專利名稱：利用酵母表達系統生產菊糖果糖轉移酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種用于生產菊糖果糖轉移酶的酵母工程菌，本發明還涉及該工程菌的制備方法以及應用該工程菌生產菊糖果糖轉移酶的方法，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
*雙果糖酐III (Difructose anhydride, DFAIII)是一種新型的非還原性雙糖，在自然界中少量存在于菊苣、菊芋等植物中，少量出現于蜂蜜、咖啡等的加工過程中。其相對甜度為蔗糖的52%，而熱量值卻只有蔗糖的1/15(0. 263kcal/g);性質十分穩定，74%相對濕度下不吸濕，比蔗糖更難吸濕，具有取代傳統甜味劑蔗糖的潛能。雙果糖酐III對熱和酸十分穩定，在一般食品加工條件下，幾乎不會出現褐變或分解現象，能耐硬糖生產時的高溫熬煮而不褐變。同時，雙果糖酐III還具有良好的功能特性，如在消化道不吸收，且不產生能量，可作為一個甜味劑被用作減肥輔助治療；作為一種增歧因子，可促進腸道微生物的生長，明顯改善排便、利尿功能；作為促進礦物質元素吸收的功能性糖，可使得Ca、Mg、Zn、Cu等礦物質元素被人體吸收利用的程度大大提高，增進骨骼生長；在抗齲齒方面，其性質可與木糖醇、山梨醇相媲美，不被誘發蛀牙的口腔鏈球菌利用，也不產酸。這些優點使其在食品、保健、醫療領域中有廣闊的應用前景。然而，雙果糖酐III在自然界的含量極低，天然提取分離成本高，不適宜工業化生產的需求，而化學催化法有許多不利因素，例如形成許多副產物和化學污染物，而形成的許多副產物又使純化步驟變得復雜。而生物法制備雙果糖酐III的原料是菊糖，其來源廣泛，價格低廉，轉化率高，可達75%以上，屬于天然產品，符合消費者追求天然產品的消費心理，因此采用生物轉化技術生產雙果糖酐III成為研究的熱點。自1973年Uchiyama I首次從產脲節桿菌中發現菊糖果糖轉移酶(Inulinfructotransferase, IFTase, EC 2. 4. I. 93),用生物轉化法制備雙果糖酐III的研究已經有30余年的歷史，然而國內除本課題組篩得一株IFTase生產菌株并對其進行相關研究夕卜，國內仍無相關研究報道。國外關于菊糖果糖轉移酶的分子生物學研究始于1997年，Sakurai等人率先將ArtAroAacter sp. H65-7的菊糖果糖轉移酶基因轉入大腸桿菌中，得到了首個菊糖果糖轉移酶基因開放閱讀框，并將其酶活由初始野生菌的胞外80 U/mL提高到胞內酶活170 U/mL。迄今為止僅有5株菌實現了 IFTase的原核表達系統的活性表達，分別為 Arthrobacter sp. H65—7、Arthrobacter sp. A~6> Arthrobacter globiformisCll-I^ Arthrobacter sp.^ Bacillus 5/ . Snu_70 并且僅 A globiformis Cll-I菊糖果糖轉移酶在胞外有酶活檢出，且酶活很低(1.5 U/mL)文獻Haraguchi K，Mori S，Hayashi K. Cloning of inulin fructotransferase (DFA Ill-Producing) gene fromArthrobacter globiformis Cll-I [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering,2000，89: 590-595.，其他該酶原核表達幾乎都為胞內表達，這使IFTase酶的后期純化工藝較為繁瑣。同時，基因在原核表達中由于多為胞內表達，信號肽序列存在不能被有效識別并切割的問題，據推斷這也是該酶原核表達活性較低的原因之一。此外，大腸桿菌是原核生物，其表達過程常產生毒素，其安全性存在一定問題。
畢赤酵母基因表達系統經過近十年發展，已基本成為較完善的外源基因表達系統，具有易于高密度發酵，表達基因穩定整合在宿主基因組中，能使產物有效分泌，培養方便經濟等特點。與大腸桿菌相比能夠進行蛋白的翻譯后修飾加工，包括信號肽加工、蛋白質折、二硫鍵形成、糖基化修飾等，可有效解決一些蛋白原核表達信號肽識別問題及胞內包涵體形成問題，并在一定程度上能增加酶的穩定性，也具有更高的安全性。目前，美國FDA已能評價來自該系統的基因工程產品，最近來自該系統的Gphelon制劑已獲得FDA批準，所以該系統被認為是安全的。同時，畢赤酵母表達系統可以采用基礎培養基發酵，僅提供酵母生長所需營養即可高密度發酵，細胞干重可達100 g/L。此外，酵母細胞自身分泌的蛋白很少，可有效簡化分離純化工藝。本發明首次實現了菊糖果糖轉移酶基因在酵母中的分泌表達，獲得能發酵生產具有較高安全性及生物活性的菊糖果糖轉移酶的工程菌，具有重要的理論意義，為國內外菊糖果糖轉移酶的真核表達進行了成功初探。同時本發明也具有實際應用價值，為菊糖果糖轉移酶及功能性甜味劑DFA III工業化生產提供理論依據及應用潛力，也為功能性甜味劑的開發和研究提供廣闊空間。
發明內容
本發明的目的是提供構建菊糖果糖轉移酶酵母工程菌的方法。本發明的技術方案一種利用酵母表達系統生產菊糖果糖轉移酶的方法，步驟為
(1)以金黃節桿菌ClrtAroAacteraurescens)SW,. 001為出發菌株,PCR法獲得菊糖果糖轉移酶基因，通過雙酶切構建重組載體X-IFTase ；
所述重組載體 X-IFTase 為pPIC9K - IFTase、pPIC9 - IFTase、pPICZaA/B/C-IFTase 或 pGAPZaA/B/C - IFTase ；
(2)將重組載體X-IFTase經線性化后轉化入畢赤酵母感受態細胞，并篩選鑒定陽性轉化子，即構建得到產菊糖果糖轉移酶酵母工程菌；
所述畢赤酵母菌株是GS115、X-33、KM71或SMD1168 ；
(3)工程菌液體發酵生產活性菊糖果糖轉移酶。將菊糖果糖轉移酶酵母工程菌經甲醇誘導表達，發酵上清液與菊糖進行反應HPLC法檢測雙果糖酐III生成情況以進行菊糖果糖轉移酶活性鑒定，表明獲得的酵母工程菌具有分泌生產具有活性的菊糖果糖轉移酶的能力；
重組菌單菌落接種于BMGY培養基28-30°C、280 rpm培養至0D_=2_6，離心收集菌體用BMMY培養基重懸菌體使0D_=1左右，雙層紗布封口 30°C、280 rpm搖瓶發酵，每24h向培養基添加100%甲醇至終濃度為0. 5%-1. 0%。獲得的4 mg/mL G418-YPD陽性重組菌株60h發酵液產活性菊糖果糖轉移酶粗酶活為 10. 3U/mL。步驟(I)中所述菊糖果糖轉移酶基因為菊糖果糖轉移酶全基因或根據酵母密碼子偏好性改造的菊糖果糖轉移酶基因。步驟(2)中所述重組載體線性化利用Sac I或Sal I進行酶切。
步驟(2)中所述轉化畢赤酵母菌株細胞的方法采用電擊轉化或化學轉化。步驟(3)中所述工程菌液體發酵培養基是BMGY/BMMY、BMG/BMM或YPD。從金黃節桿菌ClrtAroAacterSK8. 001提取菊糖果糖轉移酶基因組DNA，用特異性引物PCR的方法擴增獲得不包含信號肽部分的菊糖果糖轉移酶基因，將該基因以EcoRl和I作為酶切位點構建表達載體，重組載體經過雙酶切及基因測序鑒定，轉化入酵母感受態細胞，通過組氨酸缺陷及抗性篩選及PCR驗證獲得陽性克隆，然后，利用甲醇誘導分泌表達菊糖果糖轉移酶，從而實現菊糖為新型功能性甜味劑雙果糖酐III的酶法制備，具有較好的工業化生產前景。該金黃節桿HArthrobacter aurescens) SK8. 001 在中國專利200810196709.8 “一株產菊糖果糖轉移酶的菌株和用該酶生產雙果糖酐III的方法”中進行了保藏和公開，保藏編號為CCTCC NO M 208120。本發明的有益效果本發明實現了菊糖果糖轉移酶的酵母分泌表達，獲得具有活 性的菊糖果糖轉移酶，對于新型功能性甜味劑雙果糖酐III的酶法工業化生產具有廣泛的應用前景和意義。
圖I重組質粒pPPIC9K_IFTase的構建示意圖。用于酵母生產IFTase的PPIC9K-IFTase表達載體圖
圖2重組酵母誘導表達粗酶液SDS-PAGE。酵母重組菌經甲醇誘導各時間點的上清SDS-PAGE 圖。圖3重組菌IFTase粗酶活性檢測的HPLC圖譜。HPLC法檢測重組菌IFTase粗酶活性(a)雙果糖酐III標準品的HPLC圖譜；(b)重組酵母發酵上清液與菊糖反應后的HPLC圖譜。圖4重組菌生產菊糖果糖轉移酶發酵上清液酶活及菌體生長情況。
具體實施例方式
實施例I目的基因ift的獲得(菌落PCR法)
模板的制備取一環金黃色節桿菌ArtAroAacter aurescens SK8. 001單菌落,溶于IOOii L滅菌水中，將菌懸液-20°C冷凍lOmin，再沸水浴lOmin，室溫靜置。取上清液3 ii L作為目的基因PCR模板，以包含I和I酶切位點的下列核苷酸序列作為引物，經PCR擴增得到不含信號肽序列的菊糖果糖轉移酶DNA片段，S卩i/匕基因擴增引物
上游引物 Pl :5’ -CCGGAAITCGCCGAAGGCGCGAAGG-3’，
下游引物 P2 :5’ -ATAAGAATGCGGCCGCTCAGGGCGTGGGCCGA-3’，ift基因擴增體系(50 u L)
ddHaO|22 U L
模士_3u L
50uM上游引物TTI~
50tiM下游引物 IuL PremixTaiy 酶 23 y LPCR反應條件94°C預變性5min ;94°C變性lmin，60°C退火lmin，72°C延伸90s，進行35個循環；最后72°C延伸lOmin。即以金黃節桿菌Cl rtAroAacterSK8. OOl為出發菌株，PCR法獲得目的基因i/纟，其含有1233 bp，編碼有410個氨基酸的序列，核苷酸序列為SEQ ID NO :1。實施例2重組載體pPIC9K_IFTase的構建
I、構建pPIC9K-IFTase重組載體將實施例I的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳后進行DNA回收，對回收產物經限制性內切酶I和I進行雙酶切，與經過同樣雙酶切的質粒pPIC9K在T4連接酶的作用下過夜連接，實現重組載體pPIC9K-IFTase的初步構建。2、DH5 a感受態細胞的制備挑取大腸桿菌DH5 a單菌落于LB液體培養基，37°C、200 rpm過夜培養，按3%接種量接種到新的IOOmL LB培養基37°C、200 rpm振蕩培養，約Ih后間斷取樣，使OD6tltl=O. 35-0. 4。培養物冰上冷卻lh，離心棄去上清，沉淀分別用冰預冷的IOOmM MgCl2及IOOmM CaCl2懸浮洗滌細胞，最終用85mM CaCl2 (溶于15%甘油)重懸細胞，分裝獲得DH5a感受態細胞，_80°C冷凍保存備用。3、重組載體pPIC9K- IFTase轉化至DH5 a中將過夜連接后的重組載體pPIC9K_IFTase轉化入DH5 a感受態細胞中，涂布含有50 U g/ mL氨芐霉素抗性的LB固體培養基，37°C培養18-24h初步獲得陽性克隆。4、重組載體的雙酶切驗證經抗性培養基篩選得到陽性克隆分別挑取初步陽性克隆于含有50 U g/mL氨芐抗生素的LB液體培養基中，37°C、200 rpm培養過夜，提取質粒，經限制性內切酶I和I雙酶切質粒，根據電泳后的雙酶切結果初步判斷陽性克隆。5、對初步獲得的重組載體pPIC9K-IFTase進行基因測序，結果表明pPC9K插入片段為一個含有1233 bp，編碼有410個氨基酸的序列，成功構建重組載體pPIC9K-IFTase，其含有10503 bp，核苷酸序列為SEQ ID NO :2。實施例3菊糖果糖轉移酶畢赤酵母重組菌篩選
I、畢赤酵母GS115感受態細胞的制備挑取GSl 15酵母單菌落于YH)液體培養基30°C、200 rpm過夜培養，按1%接種量擴大培養至0D_=1. 3-1. 5，分別用冰預冷的滅菌水及IM山梨醇溶液洗滌，最終以IM山梨醇分裝獲得畢赤酵母GS115感受態細胞。2、重組載體pPIC9K_IFTase電轉化入畢赤酵母GSl 15感受態細胞將pPIC9K-IFTase質粒經I線性化后電轉化入畢赤酵母GSl 15感受態細胞(電轉化條件電壓1500 V，電容25 U F，電阻200歐，轉化時間4-10 msec)，涂布于MD平板，30°C培養2d至出現單菌落，以His缺陷型進行初步篩選可能的陽性重組菌。3、G418梯度抗性重組菌篩選將MD平板培養獲得的可能陽性重組菌點接種于G418 10個濃度梯度的YH)平板獲得不同拷貝數的pPIC9K-IFTase畢赤酵母重組菌，每個遺傳霉素濃度為 0,0. 25,0. 5,0. 75,1. 0,1. 5,1. 75,2. 0,3. 0,4. O mg/mL，30°C培養 2d 至出現
單菌落。4、菌落PCR法鑒定重組酵母將經過G418抗性篩選的假定重組菌經過Lyticase酶消化、_20°C冷凍及室溫化凍，菌體上清作為待PCR鑒定重組菌的模板，以通用引物5’AOX和3’ AOX為上下游引物進行菌落PCR，結果經瓊脂糖凝膠電泳鑒定獲得陽性菊糖果糖轉移酶畢赤酵母重組菌。
PCR 鑒定體系(20 ii L)
ddHa0|8ti L '
模士_I- 2u L
50 u M5’AOX 上游引物 ~07T7l50 Ii M3’AOX 下游引物一 0. 4ti L :
PremixTaiy 酶IOyL
PCR反應條件94°C預變性5min ;94°C變性Imin，53°C退火Imin，72°C延伸90s，進行35
個循環；最后72°C延伸lOmin。
實施例4重組菌的誘導表達及活性檢測
將實施例3獲得的重組菌單菌落接種于BMGY培養基30°C、280 rpm培養至0D_=2_6，離心收集菌體用BMMY培養基重懸菌體使0D_=1左右，雙層紗布封口 30°C、280 rpm搖瓶發酵，每24h向培養基添加100%甲醇至終濃度為0. 5%-1. 0%。不同時間收集菌體，進行SDS-PAGE鑒定蛋白及HPLC法酶活性測定。在未實行培養條件優化及合適拷貝篩選條件下，獲得的4mg/mL G418-YPD陽性重組菌株發酵液粗酶活60h為10. 3U/mL。菊糖果糖轉移酶活力定義在60°C、pH5. 5條件下每分鐘產1.0 PM雙果糖酐III所需的酶量為I個酶活力單位(U)。
權利要求
1.一種利用酵母表達系統生產菊糖果糖轉移酶的方法，其特征在于步驟為 (1)以金黃節桿菌ClrtAroAacteraurescens)SW,. 001為出發菌株,PCR法獲得菊糖果糖轉移酶基因，通過雙酶切構建重組載體X-IFTase ； 所述重組載體 X-IFTase 為pPIC9K - IFTase、pPIC9 - IFTase、pPICZaA/B/C-IFTase 或 pGAPZaA/B/C - IFTase ； (2)將重組載體X-IFTase經線性化后轉化入畢赤酵母感受態細胞，并篩選鑒定陽性轉化子，即構建得到產菊糖果糖轉移酶酵母工程菌； 所述畢赤酵母菌株是GS115、X-33、KM71或SMD1168 ； (3)工程菌液體發酵生產活性菊糖果糖轉移酶 將菊糖果糖轉移酶酵母工程菌經甲醇誘導表達，發酵上清液與菊糖進行反應HPLC法 檢測雙果糖酐III生成情況以進行菊糖果糖轉移酶活性鑒定，表明獲得的酵母工程菌具有分泌生產具有活性的菊糖果糖轉移酶的能力； 重組菌單菌落接種于BMGY培養基28-30°C、280 rpm培養至0D_=2_6，離心收集菌體用BMMY培養基重懸菌體控制使0D_=1，雙層紗布封口 30°C、280 rpm搖瓶發酵，每24h向培養基添加100%甲醇至終濃度為0. 5%-1. 0% ； 獲得的4 mg/mL G418-YPD陽性重組菌株60h發酵液產活性菊糖果糖轉移酶粗酶活為10.3U/mL。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(I)中所述菊糖果糖轉移酶基因為菊糖果糖轉移酶全基因或根據酵母密碼子偏好性改造的菊糖果糖轉移酶基因。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述重組載體線性化利用SacI或Sal I進行酶切。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(2)中所述轉化畢赤酵母菌株細胞的方法采用電擊轉化或化學轉化。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(3)中所述工程菌液體發酵培養基是BMGY/BMMY、BMG/BMM 或 YPD。
全文摘要
利用酵母表達系統生產菊糖果糖轉移酶的方法，屬于基因工程技術領域。本發明步驟包括(1)菊糖果糖轉移酶基因(ift)的克隆，通過雙酶切構建重組載體X-IFTase；(2)重組載體X-IFTase轉化入畢赤酵母感受態細胞，營養缺陷型篩選及抗生素抗性篩選陽性轉化子，即得產菊糖果糖轉移酶酵母工程菌；(3)工程菌液體發酵分泌生產活性菊糖果糖轉移酶。本發明實現了菊糖果糖轉移酶的酵母分泌表達，獲得具有活性的菊糖果糖轉移酶，對于新型功能性甜味劑雙果糖酐III的酶法工業化生產具有廣泛的應用前景和意義。
文檔編號C12N9/10GK102653739SQ201210187069
公開日2012年9月5日 申請日期2012年6月8日 優先權日2012年6月8日
發明者戰榮榮, 江波, 沐萬孟 申請人:江南大學