專利名稱：生物轉化法生產β-苯乙醇的方法
技術領域：
本發明涉及香料制備技術領域，具體涉及ー種通過酵母菌發酵制備苯こ醇的方法。
背景技術：
β-苯こ醇又稱為苯こ醇、2-苯こ醇、β-苯基こ醇、2-苯基こ醇、芐基甲醇，最早是作為植物鮮花中特征性的香氣化合物被發現的，是ー種簡單的芳香族伯醇，常溫下為無色液體，具有淡雅、細膩而持久的玫瑰花香氣。苯こ醇作為香料的使用量在全球范圍內僅次于香蘭素，是多種植物香型配方中不可缺少的組份，也可用于調配食品香精和煙用香精。目前，全球β_苯こ醇產量達到了萬噸級別，絕大部分都是采用化學合成的，化學合成的苯こ醇常常含有一些副產物而導致氣味不良，品質完全無法趕及天然苯こ醇。天然苯こ醇廣泛自然存在于許多芳香植物的精油中，但多數情況下濃度太低，以至于無法提取或提取成本極高。天然的β-苯こ醇產量少，價格在1000美元/kg以上，是化學合成β-苯こ醇的300倍，且需求量嚴重不足。申請號為02137575. 5的中國發明專利公開了ー種發酵法生產苯こ醇的方法，該方法是以粉碎的煙草，殘次料煙梗、煙末為原料通過發酵制取苯こ醇的，具有一定的可行性，但發酵液苯こ醇濃度較低，提取エ藝復雜且成本高。申請號為200710071513. I的中國發明專利申請公開了ー種天然2_苯こ醇的制備方法，該方法以釀酒酵母為生物催化劑、以L-苯丙氨酸為底物發生酵生產2-苯こ醇。按歐洲立法規定，用生物轉化合成的2-苯こ醇可以標稱為天然，因為作為其前體的原料L-苯丙氨酸也是采用酶法或微生物發酵法生產，屬天然產品。由此可見，采用生物轉化法合成的2-苯こ醇，產品具有天然屬性，還有氣味純正、生產過程污染小等優點。但是，該制備方法存在著產物的提取分離率較低而使產生2-苯こ醇的生產率較低的缺陷。
發明內容
本發明的目的在于克服上述現有技術的缺陷，提供ー種生物轉化法生產β -苯こ醇的方法，用該方法制備β -苯こ醇的生產率高、產品純度高。為實現上述目的，本發明采用如下技術
生物轉化法生產β -苯こ醇的方法，該方法以釀酒酵母經過擴大培養的種子液為生物催化劑，接種于裝有以L-苯丙氨酸為反應底物的發酵培養基的發酵罐中；所述發酵罐中懸掛ー個裝有大孔樹脂的網袋；待發酵結束后，取出網袋；對發酵液進行澄清精濾，得到的澄清發酵液在樹脂柱中循環回流，然后排掉吸附剩液；再用無水こ醇洗脫樹脂柱，得到含β -苯こ醇的洗脫液；洗脫液先浸泡網袋后導入旋轉蒸發儀濃縮，回收こ醇，得到的濃縮液再進行蒸餾獲得高純度的β-苯こ醇。優選地，種子液按如下步驟制備將釀酒酵母接種至斜面培養基，經活化培養得到斜面活化菌種，再將斜面活化菌種接種至種子培養基，經過種子培養得到釀酒酵母的種子液。優選地,所述斜面培養基采用10° Bx的麥芽汁瓊脂培養基，斜面活化培養的溫度為28°C,時間為4天。優選地，所述種子培養基的組成為葡萄糖10 g/L，10° Bx的麥芽汁3 g/L，蛋白棟5 g/L，酵母膏3 g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7. O。優選地，所述發酵培養基的組成為葡萄糖30 g/L，L_苯丙氨酸8 g/L, MgSO4 ·7Η200.5 g/L, KH2PO4 0.5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH 為 7. O。優選地，發酵罐接入的種子液按體積百分比計為10%，發酵培養的溫度為28°C。優選地，發酵結束后，網袋先用去離子水洗去粘附在網袋和大孔樹脂表面的殘渣。優選地，發酵液澄清精濾時使用不銹鋼板框式過濾器和混合纖維素酷微孔濾膜。優選地，澄清發酵液在樹脂柱中循環回流20_30min，無水こ醇洗脫樹脂柱的時間為 20_30min。優選地，用旋轉蒸發儀濃縮時水浴溫度為80°C。與現有技術相比，本發明的有益效果是
I、在發酵罐中懸掛裝有大孔樹脂的網袋吸附發酵罐中生成的β-苯こ醇，増加了大孔樹脂吸附發酵液中β-苯こ醇的含量，提高了 β-苯こ醇提取量，使得產品的產量高、純度高、氣味純正。2、適合エ業化大規模生產，生產周期短。
圖I為本發明的方法エ藝流程圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例子對本發明作進ー步詳細介紹。實施例I
I.培養基的配制
(I)斜面培養基10° Bx的麥芽汁瓊脂培養基，120°c高壓蒸汽滅菌20min。(2)種子培養基葡萄糖10 g/L，10° Bx的麥芽汁3 g/L，蛋白棟5 g/L，酵母膏3g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7. 0,120°C高壓蒸汽滅菌20min。(3)發酵培養基葡萄糖 30 g/L，L-苯丙氨酸 8 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.5 g/L, KH2PO4
0.5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7.0。2.生產エ藝流程(I)斜面活化菌種溫度為28°C，時間為4天。(2)種子液的制備挑取活化的釀酒酵母菌體到裝有種子培養基的三角瓶中，在溫度為28°C、攪拌轉速為220r/min、通氣量為I. 5L/min的條件下振蕩培養48h。(3)發酵培養先往50L發酵罐中裝入發酵培養基，同時，在發酵罐中懸掛ー裝有500g大孔樹脂的網袋，然后120°C高壓蒸汽滅菌20min，再將種子液裝至發酵罐中，種子液的接入量按體積百分比計為10%，發酵罐裝液量為60%，發酵的條件為溫度28°C、攪拌轉速為200r/min、通氣量為I. 5L/min，連續發酵48h。(4)取出發酵罐中的網袋，用過量的去離子水洗去粘附在網袋和大孔樹脂表面的殘渣；同吋，使用不銹鋼板框式過濾器和混合纖維素酯微孔濾膜對發酵液進行澄清精濾，除去大分子化合物和釀酒酵母菌體，得到發酵澄清液，經檢測發酵澄清液的β -苯こ醇的含量為 3. 10g/L。(5)泵將發酵澄清液導入填充了樹脂的樹脂柱中循環回流20min，使得β -苯こ醇被樹脂充分吸附，排掉吸附剩液。(6)用泵將無水こ醇導入步驟(5)的樹脂柱中循環回流20min，使得樹脂所吸附的β-苯こ醇被洗脫出來，無水こ醇的使用量為30L。(7)將步驟(6)所得的洗脫液用于浸泡網袋，浸泡洗脫的時間為2. 5h,經檢測浸泡液中β -苯こ醇含量為4. 87g/L。(8)將步驟(7)所得的浸泡液導入旋轉蒸發儀，在水浴溫度為80°C的條件下濃縮至浸泡液為I. 5L，同時回收こ醇，濃縮液再轉入蒸餾裝置蒸餾，獲得含量約為98%的β -苯こ醇146g，L-苯丙氨酸的轉化率為80%。
實施例2
I.培養基的配制
(I)斜面培養基10° Bx的麥芽汁瓊脂培養基，120°c高壓蒸汽滅菌20min。(2)種子培養基葡萄糖10 g/L，10° Bx的麥芽汁3 g/L，蛋白棟5 g/L，酵母膏3g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7. O。(3)發酵培養基葡萄糖 30 g/L，L-苯丙氨酸 8 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.5 g/L, KH2PO4
0.5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7.0，120°C高壓蒸汽滅菌20min。2.生產エ藝流程
(I)斜面活化菌種 .溫度為28°C，時間為4天。(2)種子液的制備挑取活化的釀酒酵母菌體到裝有種子培養基的三角瓶中，在溫度為28°C、攪拌轉速為220r/min、通氣量為I. 5L/min的條件下振蕩培養48h。(3)發酵培養先往50L發酵罐中裝入發酵培養基，同時，在發酵罐中懸掛ー裝有500g大孔樹脂的網袋，然后120°C高壓蒸汽滅菌20min，再將種子液裝至發酵罐中，種子液的接入量按體積百分比計為10%，發酵罐裝液量為70%，發酵的條件為溫度28°C、攪拌轉速為200r/min、通氣量為I. 5L/min，連續發酵48h。 (4)取出發酵罐中的網袋，用過量的去離子水洗去粘附在網袋和大孔樹脂表面的殘渣；同吋，使用不銹鋼板框式過濾器和混合纖維素酯微孔濾膜對發酵液進行澄清精濾，除去大分子化合物和釀酒酵母菌體，得到發酵澄清液，經檢測發酵澄清液的β -苯こ醇的含量為 3. 12g/L。(5)用泵將發酵澄清液導入填充了樹脂的樹脂柱中循環回流20min，使得β -苯こ醇被樹脂充分吸附，排掉吸附剩液。(6)用泵將無水こ醇導入步驟(5)的樹脂柱中循環回流20min，使得樹脂所吸附的β-苯こ醇被洗脫出來，無水こ醇的使用量為35L。(7)將步驟(6)所得的洗脫液用于浸泡網袋，浸泡洗脫的時間為2. 5h，經檢測浸泡液中β -苯こ醇含量為4. 43g/L。 (8)將步驟(7)所得的浸泡液導入旋轉蒸發儀，在水浴溫度為80°C的條件下濃縮至浸泡液為1L，同時回收こ醇，濃縮液再轉入蒸餾裝置蒸餾，獲得含量約為98%的β -苯こ醇155g，L-苯丙氨酸的轉化率為82%。實施例3
I.培養基的配制
(I)斜面培養基10° Bx的麥芽汁瓊脂培養基，120°c高壓蒸汽滅菌20min。(2)種子培養基葡萄糖10 g/L，10° Bx的麥芽汁3 g/L，蛋白棟5 g/L，酵母膏3g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7. 0,120°C高壓蒸汽滅菌20min。(3)發酵培養基葡萄糖 30 g/L，L-苯丙氨酸 8 g/L，MgSO4 ·7Η20 0.5 g/L, KH2PO40.5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7.0。2.生產エ藝流程
(I)斜面活化菌種 .溫度為28°C，時間為4天。(2)種子液的制備挑取活化的釀酒酵母菌體到裝有種子培養基的三角瓶中，在溫度為28°C、攪拌轉速為220r/min、通氣量為I. 5L/min的條件下振蕩培養48h。(3)發酵培養先往發酵罐中裝入發酵培養基，同時，在發酵罐中懸掛ー裝有大孔樹脂的網袋，然后120°C高壓蒸汽滅菌20min，再將種子液裝至發酵罐中，種子液的接入量按體積百分比計為10%，發酵罐的裝液量為70%，發酵的條件為溫度28°C、攪拌轉速為200r/min、通氣量為I. 5L/min,連續發酵48h。(4)取出發酵罐中的網袋，用過量的去離子水洗去粘附在網袋和大孔樹脂表面的殘渣；同吋，使用不銹鋼板框式過濾器和混合纖維素酯微孔濾膜對發酵液進行澄清精濾，除去大分子化合物和釀酒酵母菌體，得到發酵澄清液，經檢測發酵澄清液的β -苯こ醇的含量為 3. 07g/L。(5)用泵將發酵澄清液導入填充了樹脂的樹脂柱中循環回流20min，使得β -苯こ醇被樹脂充分吸附，排掉吸附剩液。(6)用泵將無水こ醇導入步驟(5)的樹脂柱中循環回流20min，使得樹脂所吸附的β -苯こ醇被洗脫出來。(7)將步驟(6)所得的洗脫液用于浸泡網袋，浸泡洗脫的時間為2. 5h，經檢測浸泡液中β -苯こ醇含量為4. 35g/L。(8)將步驟(7)所得的浸泡液導入旋轉蒸發儀，在水浴溫度為80°C的條件下濃縮至浸泡液為2L，同時回收こ醇，濃縮液再轉入蒸餾裝置蒸餾，獲得含量約為98%的β -苯こ醇131g，L-苯丙氨酸的轉化率為77%。
上述實施例僅為本發明的優選實施方式，不能以此來限定本發明的保護范圍，本領域的技術人員在本發明的基礎上所 做的任何非實質性的變化及替換均屬于本發明的保護范圍。
權利要求
1.生物轉化法生產β-苯こ醇的方法，其特征在干以釀酒酵母經過擴大培養的種子液為生物催化劑，接種于裝有以L-苯丙氨酸為反應底物的發酵培養基的發酵罐中；所述發酵罐中懸掛ー個裝有大孔樹脂的網袋；待發酵結束后，取出網袋；對發酵液進行澄清精濾，得到的澄清發酵液在樹脂柱中循環回流，然后排掉吸附剩液；再用無水こ醇洗脫樹脂柱，得到含β -苯こ醇的洗脫液；洗脫液先浸泡網袋后導入旋轉蒸發儀濃縮，回收こ醇，得到的濃縮液再進行蒸餾獲得高純度的苯こ醇。
2.如權利要求I所述的生物轉化法生產苯こ醇的方法，其特征在于種子液按如下步驟制備將釀酒酵母接種至斜面培養基，經活化培養得到斜面活化菌種，再將斜面活化菌種接種至種子培養基，經過種子培養得到釀酒酵母的種子液。
3.如權利要求2所述的生物轉化法生產β-苯こ醇的方法，其特征在于所述斜面培養基采用10° Bx的麥芽汁瓊脂培養基，斜面活化培養的溫度為28°C，時間為4天。
4.如權利要求2所述的生物轉化法生產β-苯こ醇的方法，其特征在于所述種子培養基的組成為葡萄糖10 g/L，10° Bx的麥芽汁3 g/L，蛋白棟5 g/L，酵母膏3 g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7. O。
5.如權利要求I所述的生物轉化法生產苯こ醇的方法，其特征在于所述發酵培養基的組成為葡萄糖 30 g/L, L-苯丙氨酸 8 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L, KH2PO4 O. 5 g/L，豆柏粉6 g/L，溶劑為水，并用草酸溶液及草酸鹽溶液調節至PH為7. O。
6.如權利要求I所述的生物轉化法生產苯こ醇的方法，其特征在于發酵罐接入的種子液按體積百分比計為10%，發酵培養的溫度為28°C。
7.如權利要求I所述的生物轉化法生產苯こ醇的方法，其特征在干發酵結束后，網袋先用去離子水洗去粘附在網袋和大孔樹脂表面的殘渣。
8.如權利要求I所述的生物轉化法生產苯こ醇的方法，其特征在干發酵液澄清精濾時使用不銹鋼板框式過濾器和混合纖維素酷微孔濾膜。
9.如權利要求I所述的生物轉化法生產苯こ醇的方法，其特征在干澄清發酵液在樹脂柱中循環回流20-30min，無水こ醇洗脫樹脂柱的時間為20_30min。
10.如權利要求I所述的生物轉化法生產β_苯こ醇的方法，其特征在干用旋轉蒸發儀濃縮時水浴溫度為80°C。
全文摘要
本發明涉及一種生物轉化法生產β-苯乙醇的方法，以釀酒酵母經過擴大培養的種子液為生物催化劑，接種于裝有以L-苯丙氨酸為反應底物的發酵培養基的發酵罐中；發酵罐中懸掛一個裝有大孔樹脂的網袋；發酵結束后，取出網袋；對發酵液進行澄清精濾，得到的澄清發酵液在樹脂柱中循環回流，然后排掉吸附剩液；用無水乙醇洗脫樹脂柱，得到含苯乙醇的洗脫液；洗脫液先浸泡網袋后導入旋轉蒸發儀濃縮，回收乙醇，得到的濃縮液再進行蒸餾獲得高純度的β-苯乙醇。本發明在發酵罐中懸掛裝有大孔樹脂的網袋吸附發酵罐中生成的β-苯乙醇，增加了大孔樹脂吸附發酵液中β-苯乙醇的含量，提高了β-苯乙醇提取量，產品產量高、純度高。
文檔編號C12R1/865GK102660591SQ20121016138
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月22日 優先權日2012年5月22日
發明者盧健, 盧少明, 馬集鋒 申請人:麗華(廣州)香精有限公司