用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記，選擇刀鱭逆轉座子SINE的多態性位點為目標，依據插入位點的側翼序列，設計特異性引物，應用PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、分子克隆等方法獲得SINE插入或缺失位點的DNA片段，用這些特異的DNA片段來識別刀鱭的不同種群。本發明可以快速、準確地確定刀鱭種群，在刀鱭的分子標記輔助育種、魚苗的人工放流效果評價和種群動態監測等方面具有廣泛用途。
【專利說明】用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記
【技術領域】
[0001] 本發明涉及魚類的分子生物學【技術領域】，具體地說，是一種用于刀鱭不同生態型 種群識別的分子標記。
【背景技術】
[0002] 魚類物種的界定涉及兩個層次，一是物種水平，二是種群水平。物種識別方法有外 部形態判斷法、生化法，以及最近十幾年發展的一種分子標記的方法。形態判斷法常用于物 種水平的鑒別；種群水平的識別，曾使用生化方法，但該方法較為繁鎖，且誤判率也較高，現 基本上不再采用，取而代之的是一種分子標記的方法。因為分子標記的穩定性好，現被廣泛 地應用于魚類種群識別、種群遺傳結構、遺傳作圖等理論研究，以及魚類保護生物學和魚類 遺傳育種等實踐領域。
[0003] 目前，基于DNA片段差異作為分子標記的主要有3種：（1)基于PCR的分子標記 技術，如限制性片段長度多態性，隨機擴增多態性DNA，基因特異擴增片段長度多態性等； (2)基于重復序列的分子標記，如微衛星DNA和小衛星DNA; (3)基于轉座子的插入和缺失 的分子標記，如Tel和SINE。
[0004] SINE ( short interspersed element , SINE )稱短散在重復序列，序列長度 一般僅為1〇〇?500 bp，在真核生物基因組中的拷貝數為103~105,散布于生物基因組內。 SINE具有3個結構域：5'端tRNA相關區、tRNA非相關區、3'端尾區。SINE在相關的逆轉 座酶的介導下，通過"復制一插入"的機制，其復制子整合到宿主的基因組內。SINE插入到 基因組內后，將會產生穩定的遺傳；而且宿主對SINE的插入缺乏刪除機制，使得不同種系 基因組的等位點產生SINE的插入或缺失，通過"插入或缺失"性狀，可識別不同的種系或種 群。
[0005] 中國專利文獻CN103820467A公開了一種牡丹SINE類反轉錄轉座子序列的分離 方法，先分離出牡丹SINE類反轉錄轉座子的部分序列，根據其序列設計引物；以所設計引 物進行PCR反應，得到生物素標記的探針；提取牡丹基因組后進行酶切，得到基因組酶切片 段；同時將兩條寡聚核苷酸鏈退火，形成雙鏈的寡聚核苷酸接頭，之后將酶切后的基因組片 段與接頭連接，并以單引物的PCR擴增，進行基因組片段庫的富集；將生物素標記的探針與 所得基因組片段雜交，篩選出目的片段；所得目的片段進行接頭PCR，將反應產物進行克隆 及陽性菌篩選以后，測序，進行序列分析，得到牡丹SINE類反轉錄轉座子序列。目前，針對 魚類開發的SINE分子標記非常稀少，本發明提供的對于名貴的刀鱭的不 同生態型種群的SINE標記還未見研究報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種用于刀鱭不同生態型種群識別 的分子標記。
[0007] 為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：一種用于刀鱭不同生態型種群識別 的分子標記，所述的分子標記為SINE插入位點的特異引物，所述的特異引物為Locus 18位 點、Locus 40位點或Locus 58位點的引物的一種或者其組合，所述的引物序列分別為： Locus 18位點的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位點的下游引物如SEQ ID NO. 2所示， Locus 40位點的上游引物如SEQ ID NO. 3所示， Locus 40位點的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位點的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位點的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0008] 所述的分子標記用于識別刀鱭的不同種群。
[0009] 所述的分子標記進行種群識別的方法，包括以下步驟：運用所述的分子標記通過 PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、克隆、測序獲得SINE位點的種群特異性的DNA片段，根據擴增片 段數目、大小的差異性，識別出刀鱭的不同種群。
[0010] 本發明優點在于： 基于SINE位點擴增片段的數目和大小的分子標記技術，可以快速、準確地確定刀鱭種 群。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 附圖1是刀鱭的6個不同種群：浙江象山港（XS)，上海崇明（CM)，江蘇靖江（JJ)， 太湖（TH)，江西鄱陽湖（PY)，湖南洞庭湖（DT)種群，每個種群樣本數10尾（1 一 10)，Locus 18 DNA片段的擴增結果。
[0012] 附圖2是刀鱭的6個不同種群：浙江象山港（XS)，上海崇明（CM)，江蘇靖江（JJ)， 太湖（TH)，江西鄱陽湖（PY)，湖南洞庭湖（DT)種群，每個種群樣本數10尾（1 一 10)，Locus 40 DNA片段的擴增結果。
[0013] 附圖3是刀鱭的6個不同種群：浙江象山港（XS)，上海崇明（CM)，江蘇靖江（JJ)， 太湖（TH)，江西鄱陽湖（PY)，湖南洞庭湖（DT)種群，每個種群樣本數10尾（1 一 10)，Locus 58DNA片段的擴增結果。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0015] 本發明通過選擇SINE插入位點的側翼序列，設計特異引物，利用PCR、分子克隆和 測序等現代分子生物學技術，瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統獲得的圖片，根據凝膠圖片上 DNA片段的大小和數目，識別刀鱭不同生態型種群。
[0016] 實施例1 實驗材料 刀鱭按照樣本來源，分為浙江象山港（XS)，上海崇明（CM)，江蘇靖江（JJ)，太湖（TH)， 江西鄱陽湖（PY)，湖南洞庭湖（DT) 6個種群，每個種群樣本數為10尾。浙江象山港樣本來 自水產品市場，采集地不祥，其余樣本為隨船捕撈。
[0017] 基因組DNA提取 樣本基因組DNA的提取，按照上海Sangon的UNIQ-10柱式基因組DNA提取試劑盒說明 書操作，提取的DNA用紫外分光光度計檢測其質量和濃度，-20°C保存備用。
[0018] 位點分離 根據SINE的保守序列設計引物，通過PCR方法獲得刀鱭基因組中SINE部分序列，此序 列的5端連接生物素，作為探針，然后與磁珠形成"探針一生物素一磁珠"復合體后，與酶切 的刀鱭基因組DNA文庫雜交，捕獲文庫中包含SINE的DNA片段，克隆和測序，由此得到刀鱭 基因組中SINE插入位點的信息。
[0019] 引物設計 根據SINE插入位點的側翼序列，用PrimerPremier6. 0軟件和Jellyfishl. 4軟件，設計 SINE插入位點的特異引物，由上海Sangon生物工程公司合成，PCR對刀鱭不同生態型種群 的DNA擴增后，有3對引物在不同種群中擴增出差異的DNA條帶，其序列分別是： Locus 18位點的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位點的下游引物如SEQ ID NO. 2所示， Locus 40位點的上游引物如SEQ ID NO. 3所示， Locus 40位點的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位點的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位點的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0020] 擴增和克隆 PCR擴增反應在德國Eppendorf公司生產的Mastercycler? ep gradient熱循環儀 上進行，每個擴增反應總體積為20ul，其中模板基因組DNAlOOng，每種dNTP，每種引物各 0· 5ul，TaqDNA聚合酶0· 25U，反應液在94°C預變性 3 min，94°C變性 30sec，60°C退火30sec， 72°C延伸8min，共35個循環，最后在72°C延伸10min。PCR產物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳中分 離，用上海Sangon公司膠回收試劑盒純化切取的擴增片段，純化方法參照產品手冊進行， 將回收的DNA片段克隆于載體pMD19 - T(TakaRa公司），連接反應及細菌轉化按pMD19 - T載體試劑盒說明書進行操作。
[0021] 測序和序列分析 選取陽性克隆菌落，經PCR鑒定后，由上海Sangon公司對陽性克隆進行測序，采用 Blastn軟件進行核苷酸序列相似性比較，分析所得克隆序列是否在其他物種中存在同源 性。依據Jellyfish軟件分析SINE的插入或缺失。
[0022] 綜合運用以上實驗方法與技術，擴增刀鱭不同生態型種群中SINE插入或缺失位 點的DNA片段，下面將結合附圖，進一步詳述其擴增結果在刀鱭種群識別上的應用。
[0023] 從圖1可知，XS、CM、JJ、TH的種群中，樣本能擴增出1條大小分別約為450 bp的 條帶；PY、DT的種群中，樣本能擴增出450,200bp的條帶，僅在PY5和DT6、DT7樣本中不能 擴增200 bp的條帶。Locus 18位點的200bp的條帶，用于識別PY和DT種群樣本的準確率 85% (17/20)。
[0024] 從圖2可知，XS、CM、JJ、TH的種群的樣本，部分樣本能擴增出450、250 bp的2條 帶；PY、DT群體樣本都能擴增出1條大約450bp的條帶。Locus 40位點的250bp的條帶，用 于識別CM、JJ、TH種群樣本的準確率73% (22/30)，從XS的群體中誤判率為20% (2/10)，可 把CM、JJ、TH種群與XS、PY、DT群體相區分。
[0025] 從圖3可知，XS、CM、JJ、TH的群體樣本都能擴增出1條大小約為400 bp的條帶； PY、DT的群體樣本能擴增出1條約為300bp的條帶，僅PY9擴增出400bp的條帶。Locus 58 位點的300bp的條帶，用于識別PY和DT種群樣本的準確率95% (19/20)，可把PY、DT種群 與XS、CM、JJ、TH群體相區分。
[0026] 綜合使用上述3個位點的SINE分子標記，可快速、準確地識別出刀鱭的鄱陽湖和 洞庭湖的種群。
[0027] 實施例2 實驗方法 SINE插入位點的特異引物，其序列為： Locus 18位點的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位點的下游引物如SEQ ID NO. 2所示， Locus 40位點的上游引物如SEQ ID NO. 3所示， Locus 40位點的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位點的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位點的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0028] 通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、克隆、測序獲得SINE位點的種群特異性的DNA片 段，根據擴增片段數目、大小的差異性，識別出刀鱭的不同種群。
[0029] 實施例3 實驗方法 SINE插入位點的特異引物，其序列為： Locus 18位點的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位點的下游引物如SEQ ID NO. 2所示。
[0030] 通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、克隆、測序獲得SINE位點的種群特異性的DNA片 段，分析Locus 18位點的測序結果，能夠擴增出1條大小約為450bp的條帶但不能擴增出 200bp的條帶的樣本為象山港、崇明、靖江或太湖的刀鱭，能擴增出450、200bp的條帶的樣 本為鄱陽湖或洞庭湖的刀鱭。
[0031] 實施例4 實驗方法 SINE插入位點的特異引物，其序列為： Locus 40位點的上游引物如SEQ ID N0. 3所示， Locus 40位點的下游引物如SEQ ID NO. 4所示。
[0032] 通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、克隆、測序獲得SINE位點的種群特異性的DNA片 段，分析Locus 40位點的測序結果，能擴增出450bp、250bp的2條帶的樣本為崇明、靖江或 太湖的刀鱭，能擴增出1條約為450bp的條帶的樣本為象山港、鄱陽湖或洞庭湖的刀鱭。
[0033] 實施例5 實驗方法 SINE插入位點的特異引物，其序列為： Locus 58位點的上游引物如SEQ ID N0. 5所示， Locus 58位點的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0034] 通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、克隆、測序獲得SINE位點的種群特異性的DNA片 段，分析Locus 58位點的測序結果，能夠擴增出1條大小分別約為400 bp的條帶的樣本為 象山港、崇明、靖江或太湖的刀鱭，能擴增出1條約為300bp的條帶的樣本為鄱陽湖或洞庭 湖的刀鱭。
[0035] 實施例6 實驗方法 SINE插入位點的特異引物，其序列為： Locus 40位點的上游引物如SEQ ID N0. 3所示， Locus 40位點的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位點的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位點的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
[0036] 通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、克隆、測序獲得SINE位點的種群特異性的DNA片 段，分析Locus 40和Locus 58位點的測序結果：Locus 40位點能擴增出450bp、250bp的 2條帶，Locus 58位點能夠擴增出1條大小分別約為400 bp的條帶的樣本為崇明、靖江或 太湖的刀鱭；Locus 40位點能擴增出1條約為450bp的條帶，Locus 58位點能夠擴增出1 條大小分別約為400 bp的條帶的樣本為象山港的刀鱭；Locus 40位點能擴增出1條約為 450bp的條帶，Locus 58位點能夠擴增出1條大小分別約為300 bp的條帶的樣本為鄱陽湖 或洞庭湖的刀鱭。
[0037] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人 員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為 本發明的保護范圍。 SEQUENCE LISTING 〈110>上海海洋大學 〈120>用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記 <130> / <160> 6 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 <400> 1 ggcatggttg acaatgtgct ctg 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 2 acctgctctt ccttgatttc cactc 25 <210> 3 <211> 21 〈212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 3 ccatcggaga gcacgcaact t 21 <210> 4 <211> 20 〈212> DNA 〈213>人工序列 <400> 4 acctgccgcc ttccaactga 20 <210> 5 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 5 ccaccaggtc tgtcagtgtt gtt 23 <210> 6 <211> 23 <212> DNA 〈213>人工序列 〈400> 6 gtgccaggat ggaggatgtc att 23
【權利要求】
1. 一種用于刀鱭不同生態型種群識別的分子標記，其特征在于，所述的分子標記為 SINE插入位點的特異引物，所述的特異引物為Locus 18位點、Locus 40位點或Locus 58 位點的引物的一種或者其組合，所述的引物序列分別為： Locus 18位點的上游引物如SEQ ID NO. 1所示， Locus 18位點的下游引物如SEQ ID NO. 2所示， Locus 40位點的上游引物如SEQ ID NO. 3所示， Locus 40位點的下游引物如SEQ ID NO. 4所示， Locus 58位點的上游引物如SEQ ID NO. 5所示， Locus 58位點的下游引物如SEQ ID NO. 6所示。
2. 根據權利要求1所述的分子標記的用途，其特征在于，所述的分子標記用于識別刀 鱭的不同種群。
3. 根據權利要求1所述的分子標記進行種群識別的方法，其特征在于，包括以下步驟： 運用所述的分子標記通過PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳、克隆、測序獲得SINE位點的種群特異 性的DNA片段，根據擴增片段數目、大小的差異性，識別出刀鱭的不同種群。
【文檔編號】C12N15/11GK104099423SQ201410355166
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月24日 優先權日:2014年7月24日
【發明者】劉 東, 朱國利, 唐文喬 申請人:上海海洋大學