專利名稱：一種鑒別q型煙粉虱單倍型的引物及鑒別方法
技術領域：
本發明涉及一種基于PCR-RFLP技術鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物及鑒別方法，屬于農業生物技術領域。
背景技術：
煙粉風Bemisia tabaci (Gennadius)是一種世界性農業害蟲。由于它寄主譜廣、暴發性強、危害性大，被世界自然保護聯盟(IUCN)列為世界最具有危害性的100個入侵種之一。同時，也是國際科技界有史以來唯一冠以“超級害蟲”稱謂的昆蟲。近年來，隨著煙粉虱傳播的雙生病毒-番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的擴散，煙粉虱的危害愈加嚴重，甚至導致江蘇、河南、山東等局部地區番茄絕產。煙粉虱含有多種生物型，其中B型與Q型是入侵性最強、分布最廣的2種生物型。近年來，許多學者認為B型煙粉虱與Q型煙粉虱分別是中 東-亞細亞I (MEAM1)、地中海(MED)隱蔽種。B型煙粉虱起源于中東-亞細亞地區，自上世紀80年代在美國等地區暴發以來，至少傳入51個國家。Q型煙粉虱起源于地中海地區，2003年首次在我國云南省發現其入侵，隨后相繼在10多個非地中海國家被發現；目前，許多國家多年來持續開展了 Q型煙粉虱的監測與控制研究。近來研究表明，Q型煙粉虱在2008年后已在全國廣大地區取代了 B型煙粉虱而成為了作物上煙粉虱的優勢種。當前在我國廣大地區危害的Q型煙粉虱，其原產地種群具有多個支系。基于mtCOI序列劃分的Ql與Q2支系其原產地分布區不同，Ql支系主要分布在地中海西部地區，而Q2支系則主要分布于地中海東部地區。盡管在10多個非地中海國家發現了 Q型煙粉虱的危害，但是入侵支系并非完全相同。例如，在我國目前為止僅有Ql支系的煙粉虱入侵危害；而傳入美國的Q型煙粉風則有Ql與Q2兩個支系。最新研究表明，基于mt COI序列中國的Ql支系煙粉虱主要分為單倍型I (Hapl)和單倍型2 (Hap2)，且Hapl為主要單倍型。傳統的鑒定Q型煙粉虱單倍型的方法是采用測序的方法，該方法不僅費吋，而且費用較高，不利于Q型煙粉虱的快速鑒定。不同單倍型的煙粉虱對寄主植物的危害程度不同，精確區分單倍型是有效防控Q型煙粉虱的前提和基礎，其對于Q型煙粉虱的綜合防控具有重要的理論意義和指導價值。PCR-RFLP(限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應)技術，又稱為CAPS技術(CleavedAmplilfed Polymorphism Sequences),其基本原理是先利用已知位點的DNA序列資源(基因數據庫、基因組或cDNA克隆及克隆的RAPD條帶等)設計ー套特異性的PCR引物(19 27bp)，然后用這些引物擴增該位點上的某一 DNA片段，接著用ー種專性的限制性內切酶切割所得擴增產物，凝膠電泳分離酶切片段，染色并進行RFLP分析。該技術掲示的是特異PCR片段的限制性長度變異的信息。PCR-RFLP是ー類共顯性分子標記，其優點是避免了 RFLP分析中膜轉印這ー步驟，又能保持RFLP分析的精確度-能夠掲示單個堿基的差異。另外，由于很多限制性內切酶均可與DNA擴增片段酶切，所以檢測到多態性機會較大。PCR-RFLP技術已經廣泛應用于植物、動物、微生物以及昆蟲的物種檢測與鑒定、遺傳分化鑒定等方面。但利用PCR-RFLP技術構建區分Q型煙粉虱單倍型的方法目前還未見報道。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物及方法。一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物，所述引物為ー對，分別為SEQ ID NO. I和SEQID NO. 2所示的核苷酸序列。正義引物Hap-F :5’ -CTGGTTYTTTGGTCATCCRGARGT-3’ ；SEQ ID NO. I反義引物Hap-R 5，-CAGGAAACAGCTATGACAATAAACCMTAAGATACCAA-TAGTCAATATAGCATAAATCAT-3，；SEQ ID NO. 2
一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的方法，步驟如下(I)提取Q型煙粉虱基因組DNA，得基因組DNA溶液；(2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，利用上述的ー對引物對基因組DNA中的線粒體COI基因進行PCR擴增，制得PCR擴增產物；(3)用限制性內切酶HinlII酶切步驟(2)制得的PCR擴增產物，得酶切產物；(4)對步驟(3)制得的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品有小于IOObp的一條條帶時，則該被檢測樣品為Q型煙粉虱單倍型I (Hapl)；當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品有大于IOObp的一條條帶吋，則為Q型煙粉虱單倍型2(Hap2)。優選的，所述步驟(2)中PCR擴增的擴增體系為基因組DNA 溶液 2· 5μ 1，20μΜ 引物 O. 5μ l，5U/y I Taq 酶 O. 25 μ 1，IOXTaqBuffer (緩沖液)2. 5 μ 1，IOmM dNTP O. 5 μ 1，ddH20 補至 25 μ I ；優選的，所述步驟(2)中PCR擴增的擴增條件如下94°C預變性5分鐘；94°C變性50秒，52°C退火40秒，72°C延伸50秒，進行35個循環；72°C延伸7分鐘。優選的，所述步驟(3)中限制內切酶HinlII酶切反應條件如下37°C酶切1_16小時。上述步驟(I)中提取Q型煙粉虱基因組DNA和步驟(4)中瓊脂糖凝膠電泳分析均按本領域常規技術操作。上述實驗步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實驗指南》第三版(北京科學出版社，2002)。有益效果I、本發明所述鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物能夠擴增Q型煙粉虱基因組DNA中的線粒體COI基因，為鑒定Q型煙粉虱鑒別單倍型I (Hapl)和單倍型2 (Hap2)提供了簡便穩定的分子標記，解決了區分單倍型Q型煙粉虱的難題。2、本發明所述的限制性內切酶為常用的限制性內切酶，為篩選兩種類型Q型煙粉虱提供了簡便穩定的酶切標記。3、本發明從分子水平探索了單倍型Q型煙粉虱線粒體COI基因的不同，探索建立了單倍型Q型煙粉虱的鑒別技術，為今后單倍型Q型煙粉虱的種群動態鑒定、生物學以及入侵機制的研究奠定了基礎。
圖I是實施例2中PCR產物經HinlII (NlaIII)酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中HapU Hap2分別上樣未酶切與酶切的樣品，M 100bp DNA Marker。圖2是實施例3中PCR產物經HinlII (NlaIII)酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中HapU Hap2分別上樣未酶切與酶切的樣品，M 100bp DNA Marker。圖3是實施例4中PCR產物經HinlII (NlaIII)酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中HapU Hap2分別上樣酶切的樣品，M100bp DNAMarker ；A :樣品采自山東省聊城市、B :樣品采自山東省德州市、C :樣品采自山東省棗莊市、D :樣品采自山東省臨沂市、E :樣品采自北京市、F :樣品采自上海市、G :樣品采自江蘇南京市、H :樣品采自江西南昌市。
具體實施方式
下面結合實例及附圖對本發明的內容做進ー步的說明，但本發明所保護范圍不限于此。實施例1、2中所述Q型煙粉虱于2011年采集于山東省濟南市；按照(De BarroP，Ahmed MZ,2011. Genetic Networking of the Bemisia tabaci Cryptic SpeciesComplex Reveals Pattern of Biological Invasions. PLoS ONE,6(10):e25579.doi:10. 1371/journal, pone. 0025579.)中記載的方法對上述Q型煙粉虱進行檢測，釆集于山東省濟南市的Q型煙粉虱分為單倍型I和單倍型2。實施例3中所述Q型煙粉虱于2011年采集于山東省壽光市；按照(De BarroP,Ahmed MZ,2011. Genetic Networking of the Bemisia tabaci Cryptic SpeciesComplex Reveals Pattern of Biological Invasions.PLoS ONE,6(10):e25579.doi:10. 1371/journal, pone. 0025579.)中記載的方法對上述Q型煙粉虱進行檢測，采集于山東省壽光市的Q型煙粉虱分為單倍型I和單倍型2。實施例4中所述Q型煙粉虱于2011年采集于中國多個地區A:山東省聊城市、B 山東省德州市、C :山東省棗莊市、D :山東省臨沂市、E :北京市、F :上海市、G :江蘇南京市、H :江西南昌市；按照(De Barro P, Ahmed MZ, 2011. Genetic Networking of the Bemisiatabaci Cryptic Species Complex Reveals Pattern of Biological Invasions. PLoSONE, 6 (10) : e25579. doi : 10. 1371/journal, pone. 0025579.)中記載的方法對上述 Q 型煙粉虱進行檢測，采集于以上各市的Q型煙粉虱均分為單倍型I和單倍型2。實施例所述HinlII內切酶購自Fermentas公司，Tris-HCl、こニ胺四こ酸、十二燒基硫酸鈉均購自上海生物工程公司，其它試劑均為普通市售產品。實施例I(I)Q型煙粉虱基因組DNA的提取將單頭Q型煙粉虱置于含60 μ I堿裂解液的0.2ml的離心管中，堿裂解液為50mmol ·じ1Tris-HCl (ρΗ8· 0)、20mmol ·じ1NaCl、lmmol ·じ1EDTA (こ ニ 胺四こ酸)、1%SDS(十二烷基硫酸鈉)，用封ロ槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，制得Q型煙粉虱基因組DNA溶液。(2) Q型煙粉虱COI基因的PCR擴增分別以Q型煙粉虱基因組DNA溶液和Q型煙粉虱單倍型2基因組DNA溶液為模板進行PCR擴增，制得PCR擴增產物；PCR擴增體系為Q 型煙粉虱基因組 DNA 溶液3μ I ;20μΜ 引物O. 5μ I ;5υ/μ I Taq 酶0. 5 μ I ;IOXTaq Buffer :5 μ I ；10mM dNTP :1 μ I ；ddH20 補至 50 μ I ;引物序列如下正義引物Hap-F :5’ -CTGGTTYTTTGGTCATCCRGARGT-3’ ；SEQ ID NO. I
反義引物Hap-R 5，-CAGGAAACAGCTATGACAATAAACCMTAAGATACCAA-
TAGTCAATATAGCATAAATCAT-3’ ；SEQ ID NO. 2PCR擴增條件如下94°C預變性5分鐘；94°C變性50秒，52°C退火40秒，72°C延伸50秒，進行35個循環；72°C延伸7分鐘。(3 )用2wt%瓊脂糖凝膠電泳對步驟(2 )制得的PCR擴增產物進行檢測，均檢測出一長度在150bp左右條帶(如圖I所示)，對該條帶進行雙向測序，Q型煙粉虱單倍型I得到的條帶序列如SEQ ID NO. 4所示，Q型煙粉虱單倍型2得到的條帶序列如SEQ ID NO. 3所
/Jn ο(4)利用限制性內切酶酶切位點分析軟件WatCut (該分析軟件可登陸如下網址使用 http://watcut. uwaterloo. ca/watcut/watcut/tempiate. php act=restriction new)，分析可得在片段88bp處兩種單倍型Q型煙粉虱有堿基差異，且Q型煙粉虱單倍型I得到的條帶在該處可被限制性內切酶HinlII酶切(酶切位點CATG)。實施例2一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的方法，步驟如下(I)將采集于山東省濟南市的單頭Q型煙粉虱個體置于含60 μ I堿裂解液的O. 2ml的離心管中，喊裂解液為:50mmol · L 1Tris-HCl (pH8. O) >20mmol · L 1NaCl、lmmol · L 1EDTA^1%SDS，用封ロ槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，得基因組DNA溶液；(2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，對基因組DNA中的線粒體COI基因進行PCR擴增，制得PCR擴增產物；PCR擴增體系為基因組DNA 溶液 2μ 1，20μΜ 引物 O. 5μ l,5U/y ITaq 酶 O. 25 μ I, IOXTaq Buffer2· 5 μ 1，IOmM dNTP O. 5 μ 1，ddH20 補至 25 μ I ；引物序列如下正義引物Hap-F :5，-CTGGTTYTTTGGTCATCCRGARGT-3，；SEQ ID NO. I反義引物Hap-R 5，-CAGGAAACAGCTATGACAATAAACCMTAAGATACCAA-TAGTCAATATAGCATAAATCAT-3’ ；SEQ ID NO. 2PCR擴增條件如下94°C預變性5分鐘；94°C變性50秒，52°C退火40秒，72°C延伸50秒，進行35個循環；72°C延伸7分鐘。(3)用限制性內切酶HinlII酶切步驟(2)制得的PCR擴增產物，得酶切產物；酶切體系如下10 X NEB緩沖液2μ I ;PCR擴增產物5 μ I ；HinlII內切酶O. 5μ I ；滅菌雙蒸水至15 μ I。反應條件如下37°C水浴2小時。
(4)用2wt%的瓊脂糖凝膠電泳分離步驟(3)制得的酶切產物，EB染色后在紫外凝膠成像儀上成像，觀察其多態性。結果顯示，成像膠片上有一條片段長度低于IOObp的條帯，該Q型煙粉虱為單倍型I ;成像膠片上有一條片段長度150bp左右的條帶吋，Q型煙粉風為單倍型 2,結果如圖 I 所不，與按照(De Barro P, Ahmed MZ, 2011. Genetic Networkingof the Bemisia tabaci しryptic Species しomplex Reveals Pattern of Biologica丄Invasions. PLoS ONE, 6 (10) :e25579. doi :10. 1371/journal, pone. 0025579.)中記載的方法進行檢測的結果一致。
實施例3如實施例2所述的鑒別Q型煙粉虱單倍型的方法，不同之處在干，所述Q型煙粉虱于2011年采集于山東省壽光市。結果顯示，成像膠片上有一條片段長度低于IOObp的條帶，該Q型煙粉虱為單倍型I ;成像膠片上有一條片段長度150bp左右的條帶吋，Q型煙粉虱為單倍型2，結果如圖2所不，與按照(De Barro P, Ahmed MZ, 2011. Genetic Networking of the Bemisia tabaciCryptic Species Complex Reveals Pattern of Biological Invasions. PLoS ONE,6(10) :e25579. doi :10. 1371/journal, pone. 0025579.)中記載的方法進行檢測的結果ー致。實施例4如實施例2所述的鑒別Q型煙粉虱單倍型的方法，不同之處在于，所述Q型煙粉虱于2011年采集于8個地區，分別為A :山東省聊城市、B :山東省德州市、C :山東省棗莊市、D :山東省臨沂市、E :北京市、F :上海市、G :江蘇南京市、H :江西南昌市。結果顯不，與按照(DeBarro P, Ahmed MZ, 2011. Genetic Networking of theBemisia tabaci Cryptic Species Complex Reveals Pattern of Bio丄ogic&l Invasions.PLoS ONE, 6 (10) :e25579. doi :10. 1371/journal, pone. 0025579.)中記載的方法進行檢測的結果一致，A、B、C、D、E、F、G、H中，Q型煙粉虱為單倍型I在成像膠片上為ー條片段長度低于IOObp的條帶；Q型煙粉虱為單倍型2在成像膠片上有一條片段長度150bp左右的條帶，結果如圖3所示。
權利要求
1.一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物，所述引物為一對，分別為SEQ ID NO. I和SEQ IDNO. 2所示的核苷酸序列。
2.一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的方法，其特征在于，步驟如下 (1)提取Q型煙粉虱基因組DNA，得基因組DNA溶液； (2)以步驟(I)制得的基因組DNA為模板，利用權利要求I所述的一對引物對基因組DNA中的線粒體COI基因進行PCR擴增，制得PCR擴增產物； (3)用限制性內切酶HinlII酶切步驟(2)制得的PCR擴增產物，得酶切產物； (4)對步驟(3)制得的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品有小于IOObp的一條條帶時，則該被檢測樣品為Q型煙粉虱單倍型I ;當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品有大于IOObp的一條條帶時，則為Q型煙粉虱單倍型2。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴增的擴增體系為 基因組 DNA 溶液 2. 5 ii l，20iiM 引物 0. l,5U/u I Taq 酶 0. 25 ii 1，IOXTaq 緩沖液2.5u I, IOmM dNTP 0. 5u I, ddH20 補至 25 u I ；
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴增的擴增條件如下 94°C預變性5分鐘；94°C變性50秒，52°C退火40秒，72°C延伸50秒，進行35個循環；72 °C延伸7分鐘。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中限制內切酶HinlII酶切反應條件如下37°C酶切1-16小時。
全文摘要
本發明涉及一種鑒別Q型煙粉虱單倍型的引物及鑒別方法，步驟如下(1)提取Q型煙粉虱基因組DNA；(2)以Q型煙粉虱基因組DNA為模板對其線粒體COI基因進行PCR擴增；(3)對步驟(2)制得的PCR產物用限制性內切酶Hin1II(N1aIII)酶切，得酶切產物；(4)對步驟(3)制得的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。本發明所述的限制性內切酶為常用的限制性內切酶，為篩選兩種單倍型的Q型煙粉虱提供了簡便穩定的酶切標記，同時探索建立了兩種單倍型的Q型煙粉虱的鑒別技術，為今后的兩種單倍型的Q型煙粉虱的種群動態鑒定、生物學以及入侵機制的研究奠定了基礎。
文檔編號C12N15/11GK102676680SQ201210169228
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月28日 優先權日2012年5月28日
發明者國棟, 杜蘭英, 褚棟, 陶云荔 申請人:青島農業大學