即獲得所述β-葡萄糖苷酶產生菌株，進而獲得β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列，通過本領域公知的生物工程方法將β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列重組為各種工程菌；若無熒光的，即為假陽性菌株；所述4-甲基傘形酮-β -D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液的終濃度組成為4-甲基傘形酮-β -D-葡萄糖苷O. I lg/L，低熔點瓊脂糖I 10g/L，溶劑為水，所述低熔點瓊脂糖的凝膠溫度為24 28°C，優選低熔點瓊脂糖Agarose LM GQT。進一步，步驟(2)所述含七葉苷的基礎培養基中七葉苷的終濃度優選為0. 5g/L，檸檬酸鐵的終濃度優選為2g/L。 步驟⑵所述富集菌液先進行ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6倍稀釋(優選10_5倍稀釋)，再分別于含七葉苷的基礎培養基中進行初篩培養。步驟⑵所述初篩溫度為37°C，培養時間為24h。進一步，步驟(3)所述復篩溫度優選為37°C，培養時間優選為24h。進一步，步驟(4)所述培養溫度優選為37°C，培養時間優選為40min。步驟(4)所述4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液的終濃度組成優選為4-甲基傘形酮-β -D-葡萄糖苷0. 4g/L，低熔點瓊脂糖5g/L，溶劑為水，所述低熔點瓊脂糖的凝膠溫度為24 28°C，優選低熔點瓊脂糖Agarose LM GQT。步驟(4)所述4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液溫度降至40°C時均勻平鋪在步驟(3)獲得的復篩培養后菌株的平板上。本發明所述從富含纖維素資源的地點采集土樣，提取其總DNA，構建Fosmid文庫，采集地點分別為遼寧盤錦市、內蒙古呼和浩特市，采集日期為2007年10月，分別命名為16號Fosmid文庫和18號Fosmid文庫。本發明提取土壤總DNA、構建Fosmid文庫的方式方法是本領域的技術人員所熟知的，不再贅述。本發明從富含纖維素資源的地點采集土樣，提取其總DNA，構建Fosmid文庫，將七葉苷和檸檬酸鐵加入基礎培養基中制備初篩平板，對Fosmid文庫進行初篩，挑取菌落周圍呈現黑色的菌株進行復篩，用4-MUG低熔點瓊脂糖溶液覆蓋復篩菌株，培養后紫外燈下觀察，菌落周圍顯熒光的，確定為表達β -葡萄糖苷酶活性的克隆，將該克隆直接測序或者構建亞庫后測序，即可獲得β -葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列。本發明從遼寧盤錦市、內蒙古呼和浩特市采集土壤分別獲得16號Fosmid文庫和18號Fosmid文庫，根據本發明方法分別篩選得到β-葡萄糖苷酶HU-Yl和β -葡萄糖苷酶HU-Hl，所述β -葡萄糖苷酶HU-Yl的序列為atgaaaatct taagtacgaa tattctcatt gttagtctgg tccttttggt tggatgtagt 60cagccggaat cttcacagca agcctccaat cctaaaatgg atgcctttat taatgacttg 120atgctgaaga tgacgctgga agaaaaaatc ggacagctaa accttcccgt tgcgggtggc 180
cctgccaccg gcattgccgt aaataaaggt cttgaagataaaatacgggc agggcaagta240ggtggaatct ttggtgtgtg ggggcccgat aaagttagaaaggtgcagga gattgcagtg300aatgaatcac gactgaagat ccctctgttt tttggattggatgtaattca cgggcacaaa360actatctacc cgataccact gggtatggcc gccacgtgggacatgtcgtt aattgaacgt420ggtgcccagt tggctgcgca ggaagcatca gccgaaggattgaactggac cttctcaccc480atggtggata tttcccgcga ccctcgctgg ggtcgtatttcagaaggctc tggtgaagat540ccctatctcg gttcgctcat cgcgcaagcc atggtaagaggctatcaggg taatgatctg 600gcggccacca ataccattat ggcatgtgtg aaacactttgctttatatgg cgctgccgaa660gccggcagag attataacac agtggatatg agtcgtgctacgatgtataa tttttttctt720cctccttata aagctgcgct ggatgctggt gcggccagtatcatgagttc atttaatgta780gtggatggaa tcccggcttc gggtaacaaa tggctcttaaccgatgtgct gcgaaagcaa840tggggcttca agggctttgt ggtgtcagat tacaccagtattaacgaaat gatcaatcac900ggcatgggcg atttgaaaac ggtttcatca ctcgcgctgaatgcaggcat ggacatggac960atggtgggag aaggtttttt aactacgttg aagaaatcaatagaagagaa aacggttacc1020gaagaacaaa tcgatcaggc atgccgcaga atattggaagccaaatacaa attgggattg1080ttcgatgatc cttacaaata tatcagcgaa gaacgtgctgctaaagaagt tttcaataac1140gatactcgcc aggtagcacg ccagttggct gcccattcttttgtgttgct gaaaaacaag1200gatcaacttt tgcctctcaa caaaaccaaa acaatggctttcattgggcc gttggccaat1260aatcaacgcg atatgttggg tacgtgggtg attggtggtgaatgggataa atctgtttcg1320gtgctggaag gtgttaaaaa tgcactgggc gaaaaaggcaaagtgttgca tgccaaaggt1380gccaacatta ccaacgatcc ggagatgatt aagcggttgaatttctttgg tcaacctaac1440gtggtgctcg atgagcgctc ctcacaagca atgttgcaggaggcagtagc cactgcatct1500cgtgcagata ttattgtagc ggtgttgggc gaatcgcaaagcatgtcggg tgagtcgtcc1560agccgtacac agttagatct cccggaaagc caaaaagaactattgaaggc actcgtaaaa1620actggtaaga aggtagtgct tgtattgttt accggtcgcccgttaacatt aacctgggaa1680gatgaaaatg tggatgctat tctgaatgta tgggcacccggacatgaagc aggtaatgcc1740attgccgatg tgttgtttgg taactacaat ccttccggtaaactgcctgc aacgtttccg1800cgaagcgtgg gccaggttcc gttgtattac aatcacttgaatacaggccg cccctggaat1860ggtattgatg acaccaagtt taaatccaac tacctggacgaagccaatgt gcccttgtat1920cctttcggat ttggacttag ttacactacg tttggtttttctgatataac cctcagtaag1980caagagttga aaggcaatga aacattaacg gccacggtaacggtaacgaa taccggaaac2040tacgaaggcg aggaaactgt gcagttatac attcgcgatgtggtgggatc ggtgtctcgc2100ccgatgaaag agctgaaagg cttttcaaag atcaatcttaagcccggaga aagtaagcaa2160gtgagtttcg aaatcacacc caatgatctt aagttttataattacgatct gaagtatgag2220tgggaaccgg gcgattttga aatcatgatt ggctccaattcccgcgatgt aaaaatggct228 0tctataaact ggaagaaata a與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在本發明方法篩選時間短，精度高，誤差少，且可以較快獲得β_葡萄糖苷酶的DNA序列和氨基酸序列，進一步重組為具有高效、高適應性的工程菌。
圖IFosmid-Yl及其對照在七葉苷平板上的生長情況1為Fosmid-ΥΙ在七葉苷平板上生長，呈現黑色；2為對照在七葉苷平板上生長，沒有顏色變化；圖2Fosmid_Yl及其對照在4-MUG作用下的紫外燈觀察情況=IFosmid-Yl在紫外燈下顯示的強烈熒光，2對照在紫外燈下顯示的微弱熒光。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例I : 取IOg遼寧盤錦市米集的土壤樣品，應用MoBio公司的PowerSoil DNA IsolationKU，嚴格按照說明書操作，提取土壤DNA。取50mlDNA(0. 5μ g/μ I)，按照Epicentre公司的CopyControI Fosmin LibraryProduction Kit的使用說明，對該DNA片段進行末端補平，低熔點瓊脂糖凝膠電泳后，切取分離含20-60kb堿基之間的DNA的條帶，溶膠法回收該DNA,連接，包裝，轉導入EPI300宿主細胞，涂到含氯霉素的平板上，37°C培養24小時。挑取單克隆保藏，洗脫平板上的菌落保藏池文庫，命名為16號Fosmid文庫。18號Fosmid文庫的構建方法同上所述，土壤樣品采集自內蒙古呼和浩特市。實施例2 含七葉苷的基礎培養基(初篩培養基)終濃度組成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L，七葉苷O. 5g/L，檸檬酸鐵2g/L，氯霉素15mg/L，溶劑為水。基礎培養基(復篩培養基)終濃度組成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉IOg/L，瓊脂粉15g/L，氯霉素15mg/L，溶劑為水。配制4-MUG低熔點瓊脂糖溶液4_甲基傘形酮-β -D-葡萄糖苷(4-MUG)的終濃度為0.4g/L，低熔點瓊脂糖(Agarose LM GQT，凝膠溫度為24 28°C )的終濃度為5g/L，溶劑為水。從實施例I的16號Fosmid文庫中取一管池保藏的菌液O. Olml,用無菌水分別稀釋10_3、10_4、10_5、10_6倍，獲得4份稀釋菌液，分別吸取O. 2mL稀釋菌液，均勻涂布在初篩培養基上，置于37°C恒溫培養箱培養24小時,取稀釋倍數合適、菌落生長均勻的平板,挑取菌落周圍培養基變為黑色的菌株(稀釋倍數為10_5)，命名為Fosmid-Yl，以無β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作為對照，結果見圖I所示(圖I中的I為Fosmid-Yl，2為對照)，Fosmid-Yl菌落周圍有黑色，對照沒有，然后將Fosmid-Yl接種在2份復篩培養基平板上(一份以無β_葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作為對照)，37°C恒溫培養箱培養24小時，獲得復篩培養后的平板，再取降溫到40°C時的4-MUG低熔點瓊脂糖溶液6ml均勻平鋪在上述復篩培養后的平板上，待瓊脂糖凝固后，于37°C培養40分鐘，紫外燈下觀察菌落，菌落周圍顯熒光，確定為表達葡萄糖苷酶活性的克隆，進而構建亞庫后測序，得到葡萄糖苷酶HU-Yl，序列見SEQ. NOl所示，結果見圖2所示，圖2中I為Fosmid-Yl，2為對照。實施例3 β -葡萄糖苷酶HU-Yl在制備白藜蘆醇中的應用將實施例2獲得的β-葡萄糖苷酶HU-Yl基因與pET 28a表達載體連接，再將其轉ΛΕ. Coil BL21 中。將獲得的 E. Coil BL21/pET 28a/Yl 在含 IOOmL 50yg/mL 卡那霉素的LB液體培養基中搖床過夜培養。將IOml過夜培養后的菌液倒入IL 50 μ g/mL卡那霉素的LB液體培養基培養，直到菌液OD6tltl達到O. 6-0. 8時加入IPTG至終濃度為I. OmmoI/L, 28°C誘導12h后，離心收集菌體，菌體用25ml磷酸緩沖液pH7. 4使其重懸浮，并反復凍融使細胞破碎。離心取上清，含β -葡萄糖苷酶HU-Yl蛋白的上清用O. 22 μ m醋酸纖維素濾膜過濾后用鎳柱親和層析進行純化獲得β -葡萄糖苷酶HU-Yl純酶。配制pH = 6的O. 2mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液。取一支試管，加入該緩沖液20ml，加入lmg/ml虎杖苷溶液20ml，混合均勻。加入lmg/ml的β -葡萄糖苷酶HU_Y13ml，混勻后于37°C搖床反應12小時。取反應液5000rpm離心5分鐘，沉淀物即為白藜蘆醇粗制品。干燥后稱重，得到6. Img白藜蘆醇,收率約為52%。實施例4
含七葉苷的基礎培養基(初篩培養基)終濃度組成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L，七葉苷O. 5g/L，檸檬酸鐵2g/L，氯霉素15mg/L，溶劑為水。基礎培養基(復篩培養基)終濃度組成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉IOg/L，瓊脂粉15g/L，氯霉素15mg/L，溶劑為水。配制4-MUG低熔點瓊脂糖溶液4_甲基傘形酮-β -D-葡萄糖苷的終濃度為0. 4g/L，低熔點瓊脂糖的終濃度為5g/L，溶劑為水。從實施例I的18號Fosmid文庫中取一管池保藏的菌液0. 01ml，用無菌水分別稀釋10_3、10_4、10_5、10_6倍，獲得4份稀釋菌液，分別吸取0. 2mL稀釋液，均勻涂布在初篩培養基上，置于37°C恒溫培養箱培養24小時，取稀釋倍數合適(稀釋10_4倍)、菌落生長均勻的平板，挑取菌落周圍培養基變為黑色的菌株，命名為Fosmid-Hl，以無β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作為對照，然后接種在2份復篩培養基平板上(一份以無β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作為對照)，37°C恒溫培養箱培養24小時進行復篩培養，獲得復篩培養后的平板，取降溫到40°C時的4-MUG低熔點瓊脂糖溶液6ml均勻平鋪在上述復篩培養后的平板上，37°C培養I小時，紫外燈下觀察，菌落周圍顯熒光的，確定為表達β -葡萄糖苷酶活性的克隆，進而構建亞庫后測序，得到β -葡萄糖苷酶HU-Hl。實施例5 含七葉苷的基礎培養基(初篩培養基)終濃度組成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉15g/L，七葉苷0. 5g/L，檸檬酸鐵2g/L，氯霉素15mg/L，溶劑為水。基礎培養基(復篩培養基)終濃度組成蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉IOg/L，瓊脂粉15g/L，氯霉素15mg/L，溶劑為水。配制4-MUG低熔點瓊脂糖溶液4_甲基傘形酮-β -D-葡萄糖苷的終濃度為0. 4g/L，低熔點瓊脂糖的終濃度為5g/L，溶劑為水。從實施例I的16號Fosmid文庫中取一管池保藏的菌液0. Olml,用無菌水分別稀釋10_3、10_4、10_5、10_6倍，獲得4份稀釋菌液，分別吸取0. 2mL稀釋液，均勻涂布在初篩培養基上，置于37°C恒溫培養箱培養24小時，取稀釋倍數合適、菌落生長均勻的平板(稀釋10_5倍)，挑取菌落周圍培養基變為黑色的菌株，命名為Fosmid-H2，以無β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作為對照，然后接種在2份復篩培養基平板上(一份以無β-葡萄糖苷酶活性的普通Fosmid菌株作為對照)，37°C恒溫培養箱培養24小時進行復篩，獲得復篩培養后的平板，再將降溫到40°C時的4-MUG低熔點瓊脂糖溶液6ml均勻平鋪在上述復篩培養后的平板上，37°C培養40分鐘，紫外燈下觀察，菌落周圍未顯熒光，確定為ー株顯現假陽性 的克隆。
權利要求
1.一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選￠-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于所述方法為(1)從富含纖維素資源的地點采集土樣，提取總DNA，構建fosmid文庫，獲得富集菌液；(2)將富集菌液于含七葉苷的基礎培養基中，20 40°C培養12 24h進行初篩，獲得菌落周圍呈現黑色的菌株；所述含七葉苷的基礎培養基的終濃度組成為蛋白胨IOg/L,酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L,瓊脂粉10 20g/L,七葉苷0. I lg/L，檸檬酸鐵0. I 5g/L，氯霉素10 50mg/L，溶劑為水；(3)挑取步驟⑵獲得的菌落周圍呈現黑色的菌株接種至基礎培養基中，20 40°C培養12 24h進行復篩，獲得復篩后的平板；所述基礎培養基終濃度組成為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，瓊脂粉10 20g/L，氯霉素10 .50mg/L，溶劑為水；(4)取4-甲基傘形酮-P -D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液均勻平鋪在步驟(3)獲得的平板上，20 40°C培養0. I lh，紫外燈下觀察菌落，菌落周圍顯熒光的，即得所述￠-葡萄糖苷酶產生菌株，進而獲得￠-葡萄糖苷酶的DNA序列，若無熒光的，SP為假陽性菌株；所述4-甲基傘形酮-P -D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液的終濃度組成為.4-甲基傘形酮-P -D-葡萄糖苷0. I lg/L，低熔點瓊脂糖I 10g/L，溶劑為水，所述低熔點瓊脂糖凝膠溫度為24 28°C。
2.如權利要求I所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(2)所述含七葉苷的基礎培養基中七葉苷的終濃度為0. 5g/L，檸檬酸鐵的終濃度為2g/L。
3.如權利要求I所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(2)所述富集菌液先進行10_5倍稀釋，再于含七葉苷的基礎培養基中進行初篩培養。
4.如權利要求I所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(2)所述初篩溫度為37°C，培養時間為24h。
5.如權利要求I所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(3)所述復篩溫度為37°C，培養時間為24h。
6.如權利要求I所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(4)所述培養溫度為37°C，培養時間為40min。
7.如權利要求I所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(4)所述4-甲基傘形酮-P-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液的終濃度組成為4-甲基傘形酮-P-D-葡萄糖苷0. 4g/L，低熔點瓊脂糖5g/L，溶劑為水，所述低熔點瓊脂糖凝膠溫度為24 28°C。
8.如權利要求I所述的利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選P-葡萄糖苷酶的方法，其特征在于步驟(4)所述4-甲基傘形酮-P-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液溫度降至40°C時均勻平鋪在步驟(3)獲得的復篩培養后的菌株的平板上。
全文摘要
本發明公開了一種利用七葉苷和4-MUG從fosmid文庫中篩選β-葡萄糖苷酶的方法(1)從富含纖維素資源的地點采集土樣，提取總DNA，構建fosmid文庫，獲得富集菌液；(2)將富集菌液于含七葉苷的基礎培養基中，20～40℃培養12～24h進行初篩，挑取菌落周圍呈現黑色的菌株接種至基礎培養基中，20～40℃培養12～24h進行復篩，再將4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷的低熔點瓊脂糖溶液均勻平鋪在復篩平板上，20～40℃培養0.1～1h，紫外燈下觀察菌落周圍顯熒光的，即得所述β-葡萄糖苷酶產生菌株，進而獲得β-葡萄糖苷酶的DNA序列；本發明方法篩選時間短，精度高，誤差少。
文檔編號C12R1/19GK102732597SQ20121012716
公開日2012年10月17日 申請日期2012年4月26日 優先權日2012年4月26日
發明者李海峰, 藍袁洋, 黃黎鋒 申請人:杭州師范大學