專利名稱：用于分離和鑒定Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于分離和鑒定玉米Ac/Ds轉座突變體中Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物。
背景技術：
玉米是全球第一大糧食作物，是全世界主要的糧食來源。我國玉米的總產量已超過小麥，成為僅次于水稻的第二大糧食作物。而且玉米長期以來都是一種遺傳模式植物。玉米B73基因組的序列測定已經完成，這將加快玉米方面的科學研究。預計在玉米中至少存在3. 2萬個基因，這些基因的克隆和功能分析已成為下一個重要的挑戰。在眾多基因克隆的方法中，插入突變研究一種非常有效的手段。主要包括T-DNA插入突變和轉座子插入突變。由于轉基因技術的限制，在玉米中很難應用T-DNA插入法進行插入突變分析。但是在玉米存在內源的轉座子是很好的進行插入突變研究的工具。目前在玉米中最主要的用于 創建插入突變體的轉座子是Mutator (Mu)和Activator/Dissociator (Ac/Ds)兩個系統。Mu因子具有轉座頻率高，正向突變率高和全基因組范圍插入的特點，目前在國內外已有幾個較大規模的Mu插入突變體庫，并以用于玉米分離和克隆玉米基因。Ac/Ds雖然其轉座頻率較Mu轉座子低，但其在玉米基因組拷貝數低，傾向于向連鎖位點轉座和傾向于插入低甲基化的基因富集區，近年來被作為與Mu互補的系統廣泛的用于構建插入突變體庫和進行基因的定向插入突變分析。在分離鑒定轉座系和利用轉座子標簽法克隆基因的過程中，分離轉座子的側翼序列是一個重要的環節。傳統的分離Ac/Ds側翼序列的方法是以Ac或Ds的部分序列作為探針，通過Southern雜交來鑒定在每一個轉座系材料中所對應的特異條帶，然后回收特異條帶區域的DNA并進行分子內的自連接，再通過反向PCR的方法來擴增特異條帶，最后將側翼條帶測序并驗證。這種方法對DNA的需要量大,而且做Southern和反向PCR是耗時費力的方法，難以提高實驗效率。因此建立操作簡單、快速高效的Ac/Ds側翼序列分離和鑒定方法對于Ac/Ds插入突變體的鑒定和利用轉座子標簽法進行基因克隆都具有重要的意義。Siebert等利用一種部分雙鏈的接頭連接到經過酶切的平末端的DNA片段上,然后利用接頭引物和基因特異性的引物通過嵌套PCR擴增基因上游或下游的序列。由于在接頭的短鏈的3’末端用氨基封閉，減少了由于接頭引物單獨擴增帶來的非目的條帶，從而提高了 PCR產物的特異性。Ji和Braam利用產生3’突出端的內切酶酶切基因組DNA，然后利用在引物的3’端帶有與突出末端互補堿基的接頭引物和基因特異性引物擴增，這種方法中省去了連接的步驟，進一步提高了實驗的效率。
發明內容
本發明的目的之一在于提供一種用于分離Ac/Ds轉座突變體中Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物。本發明的目的之二在于提供利用該特異性引物分離Ac/Ds轉座突變體中Ac/Ds轉座子側翼序列的方法。本發明的目的之三在于提供一種用于鑒定上述Ac/Ds轉座子側翼序列是Ac還是Ds的側翼序列的特異性引物。本發明的目之四在于提供利用該特異性引物區分鑒定Ac和Ds轉座子側翼序列的方法。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案
一種用于分離Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物，其特征在于該引物為
a.用于分離Ac/Ds5’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQ ID NO :1 SEQ ID NO:7所不的喊基序列；
b.用于分離Ac/Ds3’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQ ID NO :8 SEQ ID NO:14所不的喊基序列。一種分離Ac/Ds轉座子側翼序列的方法，采用上述的特異性引物，其特征在于該方法的具體步驟為
a.取10 15株植株的DNA等量混合后，進行限制性內切酶酶切，得到酶切產物；
b.對于步驟a所得酶切產物，如是平末端產物，則連接平末端接頭后，選擇一種相應的Ac末端特異性引物和接頭引物進行第一輪PCR擴增，得到擴增產物；
c.將步驟b所得的PCR擴增產物經稀釋后作為模板，再用第二輪Ac末端特異性引物和接頭引物進行第二輪PCR擴增，得到Ac/Ds轉座子側翼序列。d.對于步驟a所得酶切產物，如是3’突出末端產物，則選擇一種相應的Ac末端特異性引物和RSE接頭引物進行第一輪PCR擴增，得到擴增產物；
e.將步驟d所得的PCR擴增產物經稀釋后作為模板，再第二輪Ac末端特異性引物和RSE接頭引物進行第二輪PCR擴增，得到Ac/Ds轉座子側翼序列。上述步驟a得到的酶切產物為平末端，其連接接頭的接頭序列為由接頭I和接頭2退火獲得；所述的接頭I的序列為SEQ ID NO 19所不的喊基序列；所述的接頭2的序列為SEQ ID NO :20所示的堿基序列；所述的第一輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :21所示的堿基序列。所述的第二輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :22所示的堿基序列。上述的步驟b中，對平末端的酶切產物的PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13 個循環(94° C 30 秒，72° C 20 秒-1° C/秒，72° C I 分鐘)20 個循環(94° C 30 秒，57° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72° C 8分鐘。上述的步驟c中，對平末端的酶切產物的第一輪PCR產物的PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72° C 20秒-1° C/秒，72° C I分鐘)30個循環(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。如上述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :24或SEQ ID NO :25所示的堿基序列；其第二輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :26所示的堿基序列。上述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增條件為94。C預變性3分鐘，94° C 30秒，45° C 20秒，72° C 5秒鐘，11個循環(94° C 30 秒，72° 0 20秒-1° C/秒，72° C I 分鐘)20 個循環(94° C 30 秒，62° C 20 秒，72° CI分鐘)，過度延伸72° C 8分鐘。
上述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增條件為94。C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72。C 20秒-I。C/秒，72。C I分鐘)25個循環(94° C 30秒，60° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。
一種用于鑒定區分Ac和Ds側翼序列的特異性引物，其特征在于該引物為SEQID NO :15 SEQ ID NO 18所示的堿基序列。一種鑒定區分Ac和Ds側翼序列的方法，采用上述的特異性引物，其特征在于該方法的具體步驟為
a.對于來自于aptl-ml::Ac和bz-m2(DI)系統的轉座事件，我們可以用引物SEQ IDN0:17和SEQ ID NO :15和配合相應的側翼序列的引物擴增。根據產物大小可判斷側翼序列是否是Ac的側翼序列。即如以SEQ ID NO 17和對應的5’側翼序列特異性引物進行擴增獲得2670bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO 15和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1911bp +3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ac的側翼序列。如以SEQ ID NO 17和對應的5’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1361bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO 15和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1911bp+3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ds的側翼序列
b.對于來自于sul::Ac和rl::m3系統的轉座事件，我們需要用引物SEQID NO:15 SEQ ID NO :18配合相應的側翼序列的引物擴增，根據產物大小可判斷側翼序列是否是Ac的側翼序列。即如以SEQ ID NO 17和對應的5’側翼序列特異性引物進行擴增獲得2670bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO 15和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1911bp +3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ac的側翼序列；如以SEQ ID NO 18和對應的5’側翼序列特異性引物進行擴增獲得3777bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO 16和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得813bp+3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ac的側翼序列；如以SEQ ID NO 18和對應的5’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1257bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO :16和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得813bp+3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ds的側翼序列
上述的步驟a，b中，PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，30個循環(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C 4分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。本方案中所指的Ac5’和Ac3’末端是根據Genebank中的序列號為⑶595147中的Ac序列的方向指定的，與Ac轉座酶的編碼方向一致。本發明與現有技術相比的具有以下突出的實質性特點和顯著進步本發明利用這些Ac末端特異性引物可以很好擴增獲得基因組中的Ac或Ds的側翼序列。這種檢測方法操作簡單，為大規模的獲得Ac突變體的Ac側翼序列和分離Ac插入突變體的基因的重要的技術手段。
圖I為Shu00071中Ac側翼序列的擴增.基因組DNA經EcoRV酶切后連接接頭。對于每一組泳道1-5的樣品順序為Shu00071-1，Shu00071-2, W22報道系，Ac供體和空白對照。Shu00071-1和Shu00071-2兩份獨立的含有相同的已知Ac轉座子側翼序列的樣品。A利用genomewalking方法擴增Shu00071中3’末端側翼序列。引物Jc4131被用作第一輪Ac末端的特異性引物。對于1，2，3，4，5和6組引物如4217，如4411，如4442，Ac4490, Ac 4528和Ac 4547分別被用作第二輪Ac末端特異性引物。白色箭頭表示在Shu00071-1 and Shu00071_2擴增到了預期大小的條帶并且在親本中沒有擴增到這個條帶。B利用genomewalking方法擴增Shu00071中5’末端側翼序列。引物Jc317被用作第一輪Ac末端的特異性引物。對于1，2，3，4，5和6組引物如281，Ac2l5, Acl69, Ac86,Ac53和Jc22分別被用作第二輪Ac末端特異性引物。白色箭頭表示在Shu00071_l andShu00071-2擴增到了預期大小的條帶并且在親本中沒有擴增到這個條帶。圖2為利用修飾的genomewalking方法鑒定轉座Ac/Ds。來自aptl-ml: :Ac轉座系統的每個轉座系的兩份獨立的樣品經EcoRV酶切。泳道1-20中，如泳道I和2是一個轉座系的兩份樣品，泳道3和4是另一個轉座系的兩份獨立的樣品，依次類推。泳道21為925H報道系，泳道22為Ac供體929. 20，泳道23為空白對照。引物Ac317和Acl69分別被用作是第一輪和第二輪Ac末端特異性引物。白色箭頭標示候選的特異條帶只出現在了某一轉座系的兩份獨立樣品中。 圖3為aptl-152和aptl-323轉座系中側翼序列的確認.泳道1-5 :Ac5’端側翼序列特異性引物分別和Ac末端(A和C)或Ac內部(B和D)特異性引物的擴增產物。泳道6-10 :Ac3’端側翼序列特異性引物分別和Ac末端(A和C)或Ac內部(B和D)特異性引物的擴增產物。泳道I和2 (泳道5和6)是一個轉座系的兩份獨立樣品，泳道3和8為925H，泳道4和9為929. 20，泳道5和10為空白對照。A和B:轉座系aptl-152中側翼序列的鑒定。用Ac末端特異性引物(A)和Ac內部特異性引物(B)分別結合相應的側翼序列的特異性引物都擴增到了預期大小的條帶，表明在aptl-152中鑒定到的轉座子是Ac轉座子。C和D:轉座系aptl-323中側翼序列的鑒定。用Ac末端特異性引物(C)和Ac3’內部特異性引物(D中的泳道6和7)分別結合相應的側翼序列的特異性引物都擴增到了預期大小的條帶，用Ac5’內部特異性引物與5’端側翼序列特異性引物擴增到了一條1395bp的條帶比預期的2704bp小了 1309bp，表明在aptl-323中鑒定到的轉座子是Ds轉座子。圖4為來自于sul: :Ac轉座系統的轉座系Acl78中側翼序列的確認.每組中樣品順序為Acl78-l，Acl78-2，W22報道系，sul: :Ac和空白對照。A :Ac5’末端特異性引物與5’端側翼序列特異性引物的擴增到了預期大小的產物(白箭頭所示)。B :Ac3’末端特異性引物與3’端側翼序列特異性引物的擴增到了預期大小的產物(白箭頭所示)。C :Ac2655f與5’端側翼序列特異性引物的擴增到了預期大小的產物(白箭頭所示)。D Ac2670r與3’端側翼序列特異性引物的擴增到了預期大小的產物。上述4個結果表明在Acl78中鑒定到的轉座子是Ac轉座子(白箭頭所示)。圖5為來自于sul: :Ac轉座系統的轉座系Ac83中側翼序列的確認.每組中樣品順序為Ac83-1，Ac83-2，W22報道系，sul: :Ac和空白對照。A :Ac5，末端特異性引物與5，端側翼序列特異性引物的擴增到了預期大小的產物(白箭頭所示)。B :Ac3’末端特異性引物與3’端側翼序列特異性引物的擴增到了預期大小的產物(白箭頭所示)。C Ac2655f與5’端側翼序列特異性引物的未擴增到預期2019bp大小的產物。D Ac2670r與3’端側翼序列特異性引物的未擴增到預期2915bp大小的產物。E Ac3753f與3’端側翼序列特異性引物的擴增到預期921bp大小的產物。F Ac3777r與5’端側翼序列特異性引物的未擴增預期的4031bp大小的產物，但擴增到了一條1510bp大小的條帶。上述6個結果表明在Ac83中鑒定到的轉座子是Ds轉座子。
具體實施例方式下面結合具體實施事例，進一步闡述本發明。應理解，這些實例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實例中所涉及的引物和方法適用于任何Ac和Ds側翼序列的分離和鑒定。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd ed.)或植物分子生物學一實驗手冊(Plant Molecular Biology — A Laboratory Manual, Melody S. Clark 編，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例一 Ac末端特異性引物的獲得和應用
本發明以根據Genebank中序列號為GU595147中的注釋，截取出其中所包含的Ac轉座子的序列，設計引物。可用于與接頭引物組合擴增Ac/Ds 5’末端側翼序列的Ac末端引物有
引物名稱I序列
Ac22r TTTTCCCATCCTACTTTCATCC Ac53r CGGTTATACGATAACGGTCGGT Ac86r GTTCGAAATCGATCGGGA Acl69r TCGGGAAACTAGCTCTACCG Ac215r ACGAAACGGGATCATCCC Ac281r TCAGTGGTTATGGATGGGAGT Ac317r ICAGCGTTCGCTAGGTATTTCTTA
可用于與接頭引物組合擴增Ac/Ds 3’末端側翼序列的Ac末端引物有
引物名稱I序列—
Ac4131fCCAGATGTGAGCAAGTGATTATG
Ac4217fTAGCCAAGAGCCCAAGACTTATCAC
Ac4411fACCCGACCGGATCGTATCGG
Ac4442fCGTATTTATCCCGTTCGTT
Ac4490fCCGTCCCGCAAGTTAAATATG
Ac4528fGGTATTTTACCGACCGTTACC
Ac4547fICCGACCGTTTTCATCCCT
為了能夠獲得可遺傳的Ac/Ds的側翼序列，對于一個轉座系取兩份獨立的DNA樣品，每
份樣品為10-15株植株的DNA等量混合而成。利用限制性內切酶(如EcoRV，PvuII, PstI,
KpnI等)酶切在15ul體系中500ng DNA樣品。對于獲得的平末端的樣品(如EcoRV, PvuII等)，取50ng酶切產物在IOul體系中連接Clontech公司的genomewalking kit的平末端接頭(由接頭I和接頭2退火獲得,最終接頭濃度為50uM)，取Iul稀釋10倍的連接產物用作后續PCR擴增的模板；對于產生3’突出端的樣品(如PstI，KpnI)取Iul稀釋10倍的酶切產物用作后續PCR擴增的模板(Jiand Braam, 2010)。對于不同限制酶處理的樣品,采用相應的第一輪接頭引物與第一輪Ac末端特異性引物進行擴增。對于Ac5’末端，一般以Ac317r或Ac281r用作第一輪擴增的Ac末端的特異性引物，對于Ac3 ’端，一般以Ac4131f或Ac4217f用作第一輪擴增的Ac末端的特異性引物。將第一輪PCR產物稀釋100倍后，取Iul用作第二輪PCR的引物。對于Ac5’末端，選取比Ac317r或Ac281r更靠近Ac末端的引物用作第二輪擴增的Ac末端的特異性引物，對于Ac3’端，選取比Ac4131f或Ac4217f更靠近Ac末端的引物用作第二輪擴增的Ac末端的特異性引物。以3%的瓊脂糖凝膠檢測第二輪PCR產物。用于平末端酶切產物加接頭的接頭序列和接頭引物(引自Clontech公司的genomewalking kit 的說明書)
權利要求
1.ー種用于分離Ac/Ds轉座子側翼序列的特異性引物，其特征在于該引物為 a.用于分離Ac/Ds5’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQ ID NO :1 SEQ IDNO 7所不的喊基序列； b.用于分離Ac/Ds3’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQ ID NO :8 SEQ IDNO 14所不的喊基序列。
2.一種分離Ac/Ds轉座子側翼序列的方法，采用根據權利要求I所述的特異性引物，其特征在于該方法的具體步驟為 a.取10 15株植株的DNA等量混合后，進行限制性內切酶酶切，得到酶切產物； b.對于步驟a所得酶切產物，如是平末端產物，則連接平末端接頭后，選擇ー種相應的特異性引物和接頭引物進行第一輪PCR擴增，得到擴增產物； c.將步驟b所得的PCR擴增產物經稀釋后作為模板，再用第二輪特異性引物和接頭引物進行第二輪PCR擴增，得到Ac/Ds轉座子側翼序列； d.對于步驟a所得酶切產物，如是3’突出末端產物，則選擇一種相應的特異性引物和RSE接頭引物進行第一輪PCR擴增，得到擴增產物； e.將步驟d所得的PCR擴增產物經稀釋后作為模板，再第二輪特異性引物和RSE接頭引物進行第二輪PCR擴增，得到Ac/Ds轉座子側翼序列。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于步驟a得到的酶切產物為平末端，其連接接頭的接頭序列為由接頭I和接頭2退火獲得；所述的接頭I的序列為SEQ ID NO: 19所示的喊基序列；所述的接頭2的序列為SEQ ID NO 20所不的喊基序列；所述的第一輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO 21所不的喊基序列； 所述的第二輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :22所示的堿基序列。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟b中，對平末端的酶切產物的PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72° C 20秒-1° C/秒，72° C I分鐘)20個循環(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟c中，對第一輪擴增產物的PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72° 0 20秒-1° C/秒，72° CI分鐘)30個循環(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72° C 8分鐘。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO 23, SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:25所示的堿基序列；其第二輪PCR擴增的接頭引物為SEQ ID NO :26所示的堿基序列。
7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第一輪PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，94° C 30秒，45° C 20秒，72° C 5秒鐘，11個循環(94° C 30秒，72° C 20秒-1° C/秒，72° C I分鐘)20個循環(94° C 30秒，62° C 20秒，72° C I分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。
8.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述的步驟a得到的酶切產物為3’突出端的酶切產物，其第二輪PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，13個循環(94° C 30秒，72° C 20 秒-1° C/秒，72° C I 分鐘)25 個循環(94° C 30 秒，60° C 20 秒，72° C I分鐘)，過度延伸72° C 8分鐘。
9.ー種用于鑒定區分Ac和Ds側翼序列的特異性引物，其特征在于該引物為SEQ IDNO :15 SEQ ID NO 18所示的堿基序列。
10.一種鑒定區分Ac和Ds側翼序列的方法，采用上述的特異性引物，其特征在于該方法的具體步驟為 a.對于來自于aptl-ml::Ac和bz-m2(DI)系統的轉座事件，我們可以用引物SEQ IDNO 17和SEQ ID NO 15和配合相應的側翼序列的引物擴增； 根據產物大小可判斷側翼序列是否是Ac的側翼序列； 即如以SEQ ID NO 17和對應的5，側翼序列特異性引物進行擴增獲得2670bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO :15和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1911bp +3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ac的側翼序列； 如以SEQ ID NO 17和對應的5，側翼序列特異性引物進行擴增獲得1361bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO :15和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1911bp+3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ds的側翼序列； b.對于來自于sul:: Ac和rl: :m3系統的轉座事件，我們需要用引物SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO :18配合相應的側翼序列的引物擴增，根據產物大小可判斷側翼序列是否是Ac的側翼序列； 即如以SEQ ID NO 17和對應的5，側翼序列特異性引物進行擴增獲得2670bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO :15和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1911bp +3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ac的側翼序列；如以SEQ ID NO 18和對應的5’側翼序列特異性引物進行擴增獲得3777bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQID NO 16和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得813bp+3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ac的側翼序列JnWSEQ ID NO :18和對應的5’側翼序列特異性引物進行擴增獲得1257bp+5’側翼序列長度的片斷，并且SEQ ID NO 16和對應的3’側翼序列特異性引物進行擴增獲得813bp+3’側翼序列長度的片斷，則說明該側翼序列為Ds的側翼序列； 上述的步驟a，b中，PCR擴增條件為94° C預變性3分鐘，30個循環(94° C 30秒，57° C 20秒，72° C 4分鐘)，過度延伸72。C 8分鐘。
全文摘要
本發明涉及一種用于分離和鑒定Ac/Ds轉座子側翼序列的引物及方法。該引物為a.用于分離Ac/Ds5’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQIDNO1～SEQIDNO7所示的堿基序列；b.用于分離Ac/Ds3’端側翼序列的Ac末端特異性引物為SEQIDNO8～SEQIDNO14所示的堿基序列。本發明涉及一種用于鑒定區分Ac和Ds側翼序列的特異性引物及方法，其特征在于該引物為SEQIDNO15～SEQIDNO18所示的堿基序列。利用這些Ac特異性引物可以很好擴增獲得基因組中的Ac或Ds的側翼序列。這種檢測方法操作簡單，為大規模的獲得Ac突變體的Ac側翼序列和分離Ac插入突變體的基因的重要的技術手段。
文檔編號C12N15/11GK102649959SQ201210162980
公開日2012年8月29日 申請日期2012年5月24日 優先權日2012年5月24日
發明者宋任濤, 徐大彬, 李鵬飛, 樊軍, 王飛, 許政暟, 趙志偉, 郭圣明 申請人:上海大學