專利名稱：一種篩查alk融合基因的方法
技術領域：
本發明屬于醫藥和生物技術領域，涉及ALK融合基因的篩查方法，尤其是ALK融合基因篩查的多片段引物及其應用。
背景技術：
據研究報道，對于非小細胞肺癌(NSCLC)，針對特定的靶點開展個體化治療已成為現實，例如通過檢測表皮生長因子受體(EGFR)基因突變，篩選適合EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療的患者亞群。據美國麻省總醫院研究人員發表研究論文稱，檢測一種間變淋巴瘤激酶(ALK)融合基因如(EML4-ALK)，可對NSCLC患者作進一步細分。ALK融合基因于2007年開始見諸NSCLC相關研究報告。在此之前，研究者已經在多種腫瘤中識別了涉及ALK的基因變異，例如間變性大細胞淋巴瘤、炎性成肌纖維細胞瘤 和成神經細胞瘤等，但不包括肺癌。現有技術公開了 ALK融合基因迄今已發現多種變異類型。分析這些融合基因的結構發現，其ALK部分均包括開始于第20外顯子的編碼細胞內酪氨酸激酶結構域的基因片段。經檢測，所有這些融合基因均有生物學功能，其表達產物為一種嵌合酪氨酸激酶。傳統上對ALK融合基因的篩查包括兩種主要形式1、普通PCR，通過設計引物，對某一種具體的融合形式進行擴增，根據瓊脂糖凝膠電泳判斷結果；2、熒光原位雜交(FISH)，通過熒光標記的DNA探針特異性地與腫瘤組織DNA中ALK基因5’端和3’端進行雜交，結果在突光顯微鏡下判讀。對于普通PCR篩查方法，實踐顯示其具有以下明顯缺陷由于ALK融合基因的具體形式眾多，所以至少需要設計多對PCR引物，分別進行多次PCR反應，費時費力；并且如果樣本是一種新的ALK融合形式(具有未知的“伙伴基因”)，則使用此方法則無法有效地進行檢測，而出現假陰性的結果。對于熒光原位雜交(FISH)，雖然目前被認為是診斷融合基因的金標準，但是其價格高昂，實驗步驟復雜，對操作人員的技術水平要求極高，致使其亦無法進行推廣。因此，目前臨床實踐中需要提出更加簡單、方便、靈敏的ALK融合基因的篩查工具和篩查方法。
發明內容
本發明的目的是為克服現有技術所存在的缺陷與不足，提供一種新的篩查ALK融合基因的方法，尤其涉及ALK融合基因的real-time PCR聯合引物及其應用。本發明提供了篩選ALK融合基因的real-time PCR聯合引物。本發明的進一步目的是提供上述real-time PCR聯合引物在篩查ALK融合基因方法中的應用，本發明方法能準確、簡捷、經濟、直觀地判斷ALK融合基因存在與否。本發明的篩查ALK融合基因方法，以樣本中的總RNA反轉的cDNA為模板，加入real-time PCR聯合引物，進行實時熒光聚合酶鏈反應，并通過檢測反應產物中反應單位間Ct值的差值檢驗是否具有ALK融合基因。本方法具有操作簡捷，節約時間，結果判斷直觀、明確，成本較低，污染減少的特點。具體而言，本發明提供的一種篩選ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步驟(I)設計篩查ALK融合基因的7對real-time PCR聯合引物或探針；(2)提取樣本中的總RNA ；(3)以樣本中的總RNA為模板，通過逆轉錄方法合成cDNA ；(4)在7個real-timePCR反應單位中，以(3)中所得的cDNA為模板，分別加入(I)中設計的7對引物或探針，以及包括熒光染料在內的反應預混液；
(5)在real-time PCR反應儀上進行real-time PCR反應,并分別記錄每個樣本的7個反應單位的熒光閾值(Ct值)；(6)分別計算引物或探針I IV所在反應體系的Ct值的均值Ctiffip，和引物或探針V VII所在反應體系的CT值的均值CtBBP ；(7)計算相對表達量值2_'CT，其中-ACT = -(Ct^p-CtBBp);如2_'CT大于12，則認為該樣本具有ALK融合基因。本發明中，篩選ALK融合基因的real-time PCR聯合引物或探針由7對上游引物、下游引物組成，所述7對引物其核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1-14所示，其中第I對SEQID NO 1-2，第 II 對 SEQ ID N03-4，第 III 對 SEQ ID N05-6，第 IV 對 SEQ ID N07-8，第 V 對SEQ ID N09-10，第 VI 對 SEQ ID N011-12，第 VII 對 SEQ ID N013-14。上述引物和探針可以從特定組織中克隆，也可以用化學合成的方法人工合成。本發明中，real-time PCR即實時熒光定量聚合酶鏈反應。聚合酶鏈反應簡稱為PCR,其基本原理類似于DNA的天然復制過程。PCR由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成①模板DNA的變性模板DNA經加熱使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降低，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸=DNA模板一引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板，將待擴目的基因不斷擴增放大。實時熒光定量PCR，是在PCR定性技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光定量PCR技術是一種在PCR反應體系中加入熒光基團利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。real-time PCR以Ct值為重要的計量單位，反應每個反應單位內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。本發明中，反應單位指一個real-time PCR反應單位,例如384孔板或96孔板的一個孔。反應一起可以使用如ABI公司的7900HT Fast、Roche公司的Lightcycler480等。本發明中，包括突光染料在內的反應預混液,可以使用商品化產品如Invitrogen公司的 PowerSYBR Green PCR Master Mix、TaKaRa 公司的SYBR Premix DimerEraser 、BIOTIUM公司的Fast Plus EvaGreen qPCR Master Mix ;也可以使用含有類似熒光染料的具有想盡功能的自制預混物。本發明中，未及詳述的操作均參考冷泉港實驗室的《分子克隆》，10-50bp的寡聚核苷酸序列采用人工合成方法，也可以從上海生工公司購買；生物試劑從美國Invitrogen公司或北京天根公司的生物制劑公司購買。本發明進行了非小細胞肺癌體外樣本的ALK融合基因篩檢并驗證，結果顯示，本發明方法的準確性達到100%，敏感性高于普通PCR方法，特異性與金標準FISH相同，通過本方法檢測的結果未出現假陽性或假陰性本發明的篩查ALK融合基因方法，法以樣本中的總RNA反轉的cDNA為模板，加入real-time PCR聯合引物對，進行實時熒光聚合酶鏈反應，并通過檢測反應產物中反應單位間Ct值的差值檢驗是否具有ALK融合基因。本方法與現有技術比較，具有操作簡捷，節約時間，結果判斷直觀、明確，成本較低，污染減少的特點。而現有技術中，需經PCR反應、瓊脂糖凝膠電泳、紫外燈下觀察目標片段情況；或者需要經石蠟切片、脫蠟、雜交、封片再通過熒光顯微鏡觀察等繁雜的人工分析等過程才能得到結果，操作步驟繁多，對人員技術要求高，需要使用較多的儀器設備和實驗耗材，成本高，耗時多。而且在操作過程中容易造成實驗室污染。 本發明的突出優點在于本方法設計了 real-time PCR聯合引物，以引物對的聯合分析進行識別，僅通過一次real-time PCR反應，即可快捷地完成實驗全過程，并且實驗結果可以快速、直觀的判讀，能夠方便地得到準確明晰的結果。本發明方法既適合于大規模的體外樣本篩查，又適合于對臨床對可疑具有ALK融合基因腫瘤的初步檢測，因此具有較高的科研和臨床使用價值。為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明的進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。
具體實施例方式實施例I實時熒光定量雙標記探針PCR法I、提取樣本中的總RNA，并反轉為cDNA。2、引物及探針設計引物對I上游引物TCTGTGCTGGGCATCTTCAAC(SEQID NO I)下游引物CATGCACGCTTCTGTTCACAC(SEQID NO 2)引物對II上游引物TGTGAACAGAAGCGTGCATGA(SEQID NO 3)下游引物TCTCTCTGGGTGGAACGTGT(SEQID NO 4)引物對III上游引物CAGACACGTTCCACCCAGAGA(SEQID NO 5)下游引物GTGGCACCCTCCTGCAAAGAT(SEQID NO 6)引物對IV上游引物CCGAAATGGATGGGGAAGATGG(SEQID NO 7)
下游引物TCAGGGTCCATGTGACATTCGTC(SEQID NO 8)引物對V上游引物TGTGCTCTGAACAGGACGAACT(SEQID NO 9)下游引物TGAGCTCCAGCAGGATGAACC(SEQID NO 10)引物對VI上游引物TGCCTGTGGCTGTCAGTATTTGG(SEQID NO 11)下游引物GGCACAGCCTCCCTTTCTATAGTAG(SEQID NO 12)引物對VII上游引物CCAGAGGCCTTCATGGAAGGA(SEQID NO 13)下游引物GCCTCCACTGGTGACAAACTC(SEQID NO 14)3、反應體系(IOul)
權利要求
1.一種篩查ALK融合基因的方法，其特征在于，其包括如下步驟 (1)設計篩查ALK融合基因的7對real-timePCR聯合引物或探針； (2)提取樣本中的總RNA； (3)以樣本中的總RNA為模板，通過逆轉錄方法合成cDNA； (4)在7個real-timePCR反應單位中，以(3)中所得的cDNA為模板，分別加入(I)中設計的7對引物，以及包括熒光染料在內的反應預混液； (5)在real-timePCR反應儀上進行real-time PCR反應,并分別記錄每個樣本的7個反應單位的熒光閾值Ct值； (6)分別計算引物I IV所在反應體系的Ct值的均值CtABP，和引物V VII所在反應體系的CT值的均值CtBBP ； (7)計算f，判定樣本中是否具有ALK融合基因。
2.按權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的聯合引物對或探針的核苷酸編碼序列如SEQ ID NO 1-14所示。
3.按權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的步驟(7)中，結果的判定標準為 相對表達量值 2_Δα，其中- ACT = -(CtABP-CtBBP)； 有ALK融合基因2_Δα彡12 ； 無ALK融合基因2_Δετ < 12。
4.按權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的ALK融合基因是非小細胞肺癌相關的ALK融合基因。
5.SEQ ID NO 1-14的real-time PCR聯合引物對或探針在制備篩查ALK融合基因突變的制劑中的用途。
全文摘要
本發明屬于醫藥和生物技術領域，涉及篩查ALK融合基因的方法，尤其是ALK融合基因篩查的多片段引物及其應用。本發明的篩查ALK融合基因的方法，以樣本中的總RNA反轉的cDNA為模板，加入加入核苷酸編碼序列如SEQ IDNO 1-14所示的real-time PCR聯合引物，進行實時熒光聚合酶鏈反應，并通過檢測反應產物中反應單位間Ct值的差值檢驗是否具有ALK融合基因。本發明方法具有操作簡捷，節約時間，結果判斷直觀、明確，成本較低，污染減少的特點。
文檔編號C12N15/11GK102888452SQ20121015841
公開日2013年1月23日 申請日期2012年5月18日 優先權日2012年5月18日
發明者陳海泉, 孫藝華, 王瑞, 潘云建, 胡海川, 李晨光, 王磊, 葉挺, 羅曉陽, 李航, 張揚 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫院